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VeröffentlichungsnummerWO2004011024 A1
PublikationstypAnmeldung
AnmeldenummerPCT/AT2003/000208
Veröffentlichungsdatum5. Febr. 2004
Eingetragen23. Juli 2003
Prioritätsdatum23. Juli 2002
Auch veröffentlicht unterDE50311422D1, EP1528930A1, EP1528930B1, EP2082748A1, US7371722, US20050192222, US20090123453, WO2004011023A1, WO2004011024A8
VeröffentlichungsnummerPCT/2003/208, PCT/AT/2003/000208, PCT/AT/2003/00208, PCT/AT/3/000208, PCT/AT/3/00208, PCT/AT2003/000208, PCT/AT2003/00208, PCT/AT2003000208, PCT/AT200300208, PCT/AT3/000208, PCT/AT3/00208, PCT/AT3000208, PCT/AT300208, WO 2004/011024 A1, WO 2004011024 A1, WO 2004011024A1, WO-A1-2004011024, WO2004/011024A1, WO2004011024 A1, WO2004011024A1
ErfinderJohann Eibl
AntragstellerBio-Products & Bio-Engineering Aktiengesellschaft
Zitat exportierenBiBTeX, EndNote, RefMan
Externe Links:  Patentscope, Espacenet
Pharmaceutical active ingredient preparations and medicaments that contain thrombin or have a thrombin-generating capacity
WO 2004011024 A1
Zusammenfassung
The invention relates to a pharmaceutical active ingredient preparation for producing a medicament that contains thrombin or has a thrombin-generating capacity. The inventive preparation is characterised in that it contains: (A) prothrombin obtained from plasma or by means of genetic engineering (coagulation factor II), (B) coagulation factors V, VIII, IX, X obtained from plasma or by means of genetic engineering, which can be at least partially in the activated state, and coagulation factor Xla obtained from plasma or by means of genetic engineering, and (C) phospholipids which are safe from prions and contribute to the clotting process, said phospholipids being optionally contained in liposomes.
Ansprüche  übersetzt aus folgender Sprache: Deutsch  (OCR-Text kann Fehler enthalten)
Patentansprüche: claims:
1. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung zur Herstellung eines thrombingenerierfähigen oder thrombinhältigen Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, dass sie enthält: 1. A pharmaceutical active ingredient preparation for producing a medicinal product containing thrombin or thrombin, characterized in that it comprises:
(A)aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenes Prothrombin (A) from plasma derived or genetically engineered prothrombin
(Gerinnungsfaktor II), (B) aus Plasma oder gentechnologisch gewonnene Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, die zumindest teilweise in aktiviertem Zustand vorliegen können, und aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor Xla, und (C)prionensichere, gerinnungsaktive Phospholipide, wobei die Phospholipide gegebenenfalls in Liposomen enthalten sind. (Coagulation factor II), (B) from plasma or obtained by gene technology coagulation factors V, VIII, IX, X, which may at least partially be present in activated state, and from plasma or recombinant coagulation factor XIa, and (C) prion-safe, coagulation-active phospholipids, which the phospholipids are optionally contained in liposomes.
2. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie auch aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor VII oder ein Gemisch von aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktoren VII und Vlla enthält. 2. The pharmaceutical preparation of active compound according to claim 1, characterized in that it also contains plasma-derived or recombinant coagulation factor VII or a mixture of plasma-derived or recombinant coagulation factors VII and VIIa.
3. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen gentechnologisch hergestellten Tissue Faktor als solchen oder in relipidierter Form enthält. 3. The pharmaceutical preparation of active compound according to any one of claims 1 or 2, characterized in that it comprises a tissue factor produced by genetic engineering as such or in relipidated form contains.
4. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gerinnungsfaktoren ausschließlich aus Blutplasma einer bestimmten Säugetierspezies hergestellt sind oder aus den entsprechenden gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktoren oder aktivierten Gerinnungsfaktoren, einschließlich Tissue Faktor, hergestellt sind. 4. The pharmaceutical preparation of active compound according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the coagulation factors are produced exclusively from the blood plasma of a certain mammalian species or are prepared from the corresponding recombinant coagulation factors or activated coagulation factors, including tissue factor.
5. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Prothrombin, die Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, Xla und gegebenenfalls die Gerinnungsfaktoren VII und Vlla, sowie der Tissue Faktor durch Virusinaktivierung und/oder Virusabreicherung virussicher sind. 5. The pharmaceutical preparation of active compound according to any one of claims 1 to 4, characterized in that prothrombin, coagulation factors V, VIII, IX, X, XIa, and optionally coagulation factors VII and VIIa, as well as the tissue factor by virus inactivation and / or virus depletion are virus-safe ,
6. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie in tiefgefrorener oder gefriergetrockneter Form vorliegt. 6. A pharmaceutical preparation of active compound according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is present in deep-frozen or freeze-dried form.
7. Thrombingenerierfähiges Arzneimittel, herstellbar aus einer pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5. 7. Thrombingenerierfähiges drug, produced from a pharmaceutical preparation according to any one of claims 1 to fifth
8. Thrombingenerierfähiges Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es in tiefgefrorenem oder in gefriergetrocknetem Zustand vorliegt. 8. Thrombingenerierfähiges pharmaceutical composition of claim 7, characterized in that it is present in deep-frozen or in freeze-dried state.
9. Thrombingenerierfähiges Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Thrombin in einer solchen Menge enthält, dass es nach Auftauen oder Rekonstitution nicht mehr als 1 Einheit Thrombin pro ml enthält. 9. Thrombingenerierfähiges medicament according to claim 7, characterized in that it additionally contains thrombin in an amount such that it contains thrombin per ml after thawing or reconstitution no more than 1 unit.
10. Thrombinhältiges Arzneimittel, herstellbar aus einer thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6. 10. drug containing thrombin, prepared from a thrombin, pharmaceutical preparation according to any one of claims 1 to 6th
11. Thrombinhältiges Arzneimittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es in tiefgefrorenem oder gefriergetrockneten Zustand vorliegt. 11. containing thrombin pharmaceutical composition of claim 10, characterized in that it is present in deep-frozen or freeze-dried state.
12. Arzneimittelgemisch, das vor seiner Anwendung durch Vermischen eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 7 bis 9 mit einem fibrinogenhältigen Arzneimittel innerhalb von 30 bis 300 Sekunden gerinnt. 12. The pharmaceutical mixture comprising 7 to 9 clot before its use by mixing a medicinal product according to any one of claims with a fibrinogen-containing medicinal products within 30 to 300 seconds.
13. Thrombinhältiges Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , das mit einem Arzneimittelgemisch nach Anspruch 12 versetzt, innerhalb von 3 bis 10 Sekunden gerinnt. 13. drug containing thrombin according to any of claims 10 or 11, mixed with a medicinal composition according to claim 12, coagulate within 3 to 10 seconds.
14. Verfahren zur Herstellung einer thrombinhältigen pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass eine thrombingenerierfähige Wirkstoffzubereitung mit Ca-Ionen versetzt wird, wobei ein thrombinhältiges Produkt gebildet wird, welches anschließend chromatographisch gereinigt wird. 14. A process for preparing a thrombin-pharmaceutical preparation, characterized in that a generating thrombin preparation of active compound is mixed with Ca-ions, wherein a product is formed containing thrombin, which is subsequently purified by chromatography.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkstoffzubereitung durch Virusinaktivierung während oder nach der Thrombinbildung, sowie durch Virusabreicherung nach abgeschlossener Thrombinbildung virussicher gemacht wird. 15. The method according to claim 14, characterized in that the active substance preparation is rendered virally safe by virus inactivation during or after thrombin generation, as well as virus removal after completion of thrombin formation.
16. Verfahren zur Herstellung eines Pro-Kofaktorenkonzentrates enthaltend die Gerinnungsfaktoren V und VIII, dadurch gekennzeichnet, dass aus Plasma gewonnenes Kryopräzipitat gelöst und aus der Lösung Fibrinogen abgetrennt wird, wobei eine die Gerinnungsfaktoren V und VIII hältige Lösung erhalten wird, welche mit Calciumchlorid versetzt werden kann. 16. A process for the preparation of a pro-Kofaktorenkonzentrates containing the coagulation factors V and VIII, characterized in that is released from plasma obtained cryoprecipitate and separated from the solution of fibrinogen, a clotting factors V and VIII containing solution is obtained, which are treated with calcium chloride can.
17. Verfahren zur Herstellung eines Gerinnungsfaktor-XI-hältigen Prothrombinkomplexkonzentrates enthaltend die Gerinnungsfaktoren II, VII, Vlla, IX, X und XI, wobei pro 1 ,0 μg Prothrombin mindestens 0,030 μg Gerinnungsfaktor Xla enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, dass aus Plasma gewonnener Kryopräzipitatüberstand an einem Anionenaustauscher adsorbiert und nach Waschen des Adsorbats und Lagerung in der Kälte Gerinnungsfaktor-Xla-hältiger Prothrombinkomplex eluiert wird. 17. A method for preparing a coagulation factor XI-containing Prothrombinkomplexkonzentrates containing the coagulation factors II, VII, VIIa, IX, X and XI, wherein Pro 1, 0 ug prothrombin at least 0.030 ug coagulation factor XIa are contained, characterized in that plasma-derived cryoprecipitate supernatant adsorbed to an anion exchanger and is eluted after washing the adsorbate and storage in the cold coagulation factor XIa hältiger prothrombin.
18. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 1 - 6 aus virusinaktivierten, thrombin-generierenden, Gerinnungsfaktor-Xl- und Gerinnungsfaktor-XII-hältigen Prothrombinkomplexen, die vorzugsweise in Anwesenheit gerinnungsaktiver Phospholipide durch Zusatz von virusinaktiviertem oder von virussicherem Kallikrein oder virusinaktiviertem bzw. virussicherem Präkallikrein und mit virussicheren Präkallikreinaktivatoren aktiviert werden. 18. A pharmaceutical drug preparations according to claims 1 - 6 as virus-inactivated, thrombin-generating, clotting factor XL and coagulation factor XII-containing prothrombin complexes, preferably coagulation-active in the presence of phospholipids by the addition of virally inactivated or virally safe kallikrein or virally inactivated or virally safe prekallikrein and are activated with virally safe Präkallikreinaktivatoren.
19. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 1 - 6 und 18, die außer Prothrombinkomplexen auch noch TAFI oder TAFI und Gerinnungsfaktor XIII enthalten und nach der Aktivierung von Prothrombin einen Gehalt von mindestens 3 E (50 μg) TAFIa bzw. 3 E TAFIa und 5 E Gerinnungsfaktor Xllla pro 1000 E Thrombin aufweisen. 19. A pharmaceutical active ingredient preparations according to claims 1-6 and 18, which contain, in addition prothrombin complexes also TAFI or TAFI and coagulation factor XIII and, after activation of prothrombin a content of at least 3 E (50 ug) TAFIa or 3 E TAFIa and 5 U have clotting factor XIIIa per 1000 e thrombin.
20. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 1 - 6 und Zubereitungen von Arzneimittelgemischen nach den Ansprüchen 7 - 13, 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass prionensichere, gerinnungsaktive Phospholipide pflanzlichen Ursprungs oder solche pflanzlichen und synthetischen Ursprungs verwendet werden, vorzugsweise in einem Verhältnis von Phosphatidylcholinen zu Phosphatidylserinen von 3 + 1 oder von Phosphatidylcholinen zu Phosphatidylserinen zu Phosphaäthanolaminen von 2 + 2 + 1. 20. Pharmaceutical preparations of active compound according to Claims 1-6 and preparations of medicinal product mixtures according to claims 7-13, 18 and 19, characterized in that prion-safe, coagulation-active phospholipids of vegetable origin or those of vegetable and synthetic origin are used, preferably in a ratio of phosphatidylcholines to phosphatidylserines of 3 + 1 or of phosphatidylcholines to phosphatidylserines to Phosphaäthanolaminen of 2 + 2 + 1st
21. Herstellung von pharmazeutischen Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 1 - 6, 18, 19 und 20 sowie von Arzneimitteln nach Ansprüchen 7 - 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zu verwendenden Phospholipidemulsionen noch einer Ultraschallbehandlung und daraffolgend allenfalls einer Sterilfiltration unterzogen werden. 21, the preparation of pharmaceutical preparations of active compound according to Claims 1-6, 18, 19 and 20 and of medicaments according to claims 7-13, characterized in that the to be used Phospholipidemulsionen still an ultrasonic treatment and if need be a sterile filtration daraffolgend subjected.
22. Herstellung von thrombingenerierfähigen, virussicheren Arzneimitteln nach Anspruch 9 und pharmazeutischen Wirkstoffzubereitungen nach Ansprüchen 18 und 19, wobei als Komponente C nach Ansprüchen 20 und 21 hergestellte Phospholipidemulsionen verwendet werden. 22. Preparation of thrombin, virally safe medicinal products according to claim 9 and pharmaceutical preparations of active compound according to Claims 18 and 19, being used as component C according to claims 20 and 21 produced Phospholipidemulsionen.
23. Herstellung von thrombinhältigen, virussicheren Arzneimitteln nach Anspruch 10 und pharmazeutische Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 18 oder 19, wobei als Komponente C nach Ansprüchen 20 und 21 hergestellte Phospholipidemulsionen verwendet werden. 23. Preparation of Thrombin virally safe medicinal products according to claim 10 and pharmaceutical active substance preparations according to claims 18 or 19, being used as component C according to claims 20 and 21 produced Phospholipidemulsionen.
24. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln nach den Ansprüchen 7 - 9, 22, sowie eines Arzneimittelgemisches nach Anspruch 12, indem eine Ca- Ionenkonzentration unter 1 mM oder über 10 mM zur Anwendung kommt. 24. A method for the production of medicaments according to claims 7-9, 22, and a drug mix according to claim 12, by a Ca ion concentration of below 1 mM, or about 10 mM is used.
25. Herstellung von Phospholipidmischungen nach den Ansprüchen 20, 21 , 22 und 23, die mit Kaolin versetzt und nach Ultraschallbehandlung zur Aktivierung von Prothrombinkomplex-hältigen Lösungen verwendet werden. 25. Preparation of phospholipid mixtures according to claims 20, 21, 22 and 23, which are mixed with kaolin and used after ultrasonic treatment for activating prothrombin complex-containing solutions.
Beschreibung  übersetzt aus folgender Sprache: Deutsch  (OCR-Text kann Fehler enthalten)

THROMBINGENERIERFAHIGE UND THROMBINHALTIGE PHARMAZEUTISCHE WIRKSTOFFZUBEREITUNGEN UND ARZNEIMITTEL THROMBINGENERIERFAHIGE AND PHARMACEUTICAL thrombin-ACTIVE PREPARATIONS AND MEDICINES

Die Erfindung betrifft eine thrombingenerierfäliige und thrombinhältige pharmazeutische Wirkstoffzubereitung und daraus hergestellte Arzneimittel. The invention relates to a thrombin-thrombingenerierfäliige and pharmaceutical preparation and derived medicines.

Einleitung introduction

Werden Blutgefäße verletzt, so tritt Blut aus dem vaskulären Raum aus und gerinnt. If blood vessels injured, as occurs from blood from the vascular space and coagulates. Die verletzten Blutgefäße werden durch das gerinnende Blut verschlossen und schützen so den Organismus vor großen Blutverlusten. The injured blood vessels are closed by the coagulating blood and thus protect the organism from massive blood loss. Die Blutgerinnung wird durch das Enzym Thrombin verursacht, das sich aus seinem Zymogen, Prothrombin, generiert und die Umwandlung des im Blutplasma vorhandenen Proteins Fibrinogen in unlösliches Fibrin bewirkt. Blood coagulation is caused by the enzyme thrombin, which causes from its zymogen, prothrombin, and generates the conversion of the substance in the blood plasma protein fibrinogen to insoluble fibrin. Das austretende Blut gerinnt innerhalb von Minuten, wobei nur ein Sechstel des im Plasma enthaltenen Fibrinogens in Fibrin umgesetzt wird. The exiting blood coagulates within minutes, with only one sixth of the fibrinogen contained in the plasma is converted to fibrin. In dem noch stark fibrinogenhältigen geronnenen Blut setzt sich die Thrombinbildung weiter fort, so dass es schließlich zu einer kompletten Umwandlung des gesamten, im geronnenen Blut noch vorhandenen Fibrinogens in Fibrin kommt. In the still strong fibrinogen clotted blood, the thrombin generation continues further so that it finally comes to a complete transformation of the whole, still present in the coagulated blood fibrinogen into fibrin. Dieser Vorgang der fortgesetzten Thrombinbildung und Gerinnung nimmt längere Zeit in Anspruch und kann auch erst nach mehreren Stunden vollständig beendet sein. This process of continued thrombin formation and coagulation takes longer time and can also be completely terminated only after several hours.

Bei der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin bewirkt Thrombin zunächst die Abspaltung bzw. teilweise Abspaltung der Fibrinopeptide A und B von den beiden Enden des Fibrinogenmoleküls, wodurch zunächst noch lösliche Fibrinmonomere entstehen. In the conversion of fibrinogen to fibrin, thrombin causes first the elimination or partial elimination of the fibrinopeptides A and B of the two ends of the fibrinogen, which initially soluble fibrin monomers arise. Diese können lateral zu Fibrillen aggregieren, die sich dann zu einem Fibrinnetzwerk ausbilden (Blombäck). This can laterally into fibrils, which then form into a fibrin network (Blombäck). Dieses im geronnenen Blut entstandene Fibrinnetzwerk haftet am verletzten Gewebe bzw. dem Wundbett an und führt so zur Blutstillung und zum Wundverschluss. This resulting in coagulated blood fibrin adheres to the injured tissue and the wound bed, thus leading to hemostasis and wound closure.

Thrombin bewirkt auch die Überführung des Gerinnungsfaktors XIII, des Zymogens des Gerinnungsfaktors Xllla, in eine Transglutaminase. Thrombin also causes the conversion of coagulation factor XIII, the zymogen of coagulation factor XIIIa, into a transglutaminase. Diese vernetzt Proteine wie Fibrin, Fibrinmonomere, Fibrinogen und andere im Blutplasma vorkommende Proteine durch kovalente Bindungen. These cross-linked proteins such as fibrin, fibrin monomers, fibrinogen, and other proteins occurring in blood plasma by covalent bonds. Insbesondere die Quervernetzung von Fibrin ist für die Stabilität des sich ausbildenden Fibrinnetzwerkes von großer Bedeutung (Siebenlist et al.). In particular, the cross-linking of fibrin is for the stability of the developing fibrin network is of great importance (Seven List et al.).

Thrombin führt auch den thrombinaktivierbaren Fibrinolyseinhibitor (TAFI) in eine Karboxypeptidase (TAFIa) über, die von Fibrin karboxyterminale Lysinreste abspaltet und dadurch die Bildung des Tissue-Plasminogen-Aktivator-Plasminogen-Fibrin- Komplexes unterbindet, der für die Überführung von Plasminogen in Plasmin erforderlich ist (Booth). Thrombin also leads the thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) into a carboxypeptidase (TAFIa) over which karboxyterminale fibrin lysine residues cleaved and thus the formation of the tissue plasminogen activator plasminogen fibrin complex inhibits the necessary for the conversion of plasminogen to plasmin is (Booth).

In vitro wird die Bildung von Thrombin im Blut oder Blutplasma und damit das Einsetzen des Gerinnungsvorganges durch Gewebsextrakte ermöglicht. In vitro, the formation of thrombin in blood or blood plasma and thus the onset of the coagulation process is made possible by tissue extracts. Solche Extrakte können am besten aus Gehirn mit wässrigen Medien oder auch mit organischen Lösungsmitteln erhalten werden (Morawitz). Such extracts can best be obtained from brain using aqueous media or organic solvents (Morawitz).

Das mit geeigneter Pufferlösung extrahierbare, als Thromboplastin bezeichnete gerinnungsaktive Material besteht aus einem Apoprotein, dem Tissue Faktor, und gerinnungsaktiven Lipiden. The solution with a suitable buffer extractable, called thromboplastin coagulation active material consists of an apoprotein, the tissue factor, and coagulation-active lipids. Schon geringe Mengen Thromboplastin, wenn sie Blut oder Plasma zugesetzt werden, führen zu einer schnellen Gerinnung. Even small amounts of thromboplastin, when added to blood or plasma, results in rapid clotting.

Der mit organischen Lösungsmitteln extrahierbare gerinnungsaktive Bestandteil des Gehirns wird als partielles Thromboplastin bezeichnet und besteht im wesentlichen aus gerinnungsaktiven Lipiden. The extractable with organic solvents coagulation active part of the brain is referred to as partial thromboplastin and consists essentially of coagulation-active lipids. Bei Zusatz zu Blut oder Blutplasma kommt es nur dann zu einer schnellen Gerinnung, wenn noch aktivierende Substanzen, wie zB Kaolin oder Glaspulver, zugesetzt werden. When added to blood or plasma, it only comes to rapid coagulation when still activating substances, such as kaolin or glass powder may be added.

Daraus entstand die Vorstellung einer Aktivierungskaskade von Enzymen, die letztlich in der Entstehung des Enzyms Thrombin endet, das die Blutgerinnung veranlasst (Davie et al.; MacFarlane) This led to the idea of an activation cascade of enzymes ultimately in the formation of the enzyme thrombin ends, which causes blood clotting (Davie et al .; MacFarlane)

Der durch Thromboplastin ausgelöste Gerinnungsvorgang wird als extrinsic Pathway der Blutgerinnung bezeichnet, der durch das partielle Thromboplastin bewirkte Gerinnungsvorgang als intrinsic Pathway. The triggered by thromboplastin clotting process is called extrinsic pathway of blood clotting which caused clotting process by the partial thromboplastin as intrinsic pathway. Beide Vorgänge haben gemeinsam, dass sie, wenn auch auf unterschiedlichem Weg, den Gerinnungsfaktor X in Xa umsetzen. Both processes have in common that they, if implemented on a different path, the coagulation factor X in Xa. Demnach wird bei dem ersten Teil des Gerinnungsvorganges, der zur Aktivierung des Gerinnungsfaktors X führt, zwischen dem extrinsic und intrinsic Tenase-Pathway unterschieden. Accordingly, in the first part of the coagulation process, which leads to activation of coagulation factor X, distinguished the extrinsic and intrinsic tenase pathway between. In einem weiteren Enzymkomplex, der Prothrombinase, setzt der Gerinnungsfaktor Xa Prothrombin in Thrombin um. In another enzyme complex, prothrombinase, sets of coagulation Factor Xa prothrombin into thrombin. Dieser Vorgang wird als common Pathway bezeichnet. This process is referred to as the common pathway. Das Enzymsystem, das mit Hilfe von Thromboplastin den Gerinnungsfaktor Xa generiert, wird als extrinsic Tenasekomplex bezeichnet, im Gegensatz zu dem Enzymsystem, in dem das partielle Thromboplastin eine Rolle spielt, dem intrinsic Tenasekomplex. The enzyme system which generates with the aid of the thromboplastin coagulation factor Xa is referred to as extrinsic tenase complex, in contrast to the enzyme system in which the partial thromboplastin plays a role, the intrinsic tenase complex.

Es ist die vorherrschende Ansicht, dass der Tissue Faktor gemeinsam mit dem Gerinnungsfaktor Vlla der nach Verletzungen unter Mitwirkung der Blutplättchen die Blutgerinnung auslöst (Rapaport et al.). It is the prevailing view that the tissue factor triggers together with the coagulation factor VIIa the following injuries, composed of platelet clotting (Rapaport et al.). Tissue Faktor kommt in fast allen Geweben in stark unterschiedlichen Mengen gemeinsam mit gerinnungsaktiven Lipiden vor und beide Substanzen bilden, wenn sie mit Blut in Berührung kommen, den extrinsic Tenasekomplex, da im Blut ständig geringe Mengen des aktivierten Gerinnungsfaktors VII vorhanden sind (Drake et al.). Tissue factor occurs in almost all tissues in widely varying amounts along with coagulation-active lipids before and make both substances, when they come into contact with blood, the extrinsic tenase because in the blood continuously small amounts of activated coagulation factor VII are present (Drake et al. ). Der extrinisic Tenasekomplex führt sowohl den Gerinnungsfaktor X in Xa über als auch den Gerinnungsfaktor IX in IXa, der weiters X in Xa umwandelt. The tenase complex extrinisic performs both the coagulation factor X in Xa over and coagulation factor IX in IXa, Xa in the further converts X. Die Aktivierung von Faktor X und die in weiterer Folge resultierende Bildung von Thrombin kommt aber durch den Tissue-Faktor- Pathway-Inhibitor (TFPI) sehr rasch zum Stillstand. The activation of factor X and the resulting subsequently formation of thrombin occurs but by the tissue factor pathway inhibitor (TFPI) very quickly to a halt. Der temporär gebildete extrinsic Tenasekomplex sowie der Gerinnungsfaktor Xla führen unabhängig voneinander zur Aktivierung des intrinsic Tenasekomplexes, der in bezug auf Aktivierung des Gerinnungsfaktors X etwa 50fach aktiver ist als der extrinsic Tenasekomplex. The extrinsic tenase temporarily formed and the coagulation factor XIa independently lead to activation of the intrinsic tenase, approximately 50-fold more active with respect to activation of coagulation factor X than the extrinsic tenase. Der intrinsic Tenasekomplex setzt sich aus den aktivierten Gerinnungsfaktoren IXa, Villa und gerinnungsaktiven Phospholipiden zusammen und wird nicht durch TFPI gehemmt (von dem Borne et al.). The intrinsic tenase consists of the activated clotting factors IXa, Villa and coagulation-active phospholipids and is not inhibited by TFPI (von dem Borne et al.). Das Enzym Gerinnungsfaktor IXa, das den Gerinnungsfaktor X in Xa überführt, ist im intrinsic Tenase-Komplex in seiner Wirkung um das 100.000 bis 1 ,000.000fache gesteigert. The enzyme coagulation factor IXa, which transforms coagulation factor X in Xa, is increased in intrinsic tenase complex in its effect to the 100000-1, 000.000fache. Diese Steigerung erfolgt durch den Kofaktor Villa, der selbst kein Enzym ist, und bestimmte Phospholipide bei optimaler Ca-Ionenkonzentration. This increase is effected by the cofactor Villa, who himself is not an enzyme, and certain phospholipids at an optimum calcium ion concentration.

Da der intrinsic Tenasekomplex sehr schnell Gerinnungsfaktor X in Xa überführt und dieser mit dem Kofaktor Va und gerinnungsaktiven Phospholipiden Prothrombin aktiviert, kommt es zu einer äußerst raschen Bildung großer Mengen Thrombins (Mann et al.). Since the intrinsic tenase very fast coagulation factor X converted to Xa and this enabled the cofactor Va and coagulation-active phospholipids Prothrombin, there is an extremely rapid formation of large amounts of thrombin (Mann et al.).

Die einzelnen Gerinnungsfaktoren und Blutplättchen - die wesentlichen, für den Gerinnungsvorgang verantwortlichen Komponenten im Blut -, sind normalerweise in großem Überschuss vorhanden. The individual coagulation factors and platelets - the main, responsible for the clotting process components in the blood - are normally present in large excess. Erst bei einer Verminderung um 90% oder mehr einer dieser Komponenten macht sich eine erhöhte Blutungsneigung bemerkbar. Only with a reduction of 90% or more of these components is a bleeding tendency is noticeable. Zu lebensbedrohiichen Blutungen kommt es erst, wenn Mangelzustände auftreten, bei denen ein Gerinnungsfaktor bzw. die Blutplättchen nur mehr einige Prozent ihres Normalwertes aufweisen. To lebensbedrohiichen bleeding occurs only when deficiencies arise in which a clotting factor or platelet only comprise a few percent of their normal value. Die zentrale Bedeutung des Tissue Faktors für die Auslösung des Gerinnungsvorganges und seine weite Verbreitung in allen Organen steht zwar außer Frage, aber in Geweben mit niederem Tissue-Faktorgehalt treten schwere Störungen der Blutgerinnung gerade dann auf, wenn ein Faktor des intrinsic Tenasekomplexes oder des Prothrombinasekomplexes pathologisch vermindert ist. The central importance of tissue factor for triggering the coagulation process and its wide use in all institutions is not in question, but in tissues with low tissue factor content results in serious bleeding disorders on just when a factor of intrinsic tenase or prothrombinase pathologically is reduced. Die wichtigsten Beispiele hierfür sind Patienten, die an einer Hämophilie A oder Hämophilie B leiden. The main examples are patients suffering from hemophilia A or hemophilia B. Blut dieser Patienten gerinnt in den meisten Fällen noch, aber es kommt wegen der ungenügenden oder fehlenden Ausbildung des intrinsic Tenasekomplexes zu einer ungenügenden Thrombinbildung im geronnenen Blut und zur raschen Auflösung desselben, so dass keine ausreichende Hämostase zustande kommt. Blood clots of these patients in most cases yet, but it is the same because of inadequate or absent development of intrinsic tenase to insufficient thrombin in clotted blood and for rapid resolution, so that a sufficient hemostasis is achieved.

Thrombin, meist bovinen Ursprungs, wird als nicht parenteral zu verabreichendes Arzneimittel zur Blutstillung oberflächlicher Verletzungen eingesetzt. Thrombin, usually of bovine origin is used as non-parenterally administrable drug for hemostasis of superficial injuries. Seine hämostyptische Wirkung konnte durch die gemeinsame Anwendung mit fibrinogenhältigen Arzneimitteln entscheidend verbessert werden (Grey; Young et al.). Its hemostatic effect could be significantly improved by the concomitant use with medicinal products containing fibrinogen (Grey; Young et al.). Fibrinogen und Thrombin werden entsprechend ihrer speziesspezifischen Anwendung nunmehr überwiegend aus allogenem Ausgangsmaterial gewonnen. Fibrinogen and thrombin are obtained in accordance with their species-specific application now predominantly allogenic starting material. Durch die kombinierte Anwendung von Thrombin mit fibrinogenhältigen Arzneimitteln wird versucht, die physiologische Blutgerinnung und die dabei auftretende Hämostase nachzuvollziehen, bzw. zu verbessern. The combined use of thrombin with fibrinogen-containing medicinal will try to mimic the physiological blood coagulation and hemostasis occurring, or to improve. Dies kann auch bei Patienten mit schweren Blutgerinnungsstörungen erreicht werden (Matras et al.). This can be achieved even in patients with severe blood coagulation disturbances (Matras et al.).

Durch die gemeinsame Anwendung von Fibrinogenkonzentraten, deren Fibrinogengehalt das 10- bis 20fache des Blutes beträgt, und hohen Mengen Thrombins (100 - 1000 E pro mL) gelingt es, die Gerinnungszeit in einem solchen Fibrinogen-Thrombingemisch in den Sekundenbereich zu bringen und im Vergleich zur physiologischen Blutungszeit eine 10 bis 100fache Verkürzung zu erlangen. The joint application of fibrinogen concentrates, whose fibrinogen content amounts to 10 to 20 times of the blood, and high amounts of thrombin (100-1000 U per mL) it is possible to bring the coagulation time in such a fibrinogen-thrombin mixture to seconds and compared to physiological bleeding time a 10 to get to 100-fold reduction. Dadurch wurde es möglich, bei optimaler Applikation solcher Fibrinogen-Thrombin- gemische praktisch eine sofortige Blutstillung zu erreichen, soweit keine großen Blutgefäße, insbesondere arterielle, verletzt wurden (Spängier). This made it possible to reach virtually mixtures with optimal application of such fibrinogen-thrombin immediate hemostasis, unless large blood vessels, particularly arterial, were injured (Spängier).

Das durch Thrombin zu Fibrin umgewandelte Fibrinogen haftet ebenso wie geronnenes Blut am Wundbett an, wobei es offenbar durch die unter Thrombinwirkung aktivierten Transglutaminasen auch zu kovalenten Bindungen zwischen dem verletzten Gewebe und dem gebildeten Fibrin kommt. The converted by thrombin into fibrin fibrinogen adheres well to as coagulated blood at the wound bed, which is apparently coming through the activated thrombin by transglutaminase also covalent bonds between the injured tissue and the fibrin formed. Diese starke Anhaftung des gebildeten Fibrins am Gewebe kann auch zum Kleben von nicht blutenden Geweben genützt werden, da das gebildete Fibrin in den meisten Fällen die Heilung des geklebten Gewebes nicht stört und innerhalb von Tagen bis Wochen weitgehend abgebaut wird (Matras et al.). This strong adhesion of the formed fibrin to tissue can also be availed for bonding non-bleeding tissues, since the fibrin formed in most cases the cure of bonded fabric does not interfere and is largely degraded within days to weeks (Matras et al.).

Im Gegensatz zur möglichst raschen Einleitung des Gerinnungsvorganges bei der Blutstillung mit Fibrinogen-Thrombingemischen ist bei der Klebung von Gewebeteilen und bei Abdichtungen ein verzögerter Beginn des Gerinnungsvorganges erwünscht. In contrast to the fastest possible introduction of the coagulation process in hemostasis with fibrinogen-thrombin mixing a delayed start of the coagulation process is desirable when bonding tissue parts and seals. Dadurch können die zu klebenden Gewebsteile besser adaptiert werden, und ähnliche Adaptierungen sind auch bei Abdichtungen erforderlich. This can be better adapted to the adhesive portions of tissue, and similar adaptations are also required for waterproofing. Bisher wurde die Verzögerung des Gerinnungsvorganges durch Verminderung der Thrombinkonzentration auf etwa 1% der Thrombinmenge, die zur Blutstillung verwendet wird, bewerkstelligt. So far, the delay in the coagulation process was accomplished by reducing the thrombin concentration to about 1% of the amount of thrombin that is used for hemostasis. Jedoch bringen sowohl die Anwendung hoher als auch niederer Thrombinkonzentrationen verschiedene Nachteile mit sich. However, both the use of high and low concentrations of thrombin bring various disadvantages.

Hochviskose Fibrinogenlösungen mit einem Fibrinogengehalt zwischen 5 und 10% können mit Thrombinmengen zwischen 100 und 1.000 Einheiten innerhalb von Sekunden zur Gerinnung gebracht werden. Highly viscous fibrinogen with a fibrinogen content 5-10% can be reacted with thrombin between 100 and 1,000 units within seconds to clot. Diese kurze Gerinnungszeit ist erforderlich, damit nach Aufbringung eines solchen Gemisches auf eine blutende Stelle die Gerinnung rasch einsetzt und die Blutung dadurch zum Stillstand gebracht wird. This short coagulation time is necessary so that begins after application of such a mixture to a bleeding site, the clotting rapidly and the blood flow is thereby brought to a halt. Der Nachteil einer solchen Vorgangsweise ist die schlechte Durchmischung der Fibrinogenlösung mit der Thrombinlösung, da die hohe Viskosität des Gemisches eine komplette Durchmischung in kurzer Zeit nicht erlaubt. The disadvantage of such an approach is the poor mixing of the fibrinogen solution with the thrombin solution, since the high viscosity of the mixture a complete mixing in a short time not allowed. Dies bewirkt eine inhomogene Gerinnung und damit eine Benachteiligung der biomechanischen Qualität. This causes a non-homogeneous coagulation and thus penalize the biomechanical quality.

Andererseits besteht bei der Anwendung von Fibrinogen-Thrombingemischen, die nicht der Blutstillung, sondern der Klebung von Gewebeteilen dienen, meistens die Notwendigkeit, das Auftreten der Gerinnung im Fibrinogen-Thrombingemisch zu verzögern, um die zu klebenden Gewebeteile oder Abdichtungen optimal adaptieren zu können, bevor die Gerinnung eintritt. On the other hand, in the application of fibrinogen-thrombin mix, are not used for hemostasis, but the bonding of tissues, mostly the need to delay the occurrence of clotting in the fibrinogen-thrombin mixture to adapt to adhesive tissue parts or seals optimally before clotting occurs. Dies wird derzeit durch Reduktion der Thrombinmenge auf ein Zehntel bis auf ein Hundertstel der für die Hämostase verwendeten Quantität Thrombin versucht, allerdings mit dem Nachteil, dass nicht alles vorhandene Fibrinogen in Fibrin und Faktor XIII in Xllla übergeführt werden kann. This is currently attempted by reducing the amount of thrombin thrombin to between one tenth and one hundredth of the quantity used for the hemostasis, but with the disadvantage that not all existing fibrinogen can be converted to fibrin and Factor XIII in XIIIa. Auch bei dieser Vorgangsweise kann keine optimale Ausbildung eines Fibringerinnsels erhalten werden, da die niedere Thrombinkonzentration nicht ausreicht, um TAFI in TAFIa überzuführen. Also in this procedure may not optimum formation of a fibrin clot can be obtained because the low thrombin concentration is not sufficient to convert TAFI in TAFIa.

Eine weitere Problematik stellt die Verwendung von bovinem Material zur Herstellung von thrombinhältigen Arzneimitteln dar. Da die mögliche Übertragung von Prionen durch jegliche, von Rindern verwendete Organe nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden kann, ist heute die Anwendung von bovinem Thrombin stark zurück gegangen. Another problem is the use of bovine material for the production of thrombin drugs. Since the possible transmission of prions by any, used by cattle organs can not be excluded with certainty, today the use of bovine thrombin has been greatly reduced.

Bovines Thrombin hat den weiteren Nachteil, dass es für andere Spezies antigen wirkt und Allergien und Anaphylaxien verursachen kann. Bovine thrombin has the further disadvantage that it is antigenic for other species and can cause allergies and anaphylaxis. Des Weiteren wurden auch Blutgerinnungsstörungen bei mit bovinem Thrombin behandelten Patienten beobachtet, da Thrombin die Bildung von Antikörpern gegen Gerinnungsfaktoren verursachen kann, die mit menschlichen Gerinnungsfaktoren kreuzreagieren und so die Blutgerinnung verzögern können. Furthermore, were also bleeding disorders in patients treated with bovine thrombin patients observed since thrombin can cause the formation of antibodies against coagulation factors which cross-react with human coagulation factors and so can delay blood clotting.

Bei der Herstellung von Thrombin aus Prothrombin wurde wegen der guten Ausbeute häufig zur Aktivierung des Thrombins Thromboplastin, das aus tierischem Ausgangsmaterial, meist Rinderhirn, hergestellt war, verwendet. In the production of thrombin from prothrombin was because of the good yield frequently for activation of thrombin thromboplastin was prepared from animal source material, mostly bovine brain, is used. Wegen der Möglichkeit der Übertragung von Prionen wird Thromboplastin aus tierischem Ausgangsmaterial weitgehend zur Thrombinherstellung ausgeschlossen und eine schlechtere Ausbeute von Thrombin in Kauf genommen. Because of the possibility of transmission of prions thromboplastin is excluded from animal starting material largely to thrombin production and taken a poorer yield of thrombin in purchasing. Die Erfindung stellt sich daher ua die Aufgabe, eine virussichere, thrombingenerierfähige, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung zur Verfügung zu stellen, die The invention thus provides, inter alia, the task to provide a virus-safe, generating thrombin, pharmaceutical preparation available,

1. zu einem thrombingenerierfähigen Arzneimittel formuliert und mit einem fibrinogenhältigen Arzneimittel vermischt, eine komplette und homogene Mischung dieser Komponenten ergibt, ohne dass eine komplette Vermischung durch zu schnelle Gerinnung verhindert wird. 1. formulated into a thrombin drugs and mixed with a fibrinogen-containing medicinal product, a complete and homogeneous mixture of these components results in without a complete mixing is prevented by too rapid coagulation. Es soll aber nicht nur die vollständige Durchmischung, sondern auch die Adaptierung der zu versiegelnden oder abzudichtenden Gewebsteile ermöglicht werden, bevor die Gerinnung einsetzt. But it is not only the complete mixing, but also the adaptation to be sealed or the sealed portions of tissue are possible before clotting begins. Die Thrombinbildung muss sich auch nach der einsetzenden Gerinnung weiter fortsetzen, um alles im Gerinnsel vorhandene Fibrinogen, Faktor XIII und TAFI in Fibrin, Faktor Xllla und TAFIa überzuführen, um einen dauerhaften, durch Fibrin gebildeten Wundverschluss zu gewährleisten, und in der The thrombin must also after the onset of clotting to continue to convert all existing clot fibrinogen, Factor XIII and TAFI into fibrin, factor XIIIa and TAFIa, in order to ensure a lasting, formed by fibrin wound closure, and in the

2. das enthaltene Prothrombin möglichst vollständig in Thrombin übergeführt und dieses nach weiterer Reinigung zu einem thrombinhältigen Arzneimittel verarbeitet werden kann. 2. as completely as possible the prothrombin contained in thrombin and it can be processed for further purification to a thrombin drugs. Dieses Arzneimittel kann als solches oder gemeinsam mit anderen, fibrinogenhältigen Arzneimitteln verwendet werden. This medicine can be used as such or together with others, fibrinogen-containing medicinal use.

Die aus den thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitungen hergestellten Arzneimittel sollen je nach Anwendung bei einer bestimmten Spezies nur allogenes Material dieser Spezies enthalten und ebenso sollen bei der Herstellung nur speziesspezifische Proteine verwendet werden. The drug produced from the thrombin, pharmaceutical drug preparations are included depending on the application at a particular species only allogenic material of this species and also are in the production only species-specific proteins. Alle verwendeten Ausgangsmaterialien und Hilfsmaterialien sollen die Übertragungsmöglichkeit von Prionen ausschließen. All raw materials and auxiliary materials used should exclude the possibility of transfer of prions. Die Thrombingenerierung aus Prothrombin in vivo und in vitro soll so vollständig wie möglich erfolgen, da nur das im Gerinnsel vorhandene Prothrombin zur Bildung von weiterem Thrombin in dem bereits geronnenen Fibrinogen zur Verfügung steht. The thrombin from prothrombin in vivo and in vitro is as complete as possible in as only the existing clot prothrombin to form further thrombin is in the already coagulated fibrinogen available.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Wirkstoffzubereitung dient zur Herstellung eines thrombingenerierfähigen oder thrombinhältigen Arzneimittels und ist dadurch gekennzeichnet, dass sie enthält: The inventive pharmaceutical preparation is used for preparing a thrombin or medicinal product containing thrombin and is characterized in that it comprises:

(A) aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenes Prothrombin (Gerinnungsfaktor II), (B) aus Plasma oder gentechnologisch gewonnene Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, die zumindest teilweise in aktiviertem Zustand vorliegen können, und aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor Xla, und (A) from plasma or genetically derived prothrombin (coagulation factor II), (B) from plasma or obtained by gene technology coagulation factors V, VIII, IX, X, which may at least partially be present in activated state, and from plasma or recombinant coagulation factor XIa, and

(C) prionensichere, gerinnungsaktive Phospholipide, welche gegebenenfalls in Liposomen enthalten sind. (C) prion-safe, coagulation-active phospholipids, which are optionally contained in liposomes.

Die erfindungsgemäße Wirkstoffzubereitung enthält bevorzugt aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor VII oder ein Gemisch von aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktoren VII und Vlla. The drug formulation of the invention preferably from plasma or obtained by genetic engineering containing coagulation factor VII or a mixture of plasma or recombinant coagulation factors VII and VIIa. Femer enthält sie bevorzugt einen gentechnologisch hergestellten Tissue Faktor als solchen oder in relipidierter Form. Furthermore preferably contains a genetically engineered tissue factor as such or in relipidated form.

Die erfindungsgemäße Wirkstoffzu bereitungkann auch aus zwei oder mehreren Plasmafraktionen und den gerinnungsaktiven Phospholipiden bestehen, wobei die einzelne Plasmafraktion einen oder mehrere Gerinnungsfaktoren bzw. aktivierte Gerinnungsfaktoren der Komponenten (A) und (B) enthält. The Wirkstoffzu inventive preparation can also consist of two or more plasma fractions and the coagulation-active phospholipids exist, the individual plasma fraction containing one or more coagulation factors or activated coagulation factors of the components (A) and (B). Das gesamte ' The entire '

Plasmafraktionengemisch muß jedoch alle, in den Komponenten (A) und (B) enthaltenen Gerinnungsfaktoren bzw. aktivierte Gerinnungsfaktoren enthalten, wobei vorzugsweise noch Tissue-Faktor zugesetzt wird. Plasma fraction mixture must, however, all contained in the components (A) and (B) coagulation factors or activated coagulation factors contained, preferably tissue factor is also added.

Die Gerinnungsfaktoren sind insbesondere ausschließlich aus Blutplasma einer bestimmten Säugetierspezies oder aus den entsprechenden gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktoren oder aktivierten Gerinnungsfaktoren, einschließlich Tissue Faktor, hergestellt. The coagulation factors are in particular exclusively from the blood plasma of a certain mammalian species or from the corresponding recombinant coagulation factors or activated coagulation factors, including tissue factor prepared.

In der erfindungsgemäßen pharmazeutische Wirkstoffzubereitung sind vorteilhaft das Prothrombin, die Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, Xla und gegebenenfalls die Gerinnungsfaktoren VII und Vlla, sowie der Tissue Faktor durch Virusinaktivierung und/oder Virusabreicherung virussicher. In the pharmaceutical preparation according to the invention are advantageous virally safe prothrombin, coagulation factors V, VIII, IX, X, XIa, and optionally coagulation factors VII and VIIa, as well as the tissue factor by virus inactivation and / or virus depletion.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Wirkstoffzubereitung kann in tiefgefrorener oder gefriergetrockneter Form vorliegen. The inventive pharmaceutical preparation may be present in deep-frozen or freeze-dried form.

Die Erfindung betrifft ferner ein thrombingenerierfähiges Arzneimittel, welches aus einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung herstellbar ist. The invention further relates to a thrombingenerierfähiges drug which can be manufactured from a pharmaceutical preparation according to the invention.

Das erfindungsgemäße thrombingenerierfähige Arzneimittel kann in tiefgefrorenem oder in gefriergetrocknetem Zustand vorliegen. The generating thrombin pharmaceutical invention may be in frozen or in freeze-dried state. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen thrombingenerierfähigen Arzneimittels ist dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Thrombin in einer solchen Menge enthält, dass es nach Auftauen oder Rekonstitution nicht mehr als 1 Einheit Thrombin pro ml enthält. A preferred embodiment of thrombin medicament of the invention is characterized in that it additionally contains thrombin in an amount such that it contains thrombin per ml after thawing or reconstitution no more than 1 unit.

Die Erfindung betrifft ferner ein thrombinhältiges Arzneimittel, das aus einer erfindungsgemäßen thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung herstellbar ist. The invention further relates to a thrombin and medicinal product which is preparable from a thrombin, pharmaceutical preparation according to the invention. Es kann in tiefgefrorenem oder gefriergetrockneten Zustand vorliegen. It may be present in deep-frozen or freeze-dried state.

Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittelgemisch, das vor seiner Anwendung durch Vermischen eines erfindungsgemäßen Arzneimittels mit einem fibrinogenhältigen Arzneimittel innerhalb von 30 bis 300 Sekunden gerinnt. The invention also relates to a pharmaceutical mixture that coagulates before its use by mixing a medicinal product according to the invention with a medicinal product containing fibrinogen within 30 to 300 seconds.

Die Erfindung betrifft darüberhinaus auch ein thrombinhältiges Arzneimittel, das mit dem obigen Arzneimittelgemisch versetzt, innerhalb von 3 bis 10 Sekunden gerinnt. The invention furthermore relates to a thrombin and medicine combined with the above drug mixture coagulates within 3 to 10 seconds.

Eine bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen thrombinhältigen pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße thrombingenerierfähige Wirkstoffzubereitung mit Ca-Ionen versetzt wird, wobei ein thrombinhältiges Produkt gebildet wird, welches anschließend chromatographisch gereinigt wird. A preferred process for preparing a thrombin pharmaceutical preparation according to the invention is characterized in that an inventive generating thrombin preparation of active compound is mixed with Ca-ions, wherein a product is formed containing thrombin, which is subsequently purified by chromatography.

Eine vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Wirkstoffzubereitung durch Virusinaktivierung während oder nach der Thrombinbildung, sowie durch Virusabreicherung nach abgeschlossener Thrombinbildung virussicher gemacht wird. An advantageous embodiment of the method is that the active compound is made virally safe by virus inactivation during or after thrombin generation, as well as viral clearance after completion of thrombin.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Pro- Kofaktorenkonzentrates enthaltend die Gerinnungsfaktoren V und VIII, und ist dadurch gekennzeichnet, dass aus Plasma gewonnenes Kryopräzipitat gelöst und aus der Lösung Fibrinogen abgetrennt wird, wobei eine die Gerinnungsfaktoren V und VIII hältige Lösung erhalten wird, welche mit Calciumchlorid versetzt werden kann. The invention also relates to a process for the preparation of a product Kofaktorenkonzentrates containing the coagulation factors V and VIII, and is characterized in, is that plasma-dissolved obtained cryoprecipitate and separated from the solution of fibrinogen, a clotting factors V and VIII containing solution is obtained, which can be treated with calcium chloride.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren betrifft die Herstellung eines Gerinnungsfaktor-XI-hältigen Prothrombinkomplexkonzentrates enthaltend die Gerinnungsfaktoren II, VII, Vlla, IX, X und XI, wobei pro 1 ,0 μg Prothrombin mindestens 0,030 μg Gerinnungsfaktor Xla enthalten sind, und ist dadurch gekennzeichnet, dass aus Plasma gewonnener Kryopräzipitatüberstand an einem Anionenaustauscher adsorbiert und nach Waschen des Adsorbats und Lagerung in der Kälte Gerinnungsfaktor-Xla-hältiger Prothrombinkomplex eluiert wird. Another method of the invention relates to the production of a clotting factor XI-containing Prothrombinkomplexkonzentrates containing the coagulation factors II, VII, VIIa, IX, X and XI, wherein Pro 1, 0 ug prothrombin at least 0.030 ug coagulation factor XIa are included, and is characterized in that adsorbed plasma-derived cryo on an anion exchanger and eluted after washing the adsorbate and storage in the cold coagulation factor XIa hältiger prothrombin.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass eine praktisch komplette, zeitlich steuerbare Bildung von α-Thrombin aus virussicherem Prothrombin durch einen virussicheren intrinsic Tenase-Prothrombinasekomplex erfolgt. The invention is based on the realization that a practically complete, temporally controllable formation of α-thrombin takes place from virally safe prothrombin by a virally safe intrinsic tenase prothrombinase. Der intrinsic Tenase- Prothrombinasekomplex wird durch Aktivierung der entsprechenden virussicheren, bzw. virussicher gemachten Gerinnungsfaktoren in Gegenwart optimaler Ca- lonenkonzentrationen mit prionensicheren, gerinnungsaktiven Phospholipiden und der virussicheren Aktivatorsubstanz Gerinnungsfaktor Xla und/oder die virussicheren Aktivatorsubstanzen Gerinnungsfaktor Vlla und Tissue-Faktor gebildet. The intrinsic tenase prothrombinase is by activating the virus-safe, or virus-safe made coagulation factors ion concentrations in the presence of optimal Ca prion safe with, coagulation-active phospholipids and the virally safe activator substance coagulation factor XIa and / or the virally safe activator substances coagulation factor VIIa and tissue factor formed.

Die Aufgabenstellung wird somit erfindungsgemäß mit einer aus drei Komponenten (Komponenten A, B und C) bestehenden, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung zur Herstellung eines virussicheren, thrombingenerierfähigen oder thrombinhältigen Arzneimittels gelöst, wobei die pharmazeutische Wirkstoffzubereitung dadurch gekennzeichnet ist, dass The problem is solved according to the invention therefore a three components (components A, B and C) existing, pharmaceutical preparation for producing a virus-safe, thrombin or medicinal product containing thrombin, the pharmaceutical preparation is characterized in that

die Komponente A ein aus Plasma oder gentechnologisch hergestelltes, virussicheres Prothrombin als pharmazeutisch aktive Substanz, component A is a prepared from plasma or by genetic engineering, virus-safe prothrombin as a pharmaceutically active substance,

die Komponente B virussichere, aus Plasma oder gentechnologisch gewonnene Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, Xla als pharmazeutisch aktive Substanzen und, falls zusätzlich zur Bildung der Prothrombinase- und intrinsic Tenasekomplexe auch die Bildung von extrinsic Tenasekomplex veranlasst werden soll, noch die virussicheren Gerinnungsfaktoren VII und/oder Vlla sowie Tissue Faktor als pharmazeutisch aktive Substanzen, und component B virus-safe, from plasma or obtained by gene technology coagulation factors V, VIII, IX, X, XIa as pharmaceutical active substances and, if appropriate, additionally to the formation of the prothrombinase and intrinsic Tenasekomplexe the formation of extrinsic tenase complex is to be initiated, or the virally safe coagulation factors VII and / or VIIa as well as tissue factor as pharmaceutical active substances, and

die Komponente C vollsynthetisch hergestellte, gerinnungsaktive Phospholipide als pharmazeutisch aktive Substanzen mit einem über 15° C liegenden Umwandlungspunkt der parakristallinen in die flüssig kristalline Form enthält. lying phospholipids component C fully synthetic, coagulant as pharmaceutically active substances with a more than 15 ° C. transition point of para-crystalline containing the liquid-crystalline form. Ein Gemisch der in den Komponenten (A) und (B) enthaltenen, pharmazeutisch aktiven Substanzen, dh die Gerinnungsfakoren bzw. aktivierten Gerinnungsfaktoren, kann auch durch Mischen zweier oder mehrerer Plasmafraktionen erhalten werden, in denen alle erforderlichen, pharmazeutisch aktiven Substanzen enthalten sind und denen Tissue-Faktor erforderlichenfalls zugesetzt werden kann. A mixture of the components (A) and (B) contained, pharmaceutically active substances, ie the Gerinnungsfakoren or activated coagulation factors, may also be obtained by mixing two or more plasma fractions, in which all necessary pharmaceutical active substances are contained and which tissue factor can be added if necessary.

Nach Mischung der drei Komponenten und Zugabe einer optimalen CaCI 2 -Menge wird temperaturabhängig zwischen 0 ° und 40 ° C Thrombin gebildet, wobei die Geschwindigkeit der Thrombinbildung mit steigender Temperatur zunimmt. After mixing of the three components and adding an optimum CaCl 2 quantity is temperature dependent thrombin formed between 0 ° and 40 ° C, the rate of thrombin formation increases with increasing temperature.

Die Herstellung der Komponente A erfolgt durch Auflösen von gefriergetrocknetem, virussicherem Prothrombin oder Auftauen einer eingefrorenen Lösung von virussicherem Prothrombin und der Zubereitung einer Prothrombinstammlösung mit 10 - 100 Einheiten Prothrombin pro mL und einem Gehalt von 0,1% Natriumzitrat bei pH 7,3. The preparation of component A is carried out by dissolving a freeze-dried, virus safe prothrombin or thawing a frozen solution of virally safe prothrombin and the formulation of a prothrombin stock with 10 to 100 units prothrombin per mL and a content of 0.1% sodium citrate at pH 7.3.

Die Wertbemessung der Stammlösung erfolgt durch Bestimmung der Prothrombineinheiten mit Hilfe eines Gerinnungsfaktor-Il-Mangelplasmas, mit dem eine Eichkurve unter Verwendung eines Referenz-Normalplasmas erstellt wurde. The asset valuation of the stock solution is made by determining the prothrombin units using a clotting factor II-deficient plasma, with a calibration curve was established using a reference normal plasma.

Mit Hilfe von Ecarin wird die maximale Menge Meizothrombin/Thrombin bestimmt, die von einer Einheit Prothrombin generierbar ist. With the help of the maximum amount Ecarin meizothrombin / thrombin is determined that can be generated by a unit of prothrombin. Die Meizothrombin/ Thrombinbestimmung erfolgt mit dem chromogenen Substrat S-2238. The meizothrombin / thrombin determination is done with the chromogenic substrate S-2238th Weiters wird die Menge Thrombin in NIH-Einheiten bestimmt, die aus einer Einheit Prothrombin nach Thromboplastinzusatz generiert wird. Furthermore, the amount of thrombin is determined in NIH units that is generated from a unit of prothrombin by Thromboplastinzusatz. Eine entsprechende Standardkurve zur Thrombinbestimmung wird mit Hilfe des internationalen α-Thrombinstandards errichtet. A corresponding standard curve for thrombin is built using the international α-Thrombinstandards.

Die Komponente B wird durch Vermischen von Stammlösungen virussicherer Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, Xla, sowie der Gerinnungsfaktoren VII, Vlla und Tissue Faktor hergestellt. Component B is prepared by mixing stock solutions virus safe coagulation factors V, VIII, IX, X, XIa, and coagulation factors VII, VIIa and tissue factor. Die Konzentrationen der einzelnen Gerinnungsfaktoren in ihren Stammlösungen liegen zwischen 10 - 100 Einheiten pro mL; The concentrations of the individual coagulation factors in their stock solutions lie between 10-100 units per mL; die Tissue-Faktor- Stammlösung enthält 25 μg/mL. the tissue factor stock solution contains 25 micrograms / mL. Anstelle einer Stammlösung von Gerinnungsfaktor V kann auch eine Stammlösung von Gerinnungsfaktor Va verwendet werden. Instead of a stock solution of coagulation factor V can also be a stock solution of coagulation factor Va be used. Der Gehalt eines einzelnen Gerinnungsfaktors in einer Stammlösung wird mit Hilfe der entsprechenden Mangelplasmen bestimmt und zur Bestimmung jedes einzelnen Gerinnungsfaktors eine Standardkurve mit gepooltem Normalplasma errichtet. The content of a single coagulation factor in a stock solution is determined using the corresponding deficient plasmas, and built a standard curve with pooled normal plasma to determine each individual coagulation factor.

Um festzustellen, welche Mengen der einzelnen Gerinnungsfaktoren erforderlich sind, um noch eine optimale Thrombingenerierung zu erhalten, werden Mischungen der Komponenten A und B hergestellt, die je eine Einheit der Gerinnungsfaktoren II, V, VIII, IX, X, Xla und II, sowie Xla, VII, Vlla mit 2,5 μg Tissue Faktor pro mL des Ansatzes enthalten. In order to determine what amounts of the individual coagulation factors are necessary to still obtain an optimum thrombin generation, mixtures of the components A and B are prepared, each having a unit of the coagulation factors II, V, VIII, IX, X, XIa, and II, and Xla , VII, VIIa 2.5 ug tissue factor contained per mL of the approach. Nach Zusatz der Liposomenemulsion und nachfolgender Rekalzifizierung wird die Thrombinbildung bei 26° C in entsprechenden Zeitintervallen bestimmt. After addition of the liposome emulsion and subsequent recalcification thrombin formation is determined at 26 ° C in appropriate time intervals. Ebenso wird in diesen Ansätzen der Prothrombinverbrauch und die Bildung von ß- und γ-Thrombin festgestellt. Likewise, the prothrombin and the formation of ß and γ-thrombin is determined in these approaches. Die Überführung von Prothrombin in Thrombin wird in Anwesenheit von 0,1% PEG vorgenommen und jene Mengen Gerinnungsfaktoren und Tissue Faktor pro mL bestimmt, die erforderlich sind, um noch eine optimale Thrombingenerierung zu erreichen. The conversion of prothrombin to thrombin is carried out in the presence of 0.1% PEG and those amounts clotting factors and tissue factor per mL determined necessary to still achieve an optimum thrombin generation.

Gemische von Komponenten A und B können auch aus zwei oder mehreren Plasmafraktionen erhalten werden, soweit sie alle Gerinnungsfaktoren und aktivierten Gerinnungsfaktoren, die zur Bildung der intrinsic Tenase- und Prothrombinasekomplexe erforderlich sind, als pharmazeutisch aktive Substanzen enthalten. Mixtures of components A and B can also be obtained from two or more plasma fractions, to the extent they contain all coagulation factors and activated coagulation factors necessary for the formation of the intrinsic tenase and Prothrombinasekomplexe as pharmaceutically active substances. Die Aktivierung des intrinsic Tenase-Pathways erfolgt entweder durch den Gerinnungsfaktor Xla oder über den extrinsic Tenase-Pathway, insbesondere wenn kein TFPI vorhanden ist. The activation of the intrinsic tenase pathway is either by the coagulation factor XIa or via the extrinsic tenase pathway, particularly when TFPI is not present. Es ist auch möglich, den intrinsic Tenase-Pathway gleichzeitig durch den Gerinnungsfaktor Xla und über den extrinsic Tenase-Pathway zu aktivieren. It is also possible to activate the intrinsic tenase pathway simultaneously by the coagulation factor XIa and via the extrinsic tenase pathway. In einem Gemisch von Gerinnungsfaktoren, die zur Bildung des intrinsic Tenasekomplexes erforderlich sind, kann sowohl durch Zusatz, bzw. Vorhandensein des Gerinnungsfaktors Xla bestimmt werden, ob mindestens 90% des vorhandenen Prothrombins in Thrombin übergeführt werden, und wenn dies nicht der Fall ist, welche Mengen Faktor Vlla und Tissue Faktor erforderlich sind, um eine solche praktisch vollständige Umsetzung von Prothrombin in Thrombin zu erreichen. In a mixture of coagulation factors which are necessary for forming the intrinsic tenase complex, it can be determined both by the addition of, or presence of coagulation factor XIa, whether at least 90% of the prothrombin to be converted into thrombin, and if this is not the case, which are amounts of factor VIIa and tissue factor required to achieve such virtually complete conversion of prothrombin to thrombin. Zur Thrombingenerierung wird ein Überschuss von gerinnungsaktiven Phospholipiden verwendet. For thrombin, a surplus of coagulation-active phospholipids is used. Die Aktivierung wird entweder bei 26° C oder 37° C und einer optimalen Ca-Ionenkonzentration durchgeführt. The activation is carried out either at 26 ° C or 37 ° C and an optimum Ca-ion concentration. Die Virussicherheit der verwendeten Gerinnungsfaktoren, bzw. der gerinnungsfaktorhältigen Plasmafraktionen, wie auch des gentechnologisch gewonnenen Tissue Faktors wird durch Virusinaktivierung, zB nach dem Solvent/Detergent-Verfahren, und nachfolgende Virusabreicherung mittels Nanofiltration erreicht. The viral safety of coagulation factors used, or the gerinnungsfaktorhältigen plasma fractions, as well as the genetically derived tissue factor is achieved by virus inactivation, for example by the solvent / detergent method and subsequent virus removal by nanofiltration.

Die Komponente C wird aus Mischungen von vollsynthetischen, und dadurch prionensicheren, Cholin- oder Serinphospholipiden oder aus Cholin-Serin- Äthanolaminphospholipiden hergestellt. Component C is made of mixtures of fully synthetic, and prion-safe by choline or Serinphospholipiden or choline-serine Äthanolaminphospholipiden. Es werden nur Phospholipide verwendet, deren Phasenübergangstemperatur vom parakristallinen Gelzustand in den flüssigkristallinen Zustand zwischen 15° und 40° C liegt. Only phospholipids are used whose phase transition temperature is from para-crystalline gel in the liquid crystalline state between 15 ° and 40 ° C. Aus den Phospholipidgemischen können Emulsionen hergestellt werden, die Liposome mit einem Durchmesser von 20 nm bis 1.000 nm aufweisen und die polaren Anteile der Phospholipide in einer äußeren Membran ausgebildet haben. From the phospholipid emulsions can be prepared having liposomes with a diameter of 20 nm to 1,000 nm, and the polar parts of the phospholipids have formed in an outer membrane. Mit Hilfe von Temperaturen zwischen 50° C und 100° C können Liposome mit einem Durchmesser von 20 nm - 200 nm hergestellt werden. Using temperatures between 50 ° C and 100 ° C liposomes can with a diameter of 20 nm - 200 nm are produced. Solche Emulsionen können mit Hilfe bakteriendichter Filter sterilisiert, steril abgefüllt, getrocknet und unter Stickstoff aufbewahrt und gelagert werden. Such emulsions can be sterilized using bacteria-proof filter, sterile packaged, dried and stored and stored under nitrogen. Durch Zusatz von Wasser können die gefriergetrockneten Emulsionen rekonstituiert werden. By adding water, the freeze-dried emulsions can be reconstituted.

Die Virussicherheit der verwendeten Gerinnungsfaktoren und des nicht relipidierten Tissue Faktors wird durch Virusinaktivierung, vorzugsweise mit dem Solvent/ Detergent-Verfahren und nachfolgender, weitgehender Entfernung des Solvent/Detergent erreicht. The viral safety of coagulation factors used and not relipidated Tissue factor is achieved by virus inactivation, preferably with the solvent / detergent method and subsequent, substantial removal of the solvent / detergent. Quantitierbare Spuren des verwendeten Solvente, Trinitrobutylphosphat, und des Detergents, Tween 80 verbleiben in der thrombinhältigen Lösung. Quantitierbare traces of Solvente used Trinitrobutylphosphat, and Detergents, Tween 80 remain in the thrombin solution. Die Virusabreicherung erfolgt vorzugsweise durch Nanofiltration nach vorheriger Klärfiltration, die stufenweise mit immer enger porigen Filtern erreicht wird, beginnend mit einer Porenweite von 5.000 nm, absteigend bis 35 nm. Vorzugsweise kann nach der Filtration durch einen 35 nm Nanofilter noch durch Nanofilter mit Porenweiten von 20 nm und 15 nm filtriert werden. The virus depletion preferably by nanofiltration after prior clarifying filtration, which is gradually achieved with ever closer porous filters, beginning with a pore size of 5.000 nm, descending to 35 nm. Preferably, after filtration through a 35nm nanofiltration even through Nano filter with pore sizes of 20 nm and 15 nm are filtered.

Die Thrombingenerierung dieser pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung ist stark temperaturabhängig. Thrombin generation of this pharmaceutical preparation is strongly temperature dependent. Daher ist es möglich, durch Vermischen der Komponenten A, B, und C, selbst bei optimaler Ca-Ionenkonzentration, die Thrombinbildung aus Prothrombin hintanzuhalten, sofern bei niederen Temperaturen um den Gefrierpunkt gearbeitet wird. Therefore, it is possible, by mixing the components A, B, and C, even at optimum Ca-ion concentration, disregard hold the thrombin formation from prothrombin, if carried out at low temperatures around freezing point. Zur Lagerung kann die erfindungsgemäße Wirkstoffzubereitung tiefgefroren werden. For storage, the preparation of active compound of the invention can be frozen. Sie kann aber auch gefriergetrocknet und bei Temperaturen zwischen 0° C und 25° C gelagert werden. but they can also be freeze dried and stored at temperatures between 0 ° C and 25 ° C.

Die thrombingenerierfähige, pharmazeutische Wirkstoffzubereitung kann bei niederen Temperaturen zu einem Arzneimittel mit einer Thrombin- generierungskapazität von vorzugsweise 100 bis 1.000 Einheiten Thrombin pro mL formuliert, steril filtriert und portioniert abgefüllt werden. The generating thrombin, pharmaceutical preparation can at low temperatures to a drug having a thrombin generation capacity of preferably 100 to 1,000 units of thrombin per mL formulated, sterile filtered and filled in portions.

Die thrombingenerierfähige, pharmazeutische Wirkstoffzubereitung wird auch zur Herstellung von thrombinhältigen Arzneimitteln verwendet. The generating thrombin, pharmaceutical preparation is also used for the production of thrombin drugs. Die Thrombingenerierung wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 20° C bis 40° C durchgeführt. Thrombin generation is preferably carried out at temperatures between 20 ° C to 40 ° C.

Für die Herstellung von Thrombin aus einer thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung, bei der noch keiner oder nicht alle Komponenten einer Virusinaktivierung unterzogen waren, kann die Virusinaktivierung während oder nach der Thrombingenerierung durchgeführt werden. For the production of thrombin from a thrombin, pharmaceutical preparation in which none yet or not all components of a virus inactivation were subjected to virus inactivation can be performed during or after thrombin generation. Die Entfernung der virusinaktivierenden Substanzen kann gemeinsam mit einer anschließenden Reinigung des generierten Thrombins erfolgen. The removal of the virus-inactivating substances can be carried out together with a subsequent purification of the generated thrombin. Es ist möglich, eine thrombinhältige, pharmazeutische Wirkstoffzubereitung mit einem Thrombingehalt von 1.000 bis 10.000 Einheiten pro mL zu erhalten, die durch Klärfiltrationen und nachfolgende Nanofiltration virusabgereichert werden kann. It is possible to obtain a thrombin-containing pharmaceutical preparation of active compound with a thrombin content of 1,000 to 10,000 units per ml, which can be virusabgereichert by Klärfiltrationen and subsequent nanofiltration. Die virussichere Wirkstoffzubereitung kann dann formuliert und sterilfiltriert zu einem Arzneimittel verarbeitet werden. The virus-safe preparation of active compound can be formulated and sterile filtered are processed into a pharmaceutical.

Die Verwendung von thrombingenerierfähigen und/oder thrombinhältigen Arzneimitteln gemeinsam mit fibrinogenhältigen Arzneimitteln kann zur Hämostase, zur Gewebeklebung in Kombination mit Nähten oder zur Abdichtung von Hohlräumen und Gefäßen gegen Austritt von Gasen und Flüssigkeiten verwendet werden. The use of thrombin and / or thrombin drugs together with medicinal products containing fibrinogen may be used for hemostasis, tissue sealing in combination with the seams or for sealing cavities and vessels against leakage of gases and liquids.

Durch Vermischen eines thrombingenerierfähigen Arzneimittels mit einem fibrinogenhältigen Arzneimittel und eventuellen Zusatz geringer Mengen Thrombin kann die Gerinnungszeit eines solchen Gemisches auf 30 bis 300 Sekunden eingestellt werden. By mixing a drug with a thrombin fibrinogen drug and eventual addition of small amounts of thrombin clotting time of such a mixture of 30 to 300 seconds can be set. Dadurch ist eine komplette Vermischung der Arzneimittel selbst bei hoher Viskosität einer solchen Mischung möglich. This is a complete mixing of the drug possible even at high viscosity of such a mixture. Ebenso steht nach vollständiger Durchmischung der Arzneimittel ein genügend langer Zeitraum für die erforderliche Adaptierung der Gewebeteile, die geklebt oder abgedichtet werden sollen, zur Verfügung. Likewise is after complete mixing of the drug is a sufficiently long period for the necessary adaptation of the tissue parts to be glued or sealed, available. Nach Eintreten der Gerinnung kommt es dann - ähnlich wie bei dem physiologischen Gerinnungsvorgang - zu einer weiteren Bildung von Thrombin im bereits teilweise geronnenen Fibrinogen, so dass nach einiger Zeit - bis zu mehreren Stunden - praktisch alles Prothrombin in Thrombin umgewandelt ist und dieses das gesamte Fibrinogen in Fibrin überführt. Following the occurrence of clotting is it then - similar to the physiological coagulation process - to a further formation of thrombin in the already partially coagulated fibrinogen, so that after some time - up to several hours - virtually anything prothrombin is converted into thrombin and this the entire fibrinogen converted into fibrin. Eine solche fortgesetzte Thrombinbildung ermöglicht nicht nur die homogene Ausbildung von Fibrin im bereits geronnenen Fibrinogen, sondern auch die gleichförmige Aktivierung von Faktor XIII und die dadurch einsetzende Quervernetzung des gebildeten Fibrins, ebenso wie die Aktivierung von TAFI und die dadurch erfolgende Abspaltung der endständigen Lysinreste des Fibrins. Such continued thrombin generation allows not only the homogeneous formation of fibrin in the already coagulated fibrinogen, but also the uniform activation of factor XIII and the consequent onset of cross-linking of fibrin formed, as well as the activation of TAFI and thereby made to removal of the terminal lysine residues of fibrin ,

Die Anwendung fibrinogenhältiger Gemische zur Hämostase erfordert eine sehr kurze Gerinnungszeit. The application of fibrinogen-mixtures for hemostasis requires a very short coagulation time. Um diese zu erreichen und trotzdem eine homogene Ausbildung des geronnenen Fibrinogens und die Aktivierung von Zymogenen, wie Faktor XIII und/oder TAFI, zu gewährleisten, können fibrinogenhältige Arzneimittel komplett mit thrombingenerierfähigen Arzneimitteln vermischt werden und solche Gemische dann zusammen mit einer Thrombinlösung, die einen hohen Gehalt an Thrombin aufweist, auf die blutende Stelle aufgebracht werden. In order to achieve these and still guarantee a homogenous formation of the coagulated fibrinogen and the activation of zymogens such as factor XIII and / or TAFI, fibrinogen-containing medicinal products can be mixed completely with thrombin drugs and such mixtures are then added together with a thrombin solution and the higher content of thrombin which are applied to the bleeding site. Obwohl die einsetzende Gerinnung zunächst nicht zu einem homogenen Fibrinklot führt, setzt die nachfolgende Thrombingenerierung des im Fibrinklot enthaltenen thrombingenerierfähigen Arzneimittels die Überführung von Prothrombin in Thrombin fort, so dass es schließlich zu einem homogen geronnenen Fibrinklot mit homogen verteiltem Faktor Xllla und homogen verteiltem TAFIa kommt. Although the onset of coagulation does not immediately lead to a homogenous fibrin clot, constitutes subsequent thrombin generation of thrombin drug contained in the fibrin clot continues the conversion of prothrombin to thrombin, so that it finally comes to a homogenous coagulated fibrin clot with homogenously distributed factor XIIIa and homogenously distributed TAFIa. Dadurch ist es möglich, auch bei schnell gerinnenden Mischungen von thrombinhältigen mit fibrinogenhältigen Arzneimitteln eine ausgezeichnete Fibrinstruktur und eine besondere Resistenz gegenüber fibrinolytischen Einflüssen zu erzielen. This makes it possible, even with rapidly coagulating mixtures of thrombin to achieve an excellent fibrin structure and a special resistance against fibrinolytic influences with medicinal products containing fibrinogen.

Eine weitere Möglichkeit, in einem thrombingenerierfähigen Gerinnungsfaktorengemisch, bestehend aus Prothrombinkomplex und Faktor VIII, eine spontane Thrombinbildung auszulösen, ist die Zugabe von Faktoren des Kontaktsystems. A further possibility, in a thrombin clotting factors mixture consisting of prothrombin complex and factor VIII to trigger spontaneous thrombin generation, is the addition of factors of the contact system. Hierzu müssen die Gerinnungsfaktoren XI und XII, soweit sie nicht bereits in dem Gemisch vorhanden sind, zugesetzt werden. To that effect the coagulation factors XI and XII, insofar as they are not already present in the mixture, are added.

Die Aktivierung des Gerinnungsfaktors XI in vivo ist noch nicht in allen Einzelheiten vollständig geklärt. The activation of coagulation factor XI in vivo is not fully understood in detail. Fest steht, dass Blutzellen und Zellen des Endothels bei diesem Aktivierungsvorgang eine wesentliche Rolle spielen. It is clear that blood cells and cells of the endothelium in this activation process play an essential role. Faktor XI ist im Blut in nicht kovalenter Form an hochmolekulares Kininogen (K d 10 "8 ) und Prothrombin (K d 10 "7 ) gebunden. Factor XI is in the blood in a non-covalent form of high molecular weight kininogen (K d 10 "8) and prothrombin (K d 10" 7) attached. Diese Komplexe können sich an aktivierte Plättchen anlagern, wobei es in Anwesenheit von Thrombin und/oder Gerinnungsfaktor Xlla zu einer Aktivierung des Gerinnungsfaktors XI kommt. These complexes may accumulate on activated platelets, which occurs in the presence of thrombin and / or coagulation factor XIIa to activation of coagulation factor XI.

In vitro kann die Aktivierung des Gerinnungsfaktors XI durch Gerinnungsfaktor Xlla an negativ geladenen Oberflächen erfolgen, indem Gerinnungsfaktor Xlla durch Kallikrein aus Gerinnungsfaktor XII gebildet wird. In vitro activation of coagulation factor XI by coagulation factor XIIa on negatively charged surfaces can be made by coagulation factor XIIa is formed by kallikrein from coagulation factor XII. Die Bildung von Kallikrein aus dem im Blut vorhandenen Präkallikrein kann durch unterschiedliche Mechanismen erfolgen, wie zB durch Präkallikreinaktivator oder Metallsalze der Ellagsäure. The formation of kallikrein from prekallikrein present in blood can occur by different mechanisms, for example. By prekallikrein activator or metal salts of ellagic acid

Erfindungsgemäß kann in einem thrombinbildungsfähigen Gerinnungsfaktorengemisch, bestehend aus Prothrombinkomplex und Gerinnungsfaktor VIII, eine spontane Thrombingenerierung durch Aktivierung des darin enthaltenen Gerinnungsfaktors XI ausgelöst werden, wobei alle Komponenten dieses Gemisches vorher virusinaktiviert wurden. According to the invention in a thrombinbildungsfähigen coagulation factors mixture consisting of prothrombin complex and coagulation factor VIII, a spontaneous thrombin generation triggered by activation of the coagulation factor XI contained therein, all components of this mixture were previously inactivated virus. Vorzugsweise wird diese Aktivierung in Anwesenheit von prionensicheren, gerinnungsaktiven Phospholipiden mit virussicherem Kallikrein durchgeführt. Preferably, this activation is carried out in the presence of prion-safe, coagulation-active phospholipids with virally safe kallikrein. Anstelle von Kallikrein kann auch virusinaktiviertes Präkallikrein mit virusinaktiviertem Präkallikreinaktivator oder -aktivatoren, wie zB Metallsalzen der Ellagsäure, verwendet werden. Instead of kallikrein can also virus-inactivated prekallikrein with virally inactivated prekallikrein activator or activators, such as metal salts of ellagic acid are used.

Für die Herstellung thrombinhältiger, pharmazeutischer Wirkstoffe kann die Virusinaktivierung auch während oder nach der Thrombingenerierung erfolgen. For the preparation thrombinhältiger, pharmaceutical active ingredients, the viral inactivation may also be effected during or after thrombin generation.

Mit den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben. With the following examples the invention will be described in detail.

Beispiele 1. Herstellung der Komponente A. 1. Preparation of the component A.

100 mg virussicheres Prothrombin wird in 1 L 0,1%iger Natriumzitratlösung bei pH 7,5 gelöst und der Gehalt an Prothrombin pro mL mit Hilfe eines Prothrombinmangelplasmas bestimmt. 100 mg virally safe prothrombin was dissolved in 1 L of 0.1% sodium citrate solution at pH 7.5 and the content of prothrombin per mL using a Prothrombinmangelplasmas. Ebenso wird nach Ecarinzusatz die gebildete Menge Meizothrombin und Thrombin durch Umsetzung von chromogenem Substrat S-2238 bestimmt. Likewise, after the amount Ecarinzusatz meizothrombin and thrombin formed is determined by reaction of chromogenic substrate S-2238th Weiters wird dieThrombinbildung mit Hilfe einer Prothrombinasepräparation durchgeführt. Furthermore dieThrombinbildung is carried out with the aid of a Prothrombinasepräparation. Das gebildete Thrombin wird mit Hilfe einer Fibrinogenlösung als Thrombinzeit bestimmt. Formed thrombin is determined by means of a fibrinogen solution as thrombin. Mit dieser Fibrinogenlösung wurde vorher eine Standardkurve mit Hilfe des internationalen Standards für α-Thrombin errichtet. With this fibrinogen solution, a standard curve was previously established with the help of the international standards for α-thrombin. Diese Prothrombinstammlösung kann eingefroren bei -20° C minidestens sechs Monate gelagert werden. This prothrombin stock can be frozen at -20 ° C soldering station six months stored.

2. Herstellung der Komponente B aus einzelnen Gerinnungsfaktoren. 2. Preparation of the component B of individual clotting factors.

Virussichere, hochgereinigte Gerinnungsfaktorenkonzentrate, die aus Plasma oder gentechnologisch gewonnen wurden, werden in 0,1%igem Natriumzitrat pH 7,5 gelöst und unter Rühren vermischt: 3,2 mg Faktor V, 0,2 mg Faktor VIII, 5,0 mg Faktor IX, 11 mg Faktor X und 0,5 mg Faktor Xla. Virally safe, highly purified coagulation factor concentrates, which have been obtained from plasma or by genetic engineering are dissolved in 0.1% sodium citrate pH 7.5 and mixed under stirring: 3.2 mg of factor V, 0.2 mg of factor VIII, 5.0 mg of factor IX, 11 mg factor X and 0.5 mg factor XIa. Nach Probenziehung wird die Lösung eingefroren und bei -20° C oder darunter liegenden Temperaturen gelagert. After sample collection, the solution is frozen and stored at -20 ° C or below this temperature. An einer äquivalenten Probe wird die Menge einer 1 M CaCI 2 -Lösung bestimmt, die erforderlich ist, um die Ca-Ionenaktivität äquivalent zu einer 5 mM - 8 mM CaCI 2 -Lösung zu bringen. At an equivalent sample the amount of a 1M CaCl 2 solution is determined which is required to the Ca-ion activity equivalent to a 5 mM - to bring 8 mM CaCl 2 solution.

3. Herstellung eines Gemisches der Komponenten A und B. 3. Preparation of a mixture of components A and B.

Die eingefrorenen Lösungen der Komponente A, hergestellt nach Beispiel 1 , und der Komponente B, hergestellt nach Beispiel 2, werden vorsichtig aufgetaut, wobei die Temperatur nicht über 4° C ansteigen soll. The frozen solutions of Component A, prepared according to Example 1, and the component B prepared according to Example 2 are thawed carefully, keeping the temperature not to rise above 4 ° C. Aus den erhaltenen Lösungen wird eine Mischung aus gleichen Teilen der Komponente A und der Komponete B hergestellt, die erforderlichen Proben werden gezogen, und das Gemisch der Komponenten wird wieder eingefroren und bei -20° C gelagert. From the obtained solution, a mixture of equal parts of the component A and the Komponete B is prepared, the necessary samples are drawn, and the mixture of the components is re-frozen and stored at -20 ° C. Herstellung eines Gemisches aus Plasmafraktionen, das die Gerinnungsfaktoren der Komponenten A und B enthält. Preparing a mixture of plasma fractions containing the coagulation factors of components A and B.

Aus 10 L tiefgefrorenem Source Plasma wird nach vorsichtigem Auftauen, wobei eine Temperatur von 4° C nicht überschritten wird, durch Zentrifugation bei 6.000 g über 15 Minuten das Kryopräzipitat vom Kryopräzipitatüberstand abgetrennt. From 10 L frozen Source plasma is after careful thawing, with a temperature of 4 ° C is not exceeded, separated by centrifugation at 6,000 g for 15 minutes, the cryoprecipitate from cryo.

a. Gerinnungsfaktor-Xla-hältiges Prothrombinkomplexkonzentrat: A. Coagulation factor XIa -containing Prothrombin Complex:

Der Kryopräzipitatüberstand wird mit 16 g schwachem Anionenaustauscher DEAE-Sephadex A-50 versetzt, der pH Wert zwischen 7,8 und 8,8 mit 0,1 normaler Na-Lauge eingestellt und eine Stunde bei einer Temperatur zwischen 3° C bis 6° C gerührt. The cryoprecipitate supernatant is mixed with 16 g of weak anion exchanger DEAE-Sephadex A-50, the pH value 7.8 to 8.8 with 0.1 normal sodium hydroxide solution for one hour at a temperature between 3 ° C to 6 ° C touched. Das Gemisch kann längstens 24 Stunden bei dieser Temperatur gehalten werden, bevor der Ionenaustauscher durch Filtration und/oder Zentrifugation abgetrennt wird. The mixture may be maintained at this temperature for more than 24 hours before the ion exchanger is separated by filtration and / or centrifugation. Die vom Ionenaustauscher befreite Flüssigkeit wird zur Gewinnung weiterer Plasmafraktionen aufbewahrt und der abgetrennte Ionenaustauscher zur Gewinnung des Prothrombinkomplexes weiterverarbeitet. The liberated from the ion exchanger fluid is stored for obtaining other plasma fractions and processed the separated ion exchanger to recover the prothrombin complex. Die Lagerung des so abgetrennten Ionenaustauschers kann bis zu 100 Stunden bei einer Temperatur zwischen 4° und 6° C erfolgen. The storage of the thus separated ion exchanger can be carried out up to 100 hours at a temperature between 4 ° and 6 ° C. Zur Weiterverarbeitung wird der abgetrennte Ionenaustauscher zwei Mal mit je 1 L 0,5%iger Kochsalzlösung gewaschen und der Gerinnungsfaktor-Xla-hältige Prothrombinkomplex durch Elution des Ionenaustauschers mit 1.000 mL einer 0,3 M NaCI-Lösung bei pH 7,5 gewonnen. For further processing the separated ion exchanger of the coagulation factor XIa-containing prothrombin complex is washed twice with 1 L of 0.5% saline solution and recovered by elution of the ion exchanger with 1000 mL of a 0.3 M NaCl solution at pH 7.5. Der Ionenaustauscher wird nach der Elution nochmals mit 500 mL 0,3 M Kochsalzlösung bei pH 7,5 gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Eluat vereinigt. The ion exchanger is washed after elution again with 500 ml of 0.3 M sodium chloride solution at pH 7.5 and combined with the washing liquid the eluate. In diesem Gesamteluat wird mit Hilfe von Ecarin die vorhandene Menge Prothrombin bestimmt und das Gesamteluat durch Verdünnung auf den gewünschten Prothrombingehalt, der zwischen 2 und 5 Prothrombineinheiten pro mL liegen kann, gebracht. In this Gesamteluat the quantity available prothrombin is determined and the Gesamteluat brought by dilution to the desired prothrombin, which can range between 2 and 5 prothrombin per mL, using Ecarin. Das Gesamteluat als Gerinnungsfaktor-Xla-hältiges Prothrombinkomplexkonzentrat kann nach dem Einfrieren in gefrorenem Zustand bei -20° C gelagert werden. The Gesamteluat as coagulation factor XIa -containing prothrombin complex concentrate can be stored at -20 ° C after freezing in a frozen state. Mit Hilfe von Proben, die vor dem Einfrieren entnommen wurden, wird der Gehalt an Gerinnungsfaktoren und aktivierten Gerinnungsfaktoren bestimmt. Using samples were taken prior to freezing, the content of coagulation factors and activated coagulation factors is determined. b. b. Herstellung eines Pro-Kofaktorenkonzentrates: Preparation of a Pro-Kofaktorenkonzentrates:

Das aus Plasma durch Zentrifugation sedimentierte Kryopräzipitat wird in 750 mL 0,3%igem Zitratpuffer pH 7,0 gelöst und mit 110 g Glyzin versetzt. The sedimented from plasma by centrifugation cryoprecipitate is dissolved in 750 mL 0.3% citrate buffer pH 7.0 and dissolved mixed with 110 g glycine. Nach einstündigem Rühren bei einer Temperatur zwischen 0° C und 2° C wird das ausgefällte Fibrinogen durch Zentrifugation bei 3.000 g mit einer Dauer von 15 Minuten abgetrennt und der Überstand, der die Gerinnungsfaktoren V und VIII enthält, eingefroren. After stirring at a temperature between 0 ° C and 2 ° C, the precipitated fibrinogen is separated by centrifugation at 3,000 g with a duration of 15 minutes and the supernatant, which contains coagulation factors V and VIII, is frozen. In einer mit Wasser 1 :10 verdünnten Probe des Überstandes wird der Gehalt an Faktor VIII bestimmt, ebenso die Menge CaCI 2 , die zur Rekalzifizierung erforderlich ist, um eine lonenaktivität äquivalent zu einer 5mM CaCL 2 -Lösung zu erhalten. In one with water 1: 10 diluted sample of the supernatant of the content of factor VIII is determined, as is the amount of CaCl 2, which is necessary for recalcification, in order to obtain an ion activity equivalent to a 5 mM CaCl2 solution. Die eingefrorene Lösung kann bei -20° C gelagert werden. The frozen solution can be stored at -20 ° C.

c. c. Herstellung eines Gemisches aus Gerinnungsfaktor-Xla-hältigem Prothrombinkonzentrat und Pro-Kofaktorenkonzentrat: Preparing a mixture of coagulation factor XIa hältigem prothrombin concentrate and Pro-Kofaktorenkonzentrat:

Eine mit destilliertem Wasser 1 :10 verdünnte, rekalzifizierte Probe des nach Beispiel 4 b. A with distilled water 1: 10 diluted, rekalzifizierte sample of Example 4 b. hergestellten Pro-Kofaktorenkonzentrates wird in Mengen von 0,1 ; produced per Kofaktorenkonzentrates is used in amounts of 0.1; 0,2; 0.2; 0,4 und 0,8 mL zu je 1 mL dem nach Beispiel 4 a. hergestellten Prothrombinkonzentrat zugesetzt. 0.4 and 0.8 mL of 1 ml of the prothrombin concentrate prepared according to Example 4 a. Added. Diesen Gemischen wird je 0,1 mL einer nach Beispiel 5 hergestellten Liposomenemulsion zugefügt. To these mixtures is added mL of a liposome emulsion prepared according to Example 5 per 0.1. Nach Inkubation von 8 Stunden bei 26° C wird jene Menge des Pro-Kofaktorenkonzentrats bestimmt, die erforderlich ist, um 90% oder mehr des vorhandenen Prothrombins in Thrombin überzuführen. After incubation for 8 hours at 26 ° C that amount of the pro-Kofaktorenkonzentrats is determined which is required to convert 90% or more of the prothrombin present into thrombin.

Zur Herstellung des Gemisches aus Gerinnungsfaktor-Xla-hältigem Prothrombinkomplexkonzentrat und Pro-Kofaktorenkonzentrat, die aus 10 L tiefgefrorenem Plasma gewonnen und eingefroren gelagert sind, werden diese Konzentrate nach dem Auftauen entsprechend in dem im Vorversuch gefundenen, optimalen Verhältnis vermischt. To prepare the mixture of coagulation factor XIa hältigem Prothrombin Complex and Pro-Kofaktorenkonzentrat which are mounted from 10 L frozen plasma collected and frozen, these concentrates are mixed accordingly after thawing in the relationship in the initial test found, optimal. Diese Mischung wird eingefroren und bei -20° C gelagert. This mixture is frozen and stored at -20 ° C.

5. Herstellung der Komponente C ohne Emulgator. 5. Preparation of Component C without emulsifier. Es werden vollsynthetische und daher virus- und prionensichere Phospholipide verwendet. It can be used fully synthetic and therefore virus- and prion-safe phospholipids. 200 mg 2Na-1 ,2-Di-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin, 400 mg 1 ,2,Di-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und 400 mg Di-Oleoyl-Äthanolamin- Phospholipid werden in 10 mL Chloroform gelöst und die Lösung in einem 250 mL Rundkolben durch Erwärmung und laufendes Drehen des Kolbens zur Trockerne eingedampft. 200 mg 2Na-1, 2-di-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine, 400 mg 1, 2, di-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine and 400 mg di-oleoyl-ethanolamine phospholipid are dissolved in 10 ml of chloroform and the solution is evaporated in a 250 mL round-bottomed flask by heating and running rotating the piston for Trockerne. Mit Hilfe eines Stickstoffstroms werden die Reste von Chloroform vollständig entfernt und 10 mL einer 0,1%igen Zitratpufferlösung pH 7,3 zugefügt. Using a stream of nitrogen residues of chloroform are completely removed and 10 mL of 0.1% citrate buffer pH 7.3 was added. Der sich an der Innenwand des Rundkolbens befindliche Phospholipidfilm wird komplett in der Pufferlösung bei 65° C emulgiert und bei der Emulgierung so lange wiederholt mit einer Vortex-Vorrichtung geschüttelt, bis der ganze Lipidfilm von der inneren Oberfläche des Kolbens verschwunden ist. The phospholipid is located on the inner wall of the round-bottomed flask is completely emulsified in the buffer solution at 65 ° C and repeated shaken during emulsification with a Vortex device until all lipid film is disappeared from the inner surface of the piston. Die Emulsion wird als solche oder 1 :10 mit 0,1%igem Zitratpuffer pH 7,0 verdünnt, durch ein Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm filtriert und nachfolgend durch ein Filter mit einer Porenweite von 0,22 μm sterilfiltriert. The emulsion as such or 1: 10 with 0.1% citrate buffer pH 7.0, filtered through a filter having a pore diameter of 0.45 microns and subsequently sterile filtered through a filter having a pore size of 0.22 microns. Diese Liposomenemulsion kann steril im Kühlschrank gelagert werden und wird vor Gebrauch mit einer Vortex-Vorrichtung 1 Minute geschüttelt. This liposome emulsion can be stored sterile in the refrigerator and is shaken before use with a vortex apparatus for 1 minute. Die Emulsion wird entsprechend der europäischen Pharmakopöe auf Sterilität und Pyrogenfreiheit geprüft (Eur. Pharm. 4 th Edition 2002 Seiten 123-126, 2.6.1. Sterility. Seiten 131 - 132, 2.6.8. Pyrogens). The emulsion is tested according to the European Pharmacopoeia for sterility and pyrogens (Eur Pharm 4 th Edition 2002 Pages 123-126, 2.6.1 Sterility pages 131 -..... 132 2.6.8 pyrogen).

6. Herstellung der Komponente C mit Natriumcholat. 6. Preparation of Component C with sodium cholate.

250 mg 2Na-1 ,2-Di-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin, 750 mg 1 ,2, Di- Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und 500 mg Natrium-Cholat werden in 10 mL einer 1 + 1 Mischung von Chloroform und Methylalkohol gelöst und beide Lösungsmittel in Vakuum abgedampft, in einer Weise, dass ein dünner, gleichmäßiger Film an der Innenwand eines Rundkolbens entsteht. 250 mg 2Na-1, 2-di-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine, 750 mg 1, 2, di- oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine and 500 mg sodium cholate are dissolved in 10 mL of a 1 + 1 mixture of chloroform and methyl alcohol achieved and both solvent was evaporated in vacuum in a manner that a thin, uniform film on the inner wall of a circular piston formed. Der Film wird mit 10 mL 0,1%igem Zitratpuffer pH 7,3 von der Gefäßwand abgeschwemmt und die so erhaltene Emulsion wie in Beispiel 1 weiterbehandelt und sterilfiltriert. The film is washed with 10 mL 0.1% citrate buffer pH 7.3 washed away from the vessel wall and further treating the emulsion thus obtained as in Example 1 and sterilized by filtration.

7. Virussichere Aktivatorsubstanzen zur Aktivierung des intrinsic Tenase-Pathways. 7. Virus Secure activator substances for the activation of the intrinsic tenase Pathways.

Als Aktivatorsubstanz wird entweder Gerinnungsfaktor Xla allein, bzw. gemeinsam mit Gerinnungsfaktor XI verwendet oder Gerinnungsfaktor Vlla, vorzugsweise mit Tissue Faktor. As activator is either coagulation factor XIa alone or used in combination with coagulation factor XI or Coagulation factor VIIa, preferably with tissue factor. Gerinnungsfaktor Xla kann auch gemeinsam mit Gerinnungsfaktor Vlla und Tissue Faktor angewandt werden. Coagulation factor XIa can also be used jointly with coagulation factor VIIa and tissue factor. Zur Verwendung der aktivierten Gerinnungsfaktoren bzw. des Tissue Faktors als pharmazeutisch aktive Substanzen werden sie durch ein Solvent Detergent-Verfahren virusinaktiviert und nach Entfernung des Solvent/Detergents einer Virusabreicherung durch Nanofiltration unterzogen. Use of activated coagulation factors or the tissue factor as pharmaceutical active substances they are virus inactivated detergent method by a solvent and subjected to virus removal by nanofiltration after removal of the solvent / detergent.

Nachstehende, pharmazeutisch aktive Substanzen, gelöst in einem 0,3%igen Zitratpuffer pH 7,3, werden als Stammlösungen der Aktivatorsubstanzen verwendet: The following pharmaceutical active substances, dissolved in a 0.3% citrate buffer pH 7.3, are used as stock solutions of the activator substances:

a. 30 μg Faktor Xla /mL; A. 30 ug factor XIa / mL; b. b. 30 μg Faktor Xla und 50 ng Faktor XI/mL; 30 ug factor XIa and 50 ng factor XI / mL; c. c. 30 μg Faktor Xla und 20 ng Faktor VI la/mL; 30 .mu.g factor XIa and 20 ng factor VI la / mL; d. 30 μg Faktor Xla und 20 ng Faktor Vlla und 10 ng Tissue Faktor/mL; D. 30 ug factor XIa and 20 ng factor VIIa and tissue factor 10 ng / mL; e. 10 μg /mL Tissue Faktor e. 10 ug / mL tissue factor

Zur Auswahl der bestgeeigneten Aktivatorsubstanz werden je 10 μL einer Verdünnungsreihe der einzelnen Aktivatorsubstanzen zu je 1 mL Gerinnungsfaktorengemisch, das nach Beispiel 3 oder 4 erhalten wird, hinzugefügt und mit 10 μL einer 1 :100 verdünnten Liposomenemulsion nach Beispiel 5 vermischt. To select the most suitable activator per 10 .mu.l of a dilution series of the individual activator substances are of 1 ml clotting factors mixture obtained according to Example 3 or 4, added with 10 ul of a 1: mixed 100 diluted liposome emulsion according to Example 5. FIG. Nach erfolgter Rekalzifizierung werden die Gemische bei 26° C bzw. 37° C gehalten. After recalcification the mixtures at 26 ° C or 37 ° C are maintained. In Intervallen von 10, 30, 60 und 120 min wird mit Hilfe des chromogenen Substrats S-2251 die gebildete Menge Faktor Xa bestimmt. At intervals of 10, 30, 60 and 120 min is determined using the chromogenic substrate S-2251, the amount of factor Xa formed. Es wird jene Aktivatorsubstanz zur Herstellung einer thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung verwendet, die mit den nach Beispiel 3 oder 4 hergestellten Gerinnungsfaktorengemischen nach Rekalzifizierung die größte Menge Faktor Xa bildet. There will be those activator for preparing a thrombin, pharmaceutical preparation of active compound used, which is the largest amount of factor Xa with the produced according to Example 3 or 4 after recalcification clotting factors mixtures.

8. Bestimmung der erforderlichen Mengen von Komponente C, die in einem Gemisch der Komponenten A und B innerhalb von 8 Stunden bei 26° C bzw. 2 Stunden bei 37° C mindestens 90% des vorhandenen Prothrombins in Thrombin umsetzen. 8. Determination of the required quantities of component C, which translate into a mixture of components A and B within 8 hours at 26 ° C or 2 hours at 37 ° C at least 90% of the prothrombin to thrombin. Gerinnungsfaktorengemische nach Beispiel 3 oder 4, die erforderlichenfalls noch mit nach Beispiel 7 ermittelten Mengen von Aktivatorsubstanz versetzt sind, werden mit steigenden Mengen Liposomenemulsion vermischt. Clotting factors mixtures according to Example 3 or 4, which are necessary, yet with offset determined according to Example 7 amounts of activator, are mixed with increasing amounts of liposome emulsion. Zu je 10 mL eines Gerinnungsfaktorengemisches werden 0,1 , 0,2, 0,4 und 0,8 mL einer 1 :100 verdünnten, nach Beispiel 5 hergestellten Liposomenemulsion zugesetzt und nach Rekalzifizierung bei 26° C über 8 Stunden oder bei 37° C über 2 Stunden inkubiert. To 10 mL of a coagulation factor mixture, 0.1, 0.2, 0.4 and 0.8 mL of a 1: 100 diluted, prepared according to Example 5 liposome emulsion was added and after recalcification at 26 ° C for 8 hours or at 37 ° C incubated for 2 hours. Es wird die geringste Menge Liposomenemulsion bestimmt, die erforderlich ist, um mindestens 90% des vorhandenen Prothrombins in Thrombin umzuwandeln. It is the least amount of liposome emulsion is determined which is necessary to convert at least 90% of the prothrombin present into thrombin.

9. Herstellung einer thrombingenerierfähigen, virussicheren pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung. 9. Preparation of a thrombin, virally safe pharmaceutical preparation.

Ein nach Beispiel 3 hergestelltes, virussicheres Gerinnungsfaktorengemisch (Komponenten A und B) wird nach dem Auftauen, falls erforderlich, mit einer nach Beispiel 7 ausgewählten, virussicheren Aktivatorsubstanz in der entsprechenden Menge versetzt und das Gemisch bei 0° bis 2° C 15 Minuten lang gerührt. A prepared according to Example 3, virus-safe coagulation factors mixture (components A and B) after thawing, if necessary, treated with a of Example 7 selected, virally safe activator substance in the appropriate amount and the mixture stirred at 0 ° to 2 ° C for 15 minutes , Zu diesem Gemisch wird die nach Beispiel 5 ermittelte Menge Liposomenemulsion (Komponente C) zugesetzt. To this mixture, determined in accordance Example 5 amount of liposome emulsion (component C) is added. Dieses Gemisch wird mit festem Kochsalz auf eine Konzentration von 0,9% NaCI gebracht, falls erforderlich, einer Klärfiltration unterzogen und dann durch ein Filter mit einer Porenweite von 0,22 μm und/oder 0,1 μm sterilfiltriert. This mixture is reacted with solid sodium chloride to a concentration of 0.9% NaCl, if necessary, subjected to a clarifying filtration, and then sterile filtered through a filter having a pore size of 0.22 .mu.m and / or 0.1 .mu.m. Die gesamten Manipulationen, inklusive der Sterilfiltration, finden bei einer Temperatur zwischen 0° C und 2° C statt. The whole manipulation, including sterile filtration, take place at a temperature between 0 ° C and 2 ° C. Die so gewonnene, thrombingenerierfähige Wirkstoffzubereitung wird nach Probenziehung eingefroren und bei -20° C gelagert. The thus obtained, generating thrombin active compound preparation is frozen after sample collection and stored at -20 ° C. Die erforderlichen Untersuchungen auf Stabilität und Pyrogenfreiheit werden nach der europäischen Pharmakopöe durchgeführt. Studies required for stability and pyrogenicity are carried out according to the European Pharmacopoeia. In in-process Kontrollen und im sterilen Filtrat wird die thrombingenerierfähige Kapazität nach Rekalzifizierung bei 37° C über 2 Stunden bestimmt und ebenso noch vorhandenes, durch Ecarin aktivierbares Prothrombin, um die mindestens 90%ige Umwandlung des vorhandenen Prothrombins in Thrombin zu gewährleisten. In in-process controls and in the sterile filtrate the generating thrombin capacity is determined after recalcification at 37 ° C for 2 hours and also still present, activated by Ecarin prothrombin to ensure at least 90% conversion of the prothrombin to thrombin.

10. Herstellung einer thrombinhältigen, virussicheren, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung. 10. Preparation of Thrombin virally safe pharmaceutical preparation. Das nach Beispiel 4 aus einem Faktor-Xla-hältigen Prothrombinkomplexkonzentrat und einem Pro-Kofaktorenkonzentrat hergestellte, eingefrorene Gemisch wird aufgetaut und, wenn nach Beispiel 7 noch erforderlich, mit einer ausgewählten, berechneten Menge Aktivatorsubstanz versetzt. The material prepared in Example 4 from a factor-XIa-containing prothrombin complex concentrate and a pro-Kofaktorenkonzentrat, frozen mixture is thawed, and, if added as described in Example 7 is still necessary with a selected, calculated amount of activator substance. Durch Zugabe von 10 mg Tween 80 und 0,3 mg Trinitrobutylphosphat pro g Protein des Gerinnungsfaktorengemisches bei 26° C nach erfolgter Rekalzifizierung und Zusatz einer nach Beispiel 6 ermittelten Menge Liposomenemulsion wird in acht Stunden die Hauptmenge des Prothrombins in Thrombin übergeführt und gleichzeitig die erforderliche Virusinaktivierung durchgeführt. By addition of 10 mg Tween 80 and 0.3 mg Trinitrobutylphosphat per g protein of the coagulation factor mixture at 26 ° C after recalcification and addition of a determined according to Example 6 amount liposomes emulsion, the major amount of the prothrombin is in eight hours converted into thrombin and also the required virus inactivation performed.

Die thrombinhältige Lösung kann entweder eingefroren und gelagert oder sofort bzw. nach Wiederauftauen weiterverarbeitet werden. The thrombin-solution can be either frozen and stored or further processed immediately or after thawing. Durch Zusatz einer entsprechenden Natriumzitratlösung wird eine 25 mMolarität und ein pH-Wert von 6,5 eingestellt und unter weiterem Rühren bei Zimmertemperatur soviel Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 6.000 und 8.000 zugesetzt, bis eine 0,1%ige Lösung entsteht. By adding the appropriate sodium citrate a 25 mMolarität and a pH of 6.5 is adjusted and further stirring at room temperature as much polyethylene glycol added with a molecular weight 6000-8000, to a 0.1% solution. Nunmehr wird eine mit 0,025 M Natriumzitrat pH 6,5, gewaschene, 20%ige CM-Sepharose-Suspension unter Rühren zugesetzt, bis mindestens 95% des vorhandenen Thrombins an die CM-Sepharose adsorbiert sind. Now, a 0.025 M sodium citrate pH 6.5, washed, 20% CM-sepharose suspension is added under stirring until at least 95% of the available thrombin adsorbed to the CM-Sepharose. Die erforderliche Menge CM-Sepharose wird in einem Von/ersuch bestimmt, indem die geringste Menge der 20%igen Emulsion ermittelt wird, die mindestens 95% des vorhandenen Thrombins adsorbiert. The required amount of CM-Sepharose is determined in a From / beseech by the least amount of 20% emulsion is determined which adsorbs at least 95% of the available thrombin. Die CM-Sepharose wird während 30 Minuten zwischen 3.000 bis 5.000 g abzentrifugiert, das Sediment in 25 mM Zitratpuffer pH 6,5 resuspendiert und in eine entsprechende Kolonne eingefüllt. The CM-Sepharose for 30 minutes is between 3,000 to 5,000 g centrifuged, the sediment in 25 mM citrate buffer pH 6.5 and resuspended filled into a corresponding column. Die Kolonne wird mit 1%igem Zitratpuffer, der noch 0,1% PEG enthält, bei pH 6,5 gewaschen und mit einem Kochsalzgradienten in Anwesenheit von 0,1% Zitrat und 0,1% PEG bei pH 6,5 eluiert. The column is washed with 6.5 1% citrate buffer, which still contains 0.1% PEG at pH and eluted with a sodium chloride gradient in the presence of 0.1% citrate and 0.1% PEG at pH 6.5. Der Kochsalzgradient wird zwischen 10 und 200 mM errichtet. The Kochsalzgradient built between 10 and 200 mM. Die Fraktionen, die das meiste Thrombin enthalten, werden gesammelt, diafiltriert und dadurch auf eine Konzentration von etwa 500 E Thrombin pro mL gebracht. The fractions containing most of the thrombin are collected, diafiltered, and thereby brought to a concentration of about 500 U thrombin per mL. Eine solche Lösung kann eingefroren, nach Gefriertrocknung gelagert oder sofort weiterverarbeitet werden. Such a solution can be frozen, stored after freeze-drying or further processed immediately. Nach vorheriger Klärfiltration durch Filter verschiedener Porengröße zwischen 5.000 und 75 nm wird die thrombinhältige Lösung durch einen Nanofilter mit 35 nm Porengröße und vorzugsweise durch weitere Nanofilter mit Porendurchmessern von 20 und 15 nm filtriert. By prior clarification through filters of different pore size 5000-75 nm, the thrombin-solution through a nanofiltration at 35 nm pore size and preferably filtered through other nano filter with pore diameters of 20 and 15 nm. Die so erhaltene virusabgereicherte Thrombinlösung wird durch Ultrafiltration mit Hilfe eines 30 KD Filters auf einen Gehalt von über 5.000 E Thrombin pro mL konzentriert und eingefroren oder gefriergetrocknet gelagert. The virusabgereicherte thrombin solution thus obtained is concentrated by ultrafiltration using a 30 KD filter to a content of about 5.000 thrombin per mL and frozen or stored lyophilized.

11. Herstellung eines thrombingenerierfähigen virussicheren Arzneimittels. 11. Preparation of a thrombin virally safe medicinal product.

Eine äquivalente Probe des nach Beispiel 9 hergestellten, eingefrorenen oder gefriergetrockneten, virussicheren, pharmazeutischen Wirkstoffes wird mit einer 0,9% ' ιgen NaCI-Lösung so verdünnt, dass die Probe nach Rekalzifizierung bei 37° C innerhalb von 2 Stunden 500 + 50 Einheiten Thrombin pro mL generiert. An equivalent sample of the prepared according to Example 9, frozen or freeze-dried, virus-safe, pharmaceutical agent is a 0.9% 'strength by weight NaCl solution diluted so that the sample after recalcification at 37 ° C within 2 hours 500 + 50 units of thrombin generated per mL.

Eine solche verdünnte Probe wird mit gleichen Teilen eines 5 - 10%igen, fibrinogenhältigen Arzneimittels, das als Bestandteil eines Fibrinkleberkits vorgesehen ist, vermischt und die Gerinnungszeit dieser Mischung nach Rekalzifizierung bestimmt. Such a diluted sample is with equal parts of a 5 - 10% by weight, fibrinogen-containing medicinal product which is provided as part of a Fibrinkleberkits, mixed and determined the clotting time of the mixture after recalcification. Wenn die Gerinnungszeit bei 37° C länger als 150 Sekunden ist, wird der Wirkstoffzubereitung nach Beispiel 7 noch soviel nach Beispiel 8 hergestelltes Thrombin zugesetzt, bis die Gerinnungszeit auf zwischen 100 und 150 Sekunden gesunken ist. If the coagulation time is longer than 150 seconds at 37 ° C, the active compound is still so much added to Example 7 to Example 8 produced thrombin to the coagulation time is reduced to between 100 and 150 seconds.

Die so ermittelten Mengen Thrombin werden dem nach Beispiel 9 erhaltenen Wirkstoff unter Rühren bei einer Temperatur von zwischen 0° C und 2° C zugesetzt und diese Mischung nach Klärfiltration sterilfiltriert. The determined amounts of thrombin are added to the active agent obtained according to Example 9 under stirring at a temperature of between 0 ° C and 2 ° C and sterile filtered this mixture by clarifying filtration. Die erhaltene, sterile Bulklösung wird vorzugsweise bei derselben niederen Temperatur in Endverbraucherfläschchen portioniert, verfüllt und gefriergetrocknet. The bulk solution obtained, sterile is preferably portioned, filled and freeze-dried at the same low temperature in Consumer vial. Die Auflösung des gefriergetrockneten Pulvers erfolgt mit einer sterilen 5 mM CaCI 2 - Lösung. Dissolution of the lyophilised powder is completed with a sterile 5 mM CaCl 2 - solution.

12. Herstellung eines thrombinhältigen, virussicheren Arzneimittels. 12. Preparation of a thrombin, virus-safe drug. Eine Wirkstoffzubereitung nach Beispiel 10 wird nach Auftauen oder Auflösen mit Kochsalz auf eine Konzentration von 0,9% NaCI gebracht und dann durch Zugabe einer isotonen Kochsalzlösung die gewünschte Thrombinkonzentration auf zwischen 500 und 5.000 Einheiten pro mL eingestellt. A pharmaceutical substance according to Example 10 is placed after thawing or reconstitution with saline to a concentration of 0.9% NaCl and then adjusted by the addition of an isotonic saline solution to the desired thrombin concentration from 500 to 5000 units per mL. Es wird soviel PEG zugesetzt, dass eine 0,1%ige Lösung entsteht und mit Hilfe einer 10%igen CaCI 2 - Lösung eine 5 mM CaCI 2 -Lösung erhalten wird. There is so much PEG added that a 0.1% strength solution is formed and with the help of a 10% CaCl 2 - solution is a 5 mM CaCl obtained 2 solution. Diese Lösung wird sterilfiltriert, portioniert in Endverbrauchergefäße steril abgefüllt und kann eingefroren oder nach Gefriertrocknung gelagert werden. This solution is sterile filtered, portioned under sterile in Consumer containers and can be frozen or stored by freeze-drying. Die Rekonstitution der gefriergetrockneten Thrombinlösung erfolgt mit WFI. The reconstitution of the freeze-dried thrombin occurs with WFI.

13. Anwendung eines thrombingenerierfähigen Arzneimittels gemeinsam mit- einem thrombinhältigen Arzneimittel. 13. Application of a thrombin drug together medium-a thrombin drugs.

1 mL eines fibrinogenhältigen Arzneimittels, das 50 - 100 mg Fibrinogen pro mL enthält, wird mit 1 mL eines thrombingenerierfähigen Arzneimittels nach Beispiel 11 vermischt. 1 mL of a fibrinogen-containing medicinal product which is 50 - containing 100 mg fibrinogen per mL is mixed with 1 mL of a medicinal product generating thrombin according to Example eleventh Die Mischung dieser beiden Arzneimittel wird unter sterilen Bedingungen etwa 20 Sekunden lang stark gerührt und die so erhaltene homogene Mischung auf die zu klebende bzw. abzudichtende Stelle aufgebracht, nachdem die zu verklebenden oder abzudichtenden Gewebeteile adaptiert wurden, und so lange in der adaptierten Position gehalten, bis das Gemisch beider Arzneimittel geronnen ist. The mixture of these two drugs is about 20 seconds vigorously stirred under sterile conditions and the homogeneous mixture thus obtained to be bonded or sealed body applied after the adhesive bonding or sealing tissues were adapted and maintained in the adapted position for so long, until the mixture of both drugs curdled. Falls erforderlich, können die Gewebeteile auch noch längere Zeit in einer fixierten Position verbleiben, die bis zu mehreren Stunden betragen kann. If necessary, the tissue can remain for an extended period in a fixed position, which can be up to several hours.

14. Anwendung eines thrombinhältigen Arzneimittels. 14. Application of a medicinal product containing thrombin.

Zu 2,0 mL eines erfindungsgemäßen Arzneimittelgemisches nach Beispiel 13 werden 0,2 mL eines thrombinhältigen Arzneimittels nach Beispiel 12 mit 2.000 Einheiten Thrombin pro mL zugesetzt und rasch vermischt. To 2.0 mL of a drug mixture of the invention according to Example 13 0.2 mL of a medicinal product containing thrombin are 2,000 units of thrombin per mL in Example 12 was added and mixed rapidly. Dieses Gemisch wird zur Blutstillung rasch auf blutende Stellen aufgebracht, möglichst nach Entfernung von angesammeltem Blut, entweder durch Absaugen bzw. Aufsaugen oder durch Verblasen des Blutes. This mixture is applied to achieve hemostasis rapidly bleeding points as possible by removing the accumulated blood, either by suction or aspiration or by blowing the blood. 15. Bestimmung des Gerinnungsfaktors XI und des Gerinnungsfaktors XII in lonenaustauscher-Eluaten nach Beispiel 4a, die nicht nach ihrer Beladung gelagert, sondern nach dem Waschen des beladenen Ionenaustauschers sofort eluiert werden. 15. Determination of coagulation factor XI and of coagulation factor XII in ion-exchanger eluates according to Example 4a which are not stored after its loading, but be eluted after washing of the charged ion exchanger immediately. Die Bestimmung erfolgt mit Hilfe der entsprechenden Gerinnungsfaktoren-Mangelplasmen von American Diagnostica. The determination is made using the corresponding coagulation factors deficiency plasmas by American Diagnostica.

16. Bestimmung von Kallikrein und Präkallikrein in Eluaten von Ionenaustauschern, die mit Prothrombinkomplexen beladen und nach dem Waschen sofort oder erst nach Lagerung bis zu 100 Stunden bei Kühlschranktemperatur eluiert wurden . 16. Determination of kallikrein and prekallikrein in eluates of ion exchangers that have been charged with prothrombin complexes and eluted immediately after washing or only after storage up to 100 hours at refrigerator temperature. Die Kallikreinaktivität wird mit Hilfe des chromogenen Substrats S-2403 bestimmt, wobei zur Bestimmung eine 4 mM chromogene Substratlösung verwendet wird, die im Gesamtansatz in einer 0,4 mM Konzentration vorliegt. The kallikrein activity is determined using the chromogenic substrate S-2403, in which to determine a 4 mM chromogenic substrate solution is used, the present concentration in the total mixture in a 0.4 mM. Die Präkallikreinkonzentration wird ebenfalls mit chromogenem Substrat S-2403 bestimmt, indem das Eluat in einer 1 :10 Verdünnung mit gleichem Volumen einer 0,5%igen Kaolinsuspension versetzt und 5 Minuten bei 37° C unter Schütteln inkubiert wird. The Präkallikreinkonzentration is also determined with chromogenic substrate S-2403 by the eluent in a 1: 10 dilution with the same volume of a 0.5% strength by weight of kaolin and 5 minutes, incubated at 37 ° C with shaking. Von der gemessenen Extinktion wird die Extinktion, die ohne Aktivierung mit Kaolinsuspension erhalten wird, abgezogen und auf einer Standardkurve die Mengen, bzw. Einheiten Präkallikrein ermittelt. From the measured absorbance, the absorbance, which is obtained without activation of the kaolin suspension is deducted, and determines on a standard curve, the amounts or units prekallikrein.

17. Bestimmung von Präkallikrein-Aktivator. 17. Determination of prekallikrein activator. Die Bestimmung erfolgt gleichartig wie die Bestimmung von Präkallikrein, nur dass anstelle von Kaolinsuspensionen eine Konzentrationsreihe von Präkallikrein-Aktivatoren hergestellt wird. The determination is performed similarly as the determination of prekallikrein, except that instead of kaolin, a concentration series of prekallikrein activators is prepared. Wenn Kupfersalze der Ellagsäure verwendet werden, wird eine Konzentrationsreihe von zwischen 10 ng bis 10000 ng verwendet, die aus einer vorgelegten Menge Präkallikrein innerhalb von 5 Minuten bei 37° C die maximale Menge Kallikrein bildet. If copper salts of ellagic acid are used, a concentration range of between 10 ng is to 10,000 ng used that forms the maximum amount of kallikrein within 5 minutes at 37 ° C from an initially charged amount prekallikrein.

18. Herstellung pflanzlicher und/oder synthetischer Phospholipid-Emulsionen aus L-α-Phosphatidylcholin, L-α-Phosphatidyl-L-Serin und L-α-Phosphatidyl- äthanolamin, die in gleicher Form erfolgt wie sie in Beispiel 5 angegeben ist. 18. Preparation of vegetable and / or synthetic phospholipid emulsions of L-α-phosphatidylcholine, L-α-phosphatidyl-L-serine and L-α-phosphatidyl ethanolamine, which is carried out in the same way as indicated in Example 5. FIG.

19. Bestimmung von TAFIa. 19. Determination of TAFIa. Die Bestimmung von TAFIa erfolgt mit Hilfe eines The determination of TAFIa is performed using a

Chromogenic TAFI Activity Kits von American Diagnostika ohne Zusatz von Aktivator (Thrombin). Chromogenic TAFI activity kits by American diagnostics without the addition of activator (thrombin). Der Gehalt an TAFIa wird aus einer Standardkurve errechnet, die mit Verdünnungen von Plasma und nachfolgender Aktivierung mit Thrombin und Messung der TAFIa- Aktivität mit Hilfe eines chromogenen Substrats ermittelt wurde. The content of TAFIa is calculated from a standard curve that was determined using dilutions of plasma and subsequent activation with thrombin and measurement of the TAFIa- activity using a chromogenic substrate.

20. Bestimmung von Gerinnungsfaktor Xllla. 20, the determination of coagulation factor XIIIa. Die Bestimmung von aktiviertem Faktor The determination of activated factor

XII erfolgt nach der European Pharmacopoeia Suppl. 4.5. XII is based on the European Pharmacopoeia Suppl. 4.5. 07/2003, p. 07/2003, p. 3687 ohne Verwendung von Aktivatoren des Faktors XIII (Thrombin). 3687 without the use of activators of factor XIII (thrombin).

21. Ultraschallbehandlung von Phospholipid-Emulsionen. 21. Ultrasonic treatment of phospholipid emulsions. Es werden durch Verdünnung mit isotoner Kochsalzlösung aus den Phospholipid-Gemischen 1%ige Suspensionen hergestellt und 2 mL einer Beschallung unterzogen. There are produced 1% suspensions by dilution with isotonic saline solution of the phospholipid mixtures and 2 mL subjected to sonication. Die Beschallung wird mit dem Ultraschall-Desintegrator Sonifire II W-250 durchgeführt. The sonication is performed with the ultrasonic disintegrator Sonifire II W-250. Die Ausgangsleistung beträgt maximal 200 Watt bei einer Arbeitsfrequenz von 20 kHz. The output power is limited to 200 watts at an operating frequency of 20 kHz. Verwendet wurde Konverter 102 C mit Standard- Resonator 1/2" mit Mikrospitze 101-148-062. Die Beschallungsdauer wird zwischen 10 und 100 Sekunden ohne Kühlung der beschallten Emulsion bei Stufe 1 und bei 10% Pulsierintervall durchgeführt. Die Aktivität der beschallten Phospholipid-Emulsion wird mit Hilfe eines Referenzplasmas und einer Kaolinsuspension durch Bestimmung der partiellen Thromboplastinzeit durchgeführt. 100 μL Plasma werden mit 50 μL einer Liposomenemulsion und 50 μL einer 0,5%igen Kaolinsusension 5 Minuten bei 37° C inkubiert, rekaizifiziert, und die Gerinnungszeit bei 37° C bestimmt. Es wird die erforderliche Menge Liposomenemulsion bestimmt, die die kürzeste Gerinnungszeit verursacht. Die Wirksamkeit der in Beispiel 5 und 6 angeführten Liposomen-Emulsionen kann ebenso wie die in Beispiel 18 angeführten Phospholipid-Emulsionen durch diese Methode bestimmt werden. was used converter 102 C with standard resonator 1/2 "microtip 101-148-062. The sonication time is performed between 10 and 100 seconds without cooling of the sonicated emulsion at Level 1 and 10% Pulsierintervall. The activity of the sonicated phospholipid emulsion is performed using a reference plasma and a kaolin suspension by determining the partial thromboplastin time. 100 ul plasma with 50 L of a liposome emulsion and 50 L of a 0.5% Kaolinsusension incubated for 5 minutes at 37 ° C, rekaizifiziert, and the coagulation time at 37 C. determined. It is the required amount of liposome emulsion is determined which causes the shortest clotting time. the effectiveness of the process mentioned in example 5 and 6 liposome emulsions may as those indicated in example 18 phospholipid emulsions are determined by this method.

22. Ermittlung der geeigneten Ca-Ionenkonzentration zur erwünschten Einstellung der Gerinnungszeit einer thrombingenerierungsfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung. 22. Determination of the appropriate Ca-ion concentration for the desired adjustment of the coagulation time of a thrombingenerierungsfähigen, pharmaceutical preparation. Thrombingenerierende, pharmazeutische Zubereitungen werden hergestellt, und die zu untersuchende pharmazeutische Zubereitung wird in einer geometrischen Verdünnungsreihe mit Ca-Ionen versetzt, in der die höchste Ca-Ionenkonzentration 1 mM ist. Thrombingenerierende, pharmaceutical preparations are prepared, and the pharmaceutical preparation to be examined is placed in a geometric dilution series with Ca-ions, in which the highest Ca-ion concentration is 1 mM. Die Verdünnungsreihe wird von 125 μm bis 1000 μm angesetzt. The dilution series is prepared from 125 microns to 1000 microns. In gleichartiger Weise wird eine Ca-Ionen- konzentrationsreihe von 10 mM bis 640 mM angesetzt und die Gerinnungszeit bestimmt. Similarly, a Ca-ion concentration is set of 10 mM to 640 mM recognized and determines the clotting time. Die erforderliche Ca-Ionenkonzentration wird mit Hilfe einer Standardkurve ermittelt. The required Ca-ion concentration is determined using a standard curve.

23. In einem schachbrettförmigen Ansatz wird das optimale Gemisch einer Phospholipidmischung mit Kaolin ermittelt, das bei einer optimalen Ultrabeschallung die größte Aktivität in der APTT mit Plasma zeigt. 23. In a checkerboard-like approach, the optimum mixture of a phospholipid mixture is determined with kaolin the greatest activity in the APTT shows at an optimum sonication with plasma. Der Test wird mit 100 μL des beschallten Gemisches, das mit 100 μL Plasma 5 min bei 37° C inkubiert war und durch Zusatz von 100 μL einer CaCI-Lösung rekalzifiziert wird, durchgeführt. The test is with 100 ul of the sonicated mixture, which was incubated with 100 ul plasma 5 min at 37 ° C and is recalcified by adding 100 .mu.l of a CaCl solution, performed. Um die optimale Beschallungsintensität zu ermitteln, wird die Beschallung wie in Beispiel 21 vorgenommen, wobei ein 80%iges Pulsierungsintervall bei den Stufen 1 , 2 und 3 angewendet und in entsprechenden Ansätzen eine 10-, 30-, 100- und 300-Sekundenbeschallung vorgenommen wird. To determine the optimum sound intensity, the sound is as made in Example 21 using a 80% sodium Pulsierungsintervall at levels 1, 2 and 3 applied and in corresponding approaches a 10-, 30- is, 100- and 300-second sound made ,

Literatur literature

Blombäck B. Fibrinogen: Evolution of the Structure-Function Concept: Keynote Address at Fibrinogen 2000 Congress. Blombäck B. Fibrinogen: Evolution of the Structure-Function Concept: Keynote Address at 2000 Congress fibrinogen. Annais NY Acad. Annals NY Acad. Sei. Be. 2001 ; 2001; 936:1-10 936: 1-10

Booth NA TAFI Meets the Sticky Ends. Booth NA TAFI Meets the sticky ends. Thromb. Thromb. Haemost. Haemost. 2001 ; 2001; 85:1-2 85: 1-2

Davie EW, Ratnoff OD Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Davie EW, Ratnoff OD Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science 1964; Science 1964; 145:1310-12 145: 1310-12

Drake TA, Morrissey JH, Edgington TS Selective cellular expression of tissue factor in human tissue. Drake TA, Morrissey JH, Edgington TS Selective cellular expression of tissue factor in human tissue. Implication for disorders of hemostasis and thrombosis. Implication for disorders of hemostasis and thrombosis. Am. At the. J. Path. J. Path. 1989; 1989 134:1087-97 134: 1087-97

Grey EG Fibrin as a haemostatic in cerebral surgery. Grey EC fibrin as a haemostatic surgery in cerebral. Surg. Surg. Gyn. Obst. Gyn. Fruit. 1915; 1915; 21 :452-454 21: 452-454

MacFarlane RG An enzyme cascade in the blood clotting mechanism and its funetion as an biochemical amplifier. MacFarlane RG An enzyme cascade in the blood clotting mechanism and its funetion as to biochemical amplifier. Nature 1964; Nature 1964; 202:498-9 202: 498-9

Mann KG, Jenny RJ, Krishnaswamy. Mann KG, Jenny RJ, Krishnaswamy. Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes. Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes. Ann. Ann. Rev. Biochem. Rev. Biochem. 1988; 1988 57:915- 56 57: 915 56

Matras H. et al. Matras H. et al. Zur Klebung von Nervenanastomosen mit Gerinnungssubstanzen. For bonding of Nervenanastomosen with clotting substances. Fortschr. Fortschr. Kiefer-Gesichts-Chir. Maxillofacial Chir. 1976; 1976 112-114. 112-114. Morawitz P. Die Chemie der Blutgerinnung. Morawitz P. The chemistry of blood clotting. Ergebn. Equals. d. Physiol. d. Physiol. 1905; 1905; 4:307 4: 307

Rapaport SI, Rao LVM The Tissue Factor Pathway: How it has become a "Prima Ballerina". Rapaport SI, Rao LVM The Tissue Factor Pathway: How it has become a "prima ballerina". Thromb. Thromb. Haemost. Haemost. 1995; 1995; 74:7-17 74: 7-17

Siebenlist KR, Meh DA, Mosesson MW Protransgiutaminase (F-Xlll) mediated cross-linking of fibrinogen and fibrin. Siebenlist KR, Meh DA, Mosesson MW Protransgiutaminase (F XIII) mediated cross-linking of fibrinogen and fibrin. Thromb. Thromb. Haemost. Haemost. 2001 ; 2001; 86:1221-8 86: 1221-8

Spängier HP Gewebeklebung und lokale Blutstillung mit Fibrinogen, Thrombin und Blutgerinnungsfaktor XIII (Experimentelle Untersuchungen und klinische Erfahrungen). Spängier HP tissue adhesion and local hemostasis with fibrinogen, thrombin and coagulation factor XIII (Experimental studies and clinical experience). Wien. Vienna. klin. klin. Wschr. Wschr. 1976; 1976 88(4):3-18 von dem Borne PAK, Koppelman SJ, Bouma BN et al. 88 (4): 3-18 of the Borne PAK, Koppelman SJ, Bouma BN et al. Surface independent factor XI activation by thrombin in the presence of high molecular weight kininogen. Surface independent factor XI activation by thrombin in the presence of high molecular weight kininogen. Thromb. Thromb. Haemost. Haemost. 1994; 1994; 72:397-402 72: 397-402

Young F. et al. Young F. et al. "Suture" of Wounds by Plasma-Thrombin Adhesion. "Suture" of Wounds by plasma thrombin Adhesion. War Med. 1944; Was Med 1944th; 6:80-85 6: 80-85

Patentzitate
Zitiertes PatentEingetragen Veröffentlichungsdatum Antragsteller Titel
WO1981002105A1 *2. Jan. 19816. Aug. 1981Baxter Travenol LabTherapeutic compositions & methods for manufacture and use
DE19824306A1 *21. Mai 199825. Nov. 1999Michael SittingerFibrin glue useful in tissue engineering, biotechnology and surgery
EP0680764A2 *5. Mai 19958. Nov. 1995IMMUNO AktiengesellschaftStable preparation for the treatment of blood coagulation disorders, comprising an activated coagulation factor and lipid vesicles
EP0700684A2 *10. Aug. 199513. März 1996BEHRINGWERKE AktiengesellschaftComposition containing prothrombincomplex-concentrate and at least one additional component which activates the coagulation, as antidote for blood-anticoagulants
US4160025 *8. Aug. 19773. Juli 1979Immuno Aktiengesellschaft Fur Chemisch-Medizinische ProdukteMethod of producing a blood-coagulation-promoting preparation from human blood plasma
US4188318 *24. Apr. 197812. Febr. 1980Edward ShanbromSimplified method for preparation of high yield, high purity Factor VIII concentrate
Nichtpatentzitate
Referenz
1 *BUTENAS SAULIUS ET AL: ""Normal" thrombin generation", BLOOD, vol. 94, no. 7, 1 October 1999 (1999-10-01), &, pages 2169 - 2178, XP002256861, ISSN: 0006-4971
Referenziert von
Zitiert von PatentEingetragen Veröffentlichungsdatum Antragsteller Titel
US910276213. Jan. 201211. Aug. 2015Novo Nordisk Healthcare AgVirus filtration of liquid factor VII compositions
Klassifizierungen
Internationale KlassifikationA61K47/24, A61K9/127, A61K38/37, A61K38/36, A61K38/48
UnternehmensklassifikationA61K47/24, A61K38/4833, A61K9/127, A61K38/4846, A61K38/36, A61K38/37
Europäische KlassifikationA61K38/48K5, A61K38/48K21
Juristische Ereignisse
DatumCodeEreignisBeschreibung
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