WO2002068952A1 - Procede d'analyse du polymere a l'aide d'une technique d'abrasion au laser et systeme d'analyse - Google Patents

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Description

明 細 レ—ザ—アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法およびそのシステム 技術分野
本発明は、 レーザ一アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法およびそのシス テムに関し、 さらに詳細には、 従来と比較すると分析の効率を著しく向上するこ とを可能にしたレーザ一アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法およびそのシ ステムに関し、 例えば、 D NA、 蛋白質、 R NA、 P NA、 脂質、 糖などの各種 の高分子の質量分析に用いて好適なレ一ザ一アブレーシヨンを用いた高分子の分 析方法およびそのシステムに関する。 背景技術
近年、 質量分析法の応用範囲は、 物理や化学の分野から医学や生化学などのラ ィフサイエンスの分野へと急速に広がってきている。 特に、 蛋白質の分子量の決 定解析ゃァミノ酸配列の決定解析などへの発展には、 目を見張るものがある。 こうした質量分析法の原理は、 試料を様々な方法でイオン化して、 イオン化に より得られたイオンを質量/電荷に従って分離し、 分離した各イオンの強度を測 定するというものである。 ところで、 従来の高分子の質量分析は、 高分子そのものに電子を付加してィォ ンィ匕し、 その質量を解析したり、 高分子量の分子を低分子量の分子イオンに細分 化して質量分析を行い、 構成分子を比較するというものであった。 ここで、 従来の高分子の質量分析におけるイオン生成方法としては、 例えば、 高分子に高エネルギー原子イオンを衝突させてイオン化する 2次イオン質量分析 ( S I M S ) 法や、 電子衝撃によって低分子量の分子イオンに細分ィ匕して質量分 析を行う電子イオン化 （E D ) 法、 マトリックス支援レーザ一イオン化 （MA L D I ) 法などが知られている。
しかしながら、 上記したいずれの方法においても、 高分子イオンを質量分析す るため高分解能の質量分析装置が必要であるという問題点や、 中途半端に分解生 成したフラグメントイオンの存在が質量スベクトルの解析を困難にするという問 題点などがあった。 一方、 従来より、 化学分析に際して同位元素で標識した高分子試料の質量分析 方法としては、 例えば、 ナノ秒レーザーにより原子化およびイオン化を行うレー ザ一原子化共鳴イオン化 （L AR I MP ) 法が知られている。
しかしながら、 この L AR I MP法によれば、 レ一ザ一として、 標識元素を原 子化するための原子化レーザ一と原子化された標識元素の原子をイオン化するた めの共鳴ィォン化レ一ザ一との 2台のレーザ一が必要となるため、 システム構成 が複雑になるという問題点があつた。
さらに、 L AR I MP法においては、 上記したように標識原子を共鳴イオン化 する必要がある。 このため、 各標識原子に対して固有の波長のレーザ一光を照射 する必要があり、 多種類の標識同位体が混入した状況では効率の良い分析を行う ことが極めて困難であるという問題点があった。 本発明は、 上記したような従来の技術の有する種々の問題点に鑑みてなされた ものであり、 その目的とするところは、 高分子を構成する構成原子の原子イオン を生成し、 生成した原子ィオンを分析するようにしたレ一ザ一アブレ一シヨンを 用いた高分子の分析方法およびそのシステムであって、 高分解能の分析装置を要 しないようにしたレ一ザ一ァブレーシヨンを用いた高分子の質量分析方法および そのシステムを提供しょうとするものである。 より詳細には、 例えば、 質量分析 を行う場合には、 質量スぺクトルの角军析が困難になる恐れを排除するとともに、 質量分析装置に高分解能を要しないようにしたレーザ一アブレーシヨンを用いた 高分子の質量分析方法およびそのシステムを提供しょうとするものである。 また、 本発明の目的とするところは、 高分子を構成する構成原子の原子化とィ オン化とを 1台のレ一ザ一で同時に実現することを可能にして、 システム構成を 大幅に簡潔化することを可能にしたレーザーァプレーシヨンを用いた高分子の分 析方法およびそのシステムを提供しょうとするものである。
さらに、 本発明の目的とするところは、 多種類の標識同位体が混入した状況に おいても、 効率の良い分析を行うことを可能にしたレーザ一アブレ一シヨンを用 レ、た高分子の分析方法およびそのシステムを提供しょうとするものである。 発明の開示
上記目的を達成するために、 本発明は、 例えば、 D NA、 蛋白質、 R NA P NA、 脂質、 糖などの各種の高分子を超短パルスレーザー光でアブレ一シヨンす ることにより、 それら高分子を原子イオン化して原子イオンを生成し、 生成した 原子イオンを分析するようにしたものである。 これにより、 各種の高分子の化学 分析を行うことができるものである。
即ち、 本発明によれば、 高分子を超短パルスレーザ一光でアブレ一シヨンする ことにより、 高分子をバラバラに分解して当該高分子を構成する各原子毎に原子 化すると同時に、 原子ィ匕した原子を 1価のイオンにイオン化するものであり、 こ のイオン化により生成された原子イオンを分析することにより、 定量分析が可能 となるものである。
従って、 本発明において質量分析を行う場合には、 低質量の原子イオンを質量 分析することになり、 質量スぺクトルの解析が困難になる恐れがなくなるのみな らず、 質量分析装置が高分解能を備える必要がなくなる。
また、 上記したように、 本発明によれば、 超短パルスレーザー光で高分子をァ ブレーシヨンすることにより、 高分子の原子化と同時に、 原子化された原子の一 価のイオンへのイオン化を効率良く行うことが可能となる。 従って、 システム構 成を簡潔化することができるようになるとともに、 例えば、 化学分析に際して多 種類の標識元素を同時に使用することが可能となるため、 解析効率を著しく向上 させることができる。
つまり、 本発明においては、 標識元素の原子化とイオン化とを 1台の超短パル スレーザ—で同時に行うことができるため、 システム構成を大幅に簡略化するこ とが可能となる。
さらに、 上記したイオン化は、 超短パルスレーザ一光の高い尖頭値強度によつ て非共鳴過程によって行われるイオン化 （非共鳴イオン化） であるので、 多種類 の標識同位体が混入した状況においても各標識原子をそれぞれイオン化すること ができ、 多標識系への応用が容易であり、 高精度かつ高効率な高分子の分析を行 うことができるようになる。
このため、 本発明は、 今後ますます重要性を増す遺伝子発現量の定量解析など に用いて極めて好適である。
即ち、 本発明は、 分析の対象である高分子にレーザー光を照射して該高分子を アブレーシヨンすることにより、 高分子を構成元素に原子化し、 原子化した構成 元素をイオン化し、 ィォン化した構成元素を分析するレ一ザ一アブレーシヨンを 用いた高分子の分析方法であって、 分析の対象である高分子に照射して、 該高分 子をアブレ一シヨンするレーザー光は超短パルスレ一ザ一光であり、 該超短パル スレ—ザ一光を分析の対象である高分子に照射して、 該高分子をアブレ—シヨン することによって、 該高分子を構成元素に原子化すると同時にイオン化し、 ィォ ンィ匕した構成元素を分析するようにしたものである。
ここで、 上記分析としては、 例えば、 質量分析を挙げることができるが、 質量 分析以外の分析としては、 具体的には、 例えば、 化学的分析 （通常のいわゆる化 学分析） や光学的分析 （蛍光法など） が挙げられる。
また、 本発明においては、 分析の対象である高分子は、 固相化されたものであ るようにしてもよい。
また、 本発明においては、 高分子の固相化の方法は、 基板上に分析の対象であ る高分子の溶液を滴下して乾燥することにより固相化する過程を含む方法である ようにしてもよい。
また、 本発明においては、 上記基板は固体であり、 該固体の熱伝導率は 0 . 1 W · πΓ 1 · K 1以上であるようにしてもよい。
また、 本発明においては、 分析の対象である高分子は、 元素標識を付けたもの としてもよい。
また、 本発明においては、 上記元素標識は、 周期律表において 1族元素として もよい。
また、 本発明においては、 上記元素標識は、 周期律表において 1 6族元素とし てもよい。
また、 本発明においては、 上記元素標識は、 周期律表において 1 7族元素とし てもよい。
また、 本発明においては、 上記元素標識は、 周期律表において遷移金属元素と してもよい。
また、 本発明においては、 上記元素標識は、 安定同位元素標識であるようにし てもよい。
また、 本発明においては、 分析の対象である高分子に照射して、 該高分子をァ プレーシヨンする超短パルスレーザ一光は、 パルス時間幅が 1 0ピコ秒以下であ り、 尖頭値出力が 1 0メガヮット以上であるようにしてもよい。
また、 本発明においては、 分析の対象である高分子に照射して、 該高分子をァ プレ一シヨンする超短パルスレ一ザ一光は、 パルス時間幅が 1フェムト秒以上 1 ピコ秒以下であり、 尖頭値出力が 1ギガワ ト以上 1 0ギガヮット以下であるよ うにしてもよい。
また、 本発明においては、 上記イオン化した構成元素の分析は、 質量分析であ るようにしてもよい。
また、 本発明においては、 質量分析は、 飛行時間法による質量分析であるよう にしてもよい。
また、 本発明においては、 イオン化した複数の構成元素を同時に分析するよう にしてもよい。
また、 本発明においては、 分析の対象である高分子は、 D NAマイクロアレイ に定着された核酸または核酸の類似体であるようにしてもよい。
なお、 核酸または核酸の類似体としては、 具体的には、 例えば、 D N A R N A P N Aが挙げられる。
また、 本発明においては、 上記 D NAマイクロアレイは、 多チャンネル化した D N Aマイクロアレイであるようにしてもよい。 また、 本発明においては、 高分子をアブレーシヨンする短パルスレーザー光と 分析の対象である高分子とは、 少なくともいずれか一方を移動させることにより、 該高分子をアブレ一シヨンする短パルスレーザー光により該分析の対象である高 分子を遺漏、 重複なくアブレ一ションして分析を行うようにしてもよい。
また、 本発明は、 分析の対象である高分子にレーザー光を照射して該高分子を アブレ一シヨンすることにより、 高分子を構成元素に原子化し、 原子化した構成 元素をイオン化し、 イオン化した構成元素を分析するレーザ一アブレ一シヨンを 用いた高分子の分析システムであって、 内部に夕一ゲットを配置可能な真空槽と、 上記真空槽内に配置された分析器と、 超短パルスレーザー光を出射して上記真空 槽内に配置された夕ーゲットへ照射する超短パルスレーザ一とを有するようにし たものである。
また、 本発明においては、 さらに、 上記真空槽内において夕一ゲヅトを移動す る移動手段とを有するようにしてもよい。
また、 本発明においては、 上記ターゲットを移動する移動手段は、 ターゲット を回転する回転手段であるようにしてもよい。
また、 本発明においては、 さらに、 超短パルスレーザ一光の夕一ゲヅトへの照 射位置を移動する移動手段とを有するようにしてもよい。
また、 本発明においては、 上記分析器は、 質量分析器であるようにしてもよい。 また、 本発明においては、 上記質量分析器は、 四重極質量分析器であるように してもよい。
また、 本発明においては、 上記質量分析器は、 飛行時間質量分析器であるよう にしてもよい。
また、 本発明においては、 上記質量分析器は、 イオンサイクロトロン型フ一リ ェ変換質量分析器であるようにしてもよい。 また、 本発明においては、 上記超短パルスレーザーは、 パルス時間幅が 1 0ピ コ秒以下であり、 尖頭値出力が 1 0メガヮヅト以上である短パルスレーザー光を 照射するようにしてもよい。
また、 本発明においては、 上言 3超短パルスレーザ一は、 パルス時間幅が 1フエ ムト秒以上 1ピコ秒以下であり、 尖頭値出力が 1ギガヮット以上 1 0ギガヮット 以下である短パルスレーザ一光を照射するようにしてもよい。 ここで、 本発明において超短パルスレーザ一光により高分子をアブレーシヨン する際には、 高分子に超短パルスレーザ一光を 1ショット （1パルス）照射すれ ば十分である。 しかしながら、 高分子に超短パルスレ一ザ一光を複数ショット (複数パルス） 照射してもよく、 高分子への照射する超短パルスレーザー光のシ ョヅト数 （パルス数） は適宜に選択すればよい。
また、 超短パルスレーザ一とは、 パルス時間幅が 1 0ピコ秒以下であることが 好ましく、 特に、 1フェムト秒以上 1ピコ秒以下の通常はフェムト秒レーザ一と 称されるレ一ザ一を用いるのが適当である。 その尖頭値出力としては、 1 0メガ ヮヅト以上が好ましく、 特に、 1ギガヮヅト以上 1 0ギガワヅト以下が好ましい。 この範囲以上に大きいと多価イオンが生成されて、 質量スぺクトルの解析が困 難となり、 これ以下だと原子化 'イオン化の効率が低下して、 原子イオン信号を 観測することができないからである。
なお、 後述する発明者による実験によれば、 例えば、 パルス時間幅が 1 1 0フ ェムト秒、 尖頭値出力 2ギガワットの場合には、 極めて良好な結果を得ることが できた。 また、 本発明によれば、 原子化と同時にイオン化を効率良く行うことのできる フエムト秒レ一ザ一光などの超短パルスレーザ一光を、 同位元素で標識した高分 子試料に照射するようにしている。 このため、 標識元素を選択的にイオン化する 必要が無くなり、 種々様々な標識元素を使用することが可能となる。 その上、 レ 一ザ一照射の繰り返しレートを数 k H zまで上げることが可能であるため、 高速 解析に適している。 また、 本発明では、 高分子をアブレ一シヨンする短パルスレ一ザ一光と分析の 対象である高分子とは、 少なくともいずれか一方を移動させることにより、 該高 分子をアブレーシヨンする短パルスレ一ザ一光により該分析の対象である高分子 を遺漏、 重複なくアブレ一シヨンして分析を行うようにしている。 即ち、 本発明 においては、 例えば、 短パルスレ一ザ一光のスポットと試料として分析の対象で ある高分子を塗布した基板との移動により、 広い面積にわたつて塗布された多数 の試料を遺漏 '重複することなくアブレ一シヨンすることを可能にしている。 こ れは、 D NAマイクロアレイへの応用において、 特に有効である。 本発明は、 これらの特徴から、 解析速度が従来と比較して格段に早くなるばか りか、 発現量の極めて少ない遺伝子の発現の同時解析を行うことを可能にするも のである。 そして、 本発明の具体的な応用例としては、 例えば、 D N Aマイクロアレイを 用いた遺伝子発現解析があり、 その解析を高速化することが可能となる。 即ち、 本発明によれば標識として多種類の同位元素を用いることが可能となり、 標識と して、 例えば、 安定同位元素を用いれば、 標識の種類は多種類の安定同位体の数 ( 2 7 0種類） にも増やすことができる。 これは、 従来の標識法である蛍光法 (2〜6種類） や放射性同位元素 （約 10種類） と比較して、 飛躍的に情報量を 増やすことができる。
より詳細には、 DNAマイクロアレイ実験で用いる標識として、 例えば、 周期 律表において 1族の安定同位体である3 SK、 41Kなど、 周期律表において 16族 の安定同位体である32 S、 35Sなど、 周期律表において 17族の安定同位体であ る35 Cl、 37C1など、 周期律表において遷移金属の安定同位体である118 Sn、 12Q S nなどの安定同位元素を含むヌクレオチドでプローブを標識して使う。 プローブを DNAマイクロアレイ上の夕一ゲヅト核酸とハイプリダイゼ一ショ ンさせたのち、 超短パルスレーザ一でアブレーシヨンし、 分子の原子イオン化を 行い、 その後に、 例えば、 質量分析器で検出すれば、 ハイブリダィゼ一シヨンし たプロ一プ内に含まれていた同位元素の量を定量できる。従って、 プローブの量 比を計算して求めることができる。
ここで、 従来の DNAマイクロアレイ技術においては、 蛍光色素でプロ一ブを 標識していた。 こうした従来の方法では、 ハイブリダィゼ一シヨン後の検出に、 専用検出装置を用いて 10分間程度の時間を要していた。 しかしながら、 本発明 を用いれば、 高速化を図ることができる。
また、 現在利用されている蛍光色素はわずか 2種 （Cy— 3, Cy-5) だけ であり、 急速な増加は見込めないのが現状である。 それに対して、 例えば、 安定 同位元素を使えば、 標識の種類を 270種にも増やすことができる。
また、 DN Aマイクロアレイの遺伝子の発現デ一夕は、 参照用サンプルに対す る相対値として得られる。 つまり、 2種の蛍光ラベルしか利用できない従来の D N Aマイクロアレイ実験では、 多数の試料のデ一夕を実験間で比較することが難 しい。 しかしながら、 別々の元素でラベルした 3種類以上の複数のプローブを混合し、 同時に夕ーゲヅトとハイブリダィゼ一シヨンさせ、 本発明によるレーザ一アブレ —シヨンを用いた高分子の分析方法で計測する多チャンネル化した DNAマイク ロアレイを用いると、 複数試料間のデータを比較することができる。
このように、 本発明によって、 多種類の安定同位元素標識による高感度 ·高速 質量分析法を確立することができるものであり、 従って、 本発明は、 蛍光色素や 放射性同位元素で標識を行つている全ての研究分野へ応用可能である。
また、 本発明によれば、 標識元素に放射性同位元素を用いることなく、 安定同 位元素を用いることができるので、 その場合には使用される施設に制限を受けな いため、 医療施設や民間企業への設置も可能となり、 その波及効果は計り知れな いものがある。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明によるレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法を実 施するための高分子の分析システムの一例たる質量分析システムの構成の一例の 概念構成説明図である。
図 2は、 実験に用いた 2種類のサンプル （サンプル 1およびサンプル 2) の仕 様を示す図表である。
図 3 (a) (b) (c) は、 四重極質量分析器によって測定されたサンプル 1 の質量スペクトラムである。 図 3 (a) は短パルスレーザ一光の出力を 230〃 Jとした場合を示し、 図 3 (b) は短パルスレーザ一光の出力を 53 Jとした 場合を示し、 図 3 (c) は短パルスレーザ一光の出力を 480 / Jとした場合を 示す。 なお、 図 3 (c) の測定に関しては、 四重極質量分析器の感度を図 3 (a) ならびに図 3 (b) の測定の場合よりも二桁下げて測定した。 図 4は、 超短パルスレーザー光の照射によってサンプル 1が剥ぎ取られた夕一 ゲットの状態を顕微鏡で観察した状態を示す図面である。
図 5は、 夕一ゲットに形成された傷の深さと面積とを測定した結果を示す説明 図である。
図 6は、 四重極質量分析器によって測定されたサンプル 2の質量スぺクトラム である。
図 7は、 四重極質量分析器によって測定されたサンプル 3の質量スペクトラム である。
図 8は、 四重極質量分析器によって測定されたサンプル 4の質量スペクトラム である。
符号の説明
1 0 質量分析システム
1 2 真空槽
1 4 夕—ゲット
1 6 四重極質量分析器
1 8 回転導入端子
2 0 超短パルスレーザ一
2 2 フォーカスレンズ 発明を実施するための最良の形態
以下、 添付の図面を参照しながら、 本発明によるレーザ一アブレ一シヨンを用 いた高分子の分析方法およびそのシステムの実施の形態の一例を詳細に説明する ものとする。 図 1には、 本発明によるレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法を 実施するための高分子の分析システムの一例として、 質量分析システムの構成の 一例の概念構成説明図が示されている。
この質量分析システム 1 0は、 1 0— 8〜1 0— 6 T o r rの真空度に設定可能な 真空槽 1 2と、 この真空槽 1 2内に配置された夕一ゲヅト 1 4と、 真空槽 1 2内 に配置された四重極質量分析器 1 6と、 夕ーゲット 1 4を回転する回転導入端子 1 8と、 超短パルスレーザ一光を出射して夕一ゲット 1 4へ照射する超短パルス レ一ザ一 2 0と、 超短パルスレーザー 2 0から照射された超短パルスレーザ一光 を夕—ゲヅト 1 4上へ集光するフォーカスレンズ 2 2とを有している。
ここで、 超短パルスレーザ一 2 0は、 チタンサファイアレ一ザ一により構成さ れ、 以下に示すようなパラメ一夕を備えている。 即ち、
ピーク幅 （パルス時間幅） ：〜 l l O f s (フエムト秒）
出力 ： 5 0〜4 8 0〃 J (マイクロジュール）
(尖頭値出力： 0 . 5〜4 GW (ギガヮヅト） ）
波長 ：〜 8 0 O nm (ナノメートル） 繰り返し ： 1 k H z (キロへルヅ）
である。
なお、 四重極質量分析器 1 6は、 超短パルスレーザー 2 0から出射されて夕一 ゲヅト 1 4に照射される超短パルスレーザ一光の照射方向に対して、 9 0度垂直 方向に設置されている。
また、 超短パルスレーザ一 2 0から出射された超短パルスレーザ一光を集光す るフォーカスレンズ 2 2の焦点距離は、 例えば、 2 5 c mに設定されている。 以上の構成において、 上記した質量分析システム 1 0を用いて実際に質量分析 を行った実験結果について説明する。
まず、 実験の試料として、 図 2に示す仕様の 2種類のサンプル （サンプノレ 1お よびサンプル 2 ) を用いた。 そして、 この 2種類のサンプルを用いてターゲヅト 1 4をスピンコ一ト法により作成した。
即ち、 まず、 一辺が約 2 c mの略四角形状のシリコン基板を用意し、 その上に サンプル 1またはサンプル 2の濃い溶液をスポィトで滴下する。 その後に、 1 0 0 0回転 Ζ¾)で 9 0秒間このシリコン基板を回転する。 そうすることで、 シリコ ン基板上に滴下されたサンプル 1またはサンプル 2の溶液は、 広がりながら溶媒 を蒸発させて固相化し、 表面を平らに保ちながら硬化する。 それから、 表面にサ ンプル 1またはサンプル 2が硬化したシリコン基板を、 さらに約 1 2 0度の恒温 槽に入れ、 3 0分〜 1時間放置する。
この方法により、 均一、 かつ、 超短パルスレ一ザ一 2 0から出射された超短パ ルスレーザ一光の 1ショヅトのスポヅト当たり 1 0 1 3程度の濃度で、 1 c m 0以 上の面積を覆うサンプル 1またはサンプル 2を形成した夕一ゲット 1 4を作るこ とができる。
ここで、 基板の材質は半導体である必要はなく、 金属や絶縁体であっても良い。 超短パルスレーザ一光を用いたレ一ザ一アブレ一シヨンでは、 熱伝導度の高い基 板が、 より高いイオン検出効率を与える。 なお、 基板としては固体を用いるもの であり、 この基板として用いる固体の熱伝導率は 0 . l W ' m— 1 · K— 1以上であ ることが好ましい。
上記のようにして作成した夕ーゲヅト 1 4を真空槽 1 2内に装着して、 真空槽 1 2内を真空に引いて、 真空槽 1 2内の真空度が 1 0— 6 T o r r以下となるよう に設定する。
次に、 超短パルスレーザ一 2 0から出射された超短パルスレーザー光を、 フォ —カスレンズ 22を用いて夕一ゲット 14上に集光して、 夕一ゲット 14上に形 成されたサンプノレ 1またはサンプル 2をアブレ一シヨンする。
なお、 超短パルスレーザー 20から出射される超短パルスレ一ザ一光のパルス 幅は 1 10フエムト秒であり、 出力は 53 J、 23 O JLLJ, 480 / Jに変化 させた。
そして、 四重極質量分析器 16によって、 ターゲット 14への超短パルスレ一 ザ一光の照射により発生した一価のイオンの質量を測定する。
図 3 (a) (b) (c) には、 上記した手法により、 四重極質量分析器 16に よって測定されたサンプル 1の質量スぺクトラムが示されている。
短パルスレーザ一光の出力を 53 J (図 3 (b)参照） から 230 /J (図 3 (a)参照） にあげることで、 一価のイオンとなった12 C、 "0、 lgFをほぼ 構成比に対応した量で検出することができた。
これにより、 サンプル 1の高分子は、 フェムト秒レーザーなどの超短パルスレ —ザ一によるアブレ一シヨンにより原子化され、 その原子ィ匕と同時にイオン化さ れたことが確認された。
ここで、 さらに短パルスレーザ一光の出力を 480 Jにあげると、 Cの割合 が増加し、 また、 二価のシリコンイオンと思われるピークが顕著に現れてきた (図 3 (c)参照） 。 なお、 図 3 (c)の測定に関しては、 四重極質量分析器 1 6の感度を図 3 (a) ならびに図 3 (b)の測定の場合よりも二桁下げて測定し た。 次に、 図 4には、 超短パルスレーザ一光の照射によってサンプル 1が剥ぎ取ら れた夕ーゲット 14の状態を示す顕微鏡写真が示されている。 図 4においては、 同心円状に形成された二重円たる内側の白い円とその周りの外側の黒い円とが視 認される。 この 1スポットは、 シャツ夕一の開放時間 8msの照射に対応する。 つまり、 超短パルスレーザー光の約 8ショット分のパルスによって剥ぎ取られた 曰/ o
図 5は、 夕一ゲット 14に形成された傷の深さと面積とを測定した結果を示し ている。 ここで、 深さレベル B (L v. B) がシリコン基板の表面と考えられ、 深さ 8〃m、 幅 224〃mの円筒内にあったサンプル 1と深さ 6〃m、 幅 48 z mの円錐内のシリコンとが、 8ショヅト分のパルスで剥ぎ取られたものと認めら れる。 これから、 超短パルスレーザー光の 1ショットで剥ぎ取られたサンプルの 量とシリコンの量とを見積もると、 以下の結果となる。
即ち、
超短パルスレーザー光の 1ショヅトで剥ぎ取られたサンプルの量：
( 224/2) 27ΓΧ 8 X 10 -12 [cm3] x 1 [g/cm3] x { (6. 02 x 1023) /1193} ÷8 = 2. 0 x 1013
超短パルスレーザ一光の 1ショットで剥ぎ取られたシリコンの量：
(48/2 ) 27ΓΧ 6 Χ 10 12x (1/3) [cm3] x 2. 33 [g/ cm3] x { (6. 02 x 1023) /28} ÷8 = 2. 3 x 1013 上記したように、 サンプル 1に関する実験結果から、 超短パルスレーザ一光 (具体的には、 パルス時間幅が 110フヱムト秒のフヱムト秒レ一ザ一光であ る。 ） のアブレーシヨンにより、 高分子を原子化 ·イオン化することが可能であ ることが実証された。 次に、 ラペルのついた DNAサンプルでの実験を行うために、 サンプノレ 2とし て市販の d AT Pを用いて、 サンプル 1の場合と同様にして実験を行った。 図 6には、 この実験により得られた質量スペクトラムが示されており、 構成元 素の 12C、 14N、 160、 23Na、 31Pのピークを観測することができた。
この結果からも、 超短パルスレーザー光 （具体的には、 パルス時間幅が 110 フェムト秒のフェムト秒レーザ一光である。 ） のアブレ一シヨンにより、 高分子 (分子量 500程度） も原子化 ·イオン化させることができることが確認できた c さらに、 Pの同位元素をラベルとして用いることも可能であることが言える。 以上のことから、 高分子を高密度でシリコン基板上に塗布することにより、 有 機分子内の構成要素である C、 N、 0、 Na、 F、 Pなどを超短パルスレーザー 光のアブレ一シヨンによって原子化■イオン化して検出できることが実証された c d ATP内の Pを検出できたことにより、 Pの同位元素をラベルとして利用する ことができる。 次に、 以下に示す試料 （16族元素をもつ DNAサンプルとして、 S置換 DN Aサンプル） をサンプル 3として用いるとともに、 超短パルスレーザ一 20のパ ルス時間幅を 110フエムト秒、 尖頭値出力を 2 GWに設定した場合の実験結果 について説明する。
サンプル 3： 2' -Deoxyadeno s ine 5' 一 0— （1一 Thi otriphosphate)
化学式： doHuNsOuPsSNaa · 3H20 このサンプル 3の場合にも、 サンプル 1ならびにサンプル 2に関する実験の場 合と同様に、 質量分析システム 10により高分子の質量分析を行う前に、 まず、 夕ーゲヅト 14として、 質量分析の対象となる試料たる高分子 （上記した S置換 DNAサンプルである。 ） を溶媒に溶かした溶液をシリコン基板に塗布し、 その シリコン基板を摂氏 50度の恒温槽内に約 30分間放置し、 シリコン基板に塗布 された溶媒を蒸発させたものを準備する。
上記のようにして表面にサンプル 3が硬化した夕一ゲヅト 14を真空槽 12内 に装着して、 真空槽 12内を真空に引いて、 真空槽 12内の真空度が 10— eTo rr以下となるように設定する。
次に、 超短パルスレーザー 20から出射された上記したパラメ一夕を備えた超 短パルスレーザ一光を、 フォーカスレンズ 22を用いて夕一ゲッ卜 14上に集光 して、 夕一ゲヅト 14をアブレ一シヨンする。
回転導入端子 18により夕一ゲヅト 14を回転することにより、 夕一ゲヅト 1 4を遺漏 '重複なくスポット状にアブレ一シヨンする。 また、 この際に、 フォー カスレンズ 22を移動しながらシャツ夕一を開閉することにより、 夕一ゲヅト 1 4上をスポヅト状に遺漏，重複なくアブレ一シヨンすることができる。
そして、 四重極質量分析器 16によって、 夕一ゲヅト 14への超短パルスレ一 ザ一光の照射により発生した一価のイオンの質量を測定する。
図 7には、 上記した手法により、 四重極質量分析器 16によって測定された試 料の質量スぺクトラムの一例が示されている。
次に、 以下に示す試料 （17族元素をもつ DNAサンプルとして、 C1置換 D N Aサンプル） をサンプル 4として用いるとともに、 超短パルスレ一ザ一 20の パルス時間幅を 110フェムト秒、 尖頭値出力を 2 GWに設定した場合の実験結 果について説明する。
サンプル 4： 5-Chloro-2' -D e oxyur i d ine
化学式： CsHnClNaOs
このサンプル 4の場合にも、 サンプノレ 1ならびにサンプル 2に関する実験の場 合と同様に、 質量分析システム 1 0により高分子の質量分析を行う前に、 まず、 夕一ゲット 1 4として、 質量分析の対象となる試料たる高分子 （上記した C 1置 換 D NAサンプルである。 ） を溶媒に溶かした溶液をシリコン基板に塗布し、 そ のシリコン ¾f反を摂氏 5 0度の恒温槽内に約 3 0分間放置し、 シリコン基板に塗 布された溶媒を蒸発させたものを準備する。
上記のようにして表面にサンプル 4が硬ィ匕した夕一ゲヅト 1 4を真空槽 1 2内 に装着して、 真空槽 1 2内を真空に引いて、 真空槽 1 2内の真空度が 1 0— 6 T o r r以下となるように設定する。
次に、 超短パルスレーザ一 2 0から出射された上記したパラメ一夕を備えた超 短パルスレ一ザ一光を、 フォーカスレンズ 2 2を用いて夕ーゲット 1 4上に集光 して、 夕ーゲヅト 1 4をアブレーシヨンする。
フォーカスレンズ 2 2を移動しながらシャツ夕一を開閉することにより、 夕一 ゲヅト 1 4を遺漏 ·重複なくスポヅト状にアブレ一シヨンする。
そして、 四重極質量分析器 1 6によって、 夕一ゲヅト 1 4への超短パルスレー ザ一光の照射により発生した一価のイオンの質量を測定する。
図 8には、 上記した手法により、 四重極質量分析器 1 6によって測定された試 料の質量スぺクトラムの一例が示されている。 なお、 本発明によるレーザーアブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法は、 例 えば、 D NA、 蛋白質、 RNA、 P NA、 脂質、 糖などの各種の高分子の質量分 析に用いることが可能である。
また、 これら各種の高分子に関しては、 元素標識を付けたものも解析すること ができるのは勿論である。
即ち、 超短パルスレーザ一により単数または複数の同位体元素で標識した蛋白、 アルブミン、 D NAなどの高分子をアブレーシヨンすることにより、 高分子構成 元素を完全に原子ィォン化し、 ィォン化した標識元素を質量分析することにより 高分子の定量測定を行うことができる。 これにより、 多種類の同位体元素を標識 として使用することができるようになる。 従って、 質量分析することができる高 分子の対象範囲を飛躍的に広げることができるようになる。
つまり、 本発明によって、 同位体元素で標識した高分子試料それ自体を原子レ ベルでイオン化し、 標識元素を検出することが可能となるから、 質量分析可能な 対象範囲を飛躍的に広げることができるようになる。 例えば、 D NAの標識とし て同位体元素を用いることが可能となり、 標識の種類をたとえば安定同位体元素 の数である 2 7 0にも増やすことができる。 これは、 従来の標識法である蛍光法 ( 2種類） や放射性同位元素 （約 1 0種類） と比較して、 飛躍的に情報量を増や すことができる。 なお、 上記した実施の形態においては、 質量分析器として四重極質量分析器を 用いるようにしたが、 これに限られるものではないことは勿論であり、 原子の飛 行時間を測定することにより質量分析を行う飛行時間質量分析器を用いた場合に は、 一回のレーザ一照射で複数の原子の質量分析を同時に行うことができる。 ま た、 質量分析器としてイオンサイクロトロン型フーリエ変換質量分析器を用いた 場合にも、 複数の原子の質量分析を同時に行うことが可能となる。 また、 上記した実施の形態においては、 高分子の分析方法として質量分析に関 して説明したが、 これに限られるものではないことは勿論であり、 質量分析以外 の分析に関して本発明を用いるようにしてもよい。 また、 上記した実施の形態においては、 ターゲット 1 4を移動する移動手段と して、 ターゲット 1 4を回転する回転導入端子 1 8を用いたが、 これに限られる ものではないことは勿論であり、 夕一ゲヅト 1 4を載置可能な移動自在のテープ ルなどの適宜の移動手段を用いるようにしてもよい。
また、 上記した実施の形態においては、 回転導入端子 1 8を用いて夕一ゲヅト 1 4を回転することにより、 夕一ゲヅト 1 4を遺漏 ·重複なくアブレ一シヨンす るようにしたが、 これに限られるものではないことは勿論であり、 超短パルスレ —ザ一光の夕一ゲットへの照射位置を移動する移動手段を設けるようにして、 夕 —ゲヅト 1 4を遺漏 ·重複なくアブレ一シヨンするようにしてもよい。 産業上の利用可能性
本発明は、 以上説明したように構成されているので、 高分子を構成する構成原 子の原子ィォンを生成し、 生成した原子ィオンを分析するようにしたレ一ザーァ ブレーシヨンを用いた高分子の分析方法およびそのシステムであって、 高分解能 の分析装置を要しないようにしたレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の質量 分析方法およびそのシステムを提供することができるという優れた効果を奏する。 ここで、 より詳細には、 例えば、 質量分析を行う場合には、 質量スペクトルの解 祈が困難になる恐れを排除することができるとともに、 高分解能の質量分析装置 を必要とすることがないという優れた効果を奏する。
また、 本発明は、 以上説明したように構成されているので、 システム構成を大 幅に簡潔化することができるという優れた効果を奏する。
さらに、 本発明は、 以上説明したように構成されているので、 多種類の標識同 位体が混入した状況においても、 効率の良い分析を行うことができるようになる という優れた効果を奏する。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 分析の対象である高分子にレーザ一光を照射して該高分子をアブレーシヨン することにより、 高分子を構成元素に原子化し、 原子化した構成元素をイオン化 し、 イオン化した構成元素を分析するレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の 分析方法であって、
分析の対象である高分子に照射して、 該高分子をアブレーシヨンするレーザ一 光は超短パルスレーザ一光であり、
該超短パルスレーザー光を分析の対象である高分子に照射して、 該高分子をァ ブレ一シヨンすることによって、 該高分子を構成元素に原子化すると同時にィォ ン化し、 イオン化した構成元素を分析する
ものであるレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
2 . 請求項 1に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法におい て、
分析の対象である高分子は、 固相化されたもの
であるレ一ザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
3 . 請求項 2に記載のレーザ一アブレ一ションを用いた高分子の分析方法におい て、
高分子の固相化の方法は、 基板上に分析の対象である高分子の溶液を滴下して 乾燥することにより固相化する過程を含む方法
であるレーザーアブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
4 . 請求項 3に記載のレーザ一アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法におい て、
前記基板は固体であり、 該固体の熱伝導率は 0 . 1 W · m— 1 · K— 1以上 であるレ一ザ一アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法。
5 . 請求項 1に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法におい て、
分析の対象である高分子は、 元素標識を付けたもの
であるレ一ザ一アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法。
6 . 請求項 5に記載のレーザーアブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法におい て、
前記元素標識は、 周期律表において 1族元素
であるレ一ザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
7 . 請求項 5に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法におい て、
前記元素標識は、 周期律表において 1 6族元素
であるレ一ザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
8 . 請求項 5に記載のレーザーアブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法におい て、
前記元素標識は、 周期律表において 1 7族元素
であるレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
9 . 請求項 5に記載のレーザーアブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法におい て、
前記元素標識は、 周期律表において遷移金属元素
であるレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
1 0 . 請求項 5に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法にお いて、
前記元素標識は、 安定同位元素標識である レーザーアブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
1 1 . 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた 高分子の分析方法において、
分析の対象である高分子に照射して、 該高分子をアブレ一シヨンする超短パル スレ—ザ—光は、 パルス時間幅が 1 0ピコ秒以下であり、 尖頭値出力が 1 0メガ ヮット以上である
レ—ザ—アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法。
1 2 . 請求項 1 1に記載のレーザ一アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法に おいて、
分析の対象である高分子に照射して、 該高分子をアブレ一シヨンする超短パル スレーザ—光は、 パルス時間幅が 1フエムト秒以上 1ビコ秒以下であり、 尖頭値 出力が 1ギガワット以上 1 0ギガワット以下である
レ—ザ—アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法。
1 3 . 請求項 1〜1 2のいずれか 1項に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた 高分子の分析方法において、
前記イオン化した構成元素の分析は、 質量分析である
レーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
1 4 . 請求項 1 3に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法に おいて、
質量分析は、 飛行時間法による質量分析
であるレ一ザ一アブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法。
1 5 . 請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載のレーザ一アブレーシヨンを用いた 高分子の分析方法において、
イオン化した複数の構成元素を同時に分析する ものであるレ一ザ一アブレーシヨンを用いた高分子の分析方法。
1 6 . 請求項 1〜1 5のいずれか 1項に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた 高分子の分析方法において、
分析の対象である高分子は、 D N Aマイクロアレイに定着された核酸または核 酸の類似体である
レーザーアブレ—シヨンを用いた高分子の分析方法。
1 7 . 請求項 1 6に記載のレーザーアブレ一シヨンを用いた高分子の分析方法に おいて、
前記 D N Aマイクロアレイは、 多チャンネル化した D N Aマイクロアレイであ る
レーザ—アブレ—ションを用いた高分子の分析方法。
1 8 . 請求項 1〜1 7のいずれか 1項に記載のレーザ一アブレ一シヨンを用いた 高分子の分析方法において、
高分子をアブレ一シヨンする短パルスレ一ザ一光と分析の対象である高分子と は、 少なくともいずれか一方を移動させることにより、 該高分子をアブレ一ショ ンする短パルスレーザ一光により該分析の対象である高分子を遺漏、 重複なくァ ブレーシヨンして分析を行う
レーザ一アブレ一ションを用いた高分子の分析方法。
1 9 . 分析の対象である高分子にレーザ一光を照射して該高分子をアブレ一ショ ンすることにより、 高分子を構成元素に原子化し、 原子化した構成元素をイオン 化し、 イオン化した構成元素を分析するレーザーアブレ一シヨンを用いた高分子 の分析システムであって、
内部に夕一ゲットを配置可能な真空槽と、
前記真空槽内に配置された分析器と、 超短パルスレーザ一光を出射して前記真空槽内に配置された夕ーゲットへ照射 する超短パルスレーザーと
を有する高分子の分析システム。
2 0 . 請求項 1 9に記載の高分子の分析システムにおいて、 さらに、
前記真空槽内において夕ーゲットを移動する移動手段と
を有する高分子の分析システム。
2 1 . 請求項 2 0に記載の高分子の分析システムにおいて、
前記夕一ゲットを移動する移動手段は、 夕ーゲットを回転する回転手段である 高分子の分析システム。
2 2 . 請求項 1 9に記載の高分子の分析システムにおいて、 さらに、
超短パルスレ一ザ一光の夕一ゲットへの照射位置を移動する移動手段と を有する高分子の分析システム。
2 3 . 請求項 1 9〜2 2のいずれか 1項に記載の高分子の分析システムにおいて、 前記分析器は、 質量分析器である
高分子の分析システム。
2 4 . 請求項 2 3に記載の高分子の分析システムにおいて、
前記質量分析器は、 四重極質量分析器である
高分子の分析システム。
2 5 . 請求項 2 3に記載の高分子の分析システムにおいて、
前記質量分析器は、 飛行時間質量分析器である
高分子の分析システム。
2 6 . 請求項 2 3に記載の高分子の分析システムにおいて、
前記質量分析器は、 イオンサイクロトロン型フーリエ変換質量分析器である 高分子の分析システム。
2 7 . 請求項 1 9〜2 6のいずれか 1項に記載の高分子の分析システムにおいて、 前記超短パルスレーザ一は、 パルス時間幅が 1 0ピコ秒以下であり、 尖頭値出 力が 1 0メガヮヅト以上である短パルスレーザー光を照射する
高分子の分析システム。
2 8 . 請求項 2 7に記載の高分子の分析システムにおいて、
前記超短パルスレ一ザ一は、 パルス時間幅が 1フエ厶ト秒以上 1ピコ秒以下で あり、 尖頭値出力が 1ギガワヅト以上 1 0ギガワット以下である短パルスレーザ 一光を照射する
高分子の分析システム。
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