WO2004011024A1 - Thrombingenerierfähige und thrombinhältige pharmazeutische wirkstoffzubereitungen und arzneimittel - Google Patents

Thrombingenerierfähige und thrombinhältige pharmazeutische wirkstoffzubereitungen und arzneimittel Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a thrombin-generating and thrombin-containing pharmaceutical active substance preparation and medicaments produced therefrom.
  • Blood clotting is caused by the enzyme thrombin, which is generated from its zymogen, prothrombin, and which converts the protein fibrinogen present in the blood plasma into insoluble fibrin.
  • the escaping blood coagulates within minutes, whereby only one sixth of the fibrinogen contained in the plasma is converted into fibrin.
  • the thrombin formation continues in the still strongly fibrinogen-containing blood, so that there is finally a complete conversion of the entire fibrinogen still present in the clotted blood into fibrin. This process of continued thrombin formation and coagulation takes a long time and can only be completed after several hours.
  • fibrinogen When fibrinogen is converted to fibrin, thrombin initially cleaves or partially cleaves fibrinopeptides A and B from the two ends of the fibrinogen molecule, which initially produces soluble fibrin monomers. These can laterally aggregate into fibrils, which then form a fibrin network (Blombburg). This fibrin network created in the clotted blood adheres to the injured tissue or wound bed and thus leads to hemostasis and wound closure.
  • Thrombin also causes the coagulation factor XIII, the zymogen of the coagulation factor Xllla, to be converted into a transglutaminase.
  • the cross-linking of fibrin is of great importance for the stability of the fibrin network that is developing (Siebenlist et al.).
  • Thrombin also converts the thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) into a carboxypeptidase (TAFIa) which cleaves lysine residues from fibrin and thereby prevents the formation of the tissue-plasminogen-activator-plasminogen-fibrin complex which is required for the transfer of plasminogen to plasminogen is (booth).
  • TAFI thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor
  • TAFIa carboxypeptidase
  • tissue extracts In vitro, the formation of thrombin in the blood or blood plasma and thus the start of the coagulation process by tissue extracts is made possible. Such extracts can best be obtained from the brain with aqueous media or with organic solvents (Morawitz).
  • the coagulation-active material which can be extracted with a suitable buffer solution and is called thromboplastin, consists of an apoprotein, the tissue factor, and coagulation-active lipids. Even small amounts of thromboplastin, when added to blood or plasma, lead to rapid clotting.
  • the clot-active component of the brain that can be extracted with organic solvents is called partial thromboplastin and essentially consists of clot-active lipids.
  • activating substances such as e.g. Kaolin or glass powder can be added.
  • the coagulation process triggered by thromboplastin is called the extrinsic pathway of blood coagulation
  • the coagulation process caused by the partial thromboplastin is called the intrinsic pathway.
  • Both processes have in common that they convert the coagulation factor X into Xa, albeit in a different way. Accordingly, a distinction is made between the extrinsic and intrinsic tenase pathway in the first part of the coagulation process, which leads to the activation of the coagulation factor X.
  • prothrombinase the coagulation factor Xa converts prothrombin into thrombin. This process is called the common pathway.
  • the enzyme system that generates the coagulation factor Xa with the help of thromboplastin is called the extrinsic tenase complex, in contrast to the enzyme system in which the partial thromboplastin plays a role, the intrinsic tenase complex.
  • tissue factor together with the coagulation factor Vlla, triggers blood clotting after injuries with the participation of platelets (Rapaport et al.).
  • Tissue factor occurs in almost all tissues in very different amounts together with coagulation-active lipids and both substances form the extrinsic tenase complex when they come into contact with blood, since small amounts of the activated coagulation factor VII are constantly present in the blood (Drake et al. ).
  • the extrinisic tenase complex converts both the coagulation factor X into Xa and the coagulation factor IX into IXa, which also converts X into Xa.
  • the activation of factor X and the subsequent formation of thrombin comes to a standstill very quickly due to the tissue factor pathway inhibitor (TFPI).
  • TFPI tissue factor pathway inhibitor
  • the intrinsic tenase complex is composed of the activated coagulation factors IXa, Villa and coagulation-active phospholipids and is not inhibited by TFPI (by Borne et al.).
  • the action of the enzyme coagulation factor IXa which converts the coagulation factor X into Xa, is increased in the intrinsic tenase complex by 100,000 to 1,000,000 times. This increase is due to the cofactor Villa, which is not itself an enzyme, and certain phospholipids with an optimal Ca ion concentration.
  • the individual coagulation factors and platelets - the essential components in the blood responsible for the coagulation process - are usually present in large excess. Only when one of these components is reduced by 90% or more does an increased bleeding tendency become noticeable. Life-threatening bleeding only occurs when deficiency conditions occur in which a coagulation factor or the platelets only show a few percent of their normal value.
  • the central importance of the tissue factor for triggering the coagulation process and its widespread use in all organs is out of the question, but in tissues with a low tissue factor content severe disorders of blood coagulation occur precisely when a factor of the intrinsic tenase complex or the prothrombinase complex is pathological is reduced. The most important examples of this are patients suffering from hemophilia A or hemophilia B.
  • Thrombin mostly of bovine origin, is used as a non-parenteral drug for hemostasis of superficial injuries. Its hemostyptic effect could be significantly improved by the joint use with fibrinogen-containing drugs (Gray; Young et al.). Fibrinogen and thrombin are now predominantly obtained from allogeneic starting material in accordance with their species-specific application. The combined use of thrombin with fibrinogen-containing drugs tries to understand or improve the physiological blood coagulation and the hemostasis that occurs. This can also be achieved in patients with severe bleeding disorders (Matras et al.).
  • fibrinogen-thrombin mixture the fibrinogen content of which is 10 to 20 times the blood, and large amounts Thrombins (100 - 1000 U per mL) manage to reduce the clotting time in such a fibrinogen-thrombin mixture to the second range and to achieve a 10 to 100-fold reduction compared to the physiological bleeding time. This made it possible, with the optimal application of such fibrinogen-thrombin mixtures, to achieve immediate hemostasis as long as no large blood vessels, in particular arterial ones, were injured (Spangier).
  • the fibrinogen converted to fibrin by thrombin adheres to the wound bed in the same way as clotted blood, the transglutaminases activated under thrombin also apparently leading to covalent bonds between the injured tissue and the fibrin formed.
  • This strong adherence of the formed fibrin to the tissue can also be used for gluing non-bleeding tissues, since in most cases the formed fibrin does not interfere with the healing of the glued tissue and is largely broken down within days to weeks (Matras et al.).
  • a delayed start of the coagulation process is desirable when tissue parts are glued and with seals.
  • the tissue parts to be glued can be better adapted, and similar adaptations are also required for seals.
  • the coagulation process has been delayed by reducing the thrombin concentration to about 1% of the amount of thrombin used for hemostasis.
  • both the use of high and low thrombin concentrations have several disadvantages.
  • bovine material for the production of medicinal products containing thrombin. Since the possible transmission of prions by any organs used by cattle cannot be excluded with certainty, the use of bovine thrombin has declined sharply today.
  • Bovine thrombin has the further disadvantage that it acts as an antigen for other species and can cause allergies and anaphylaxis. Blood clotting disorders have also been observed in patients treated with bovine thrombin, since thrombin can cause the formation of antibodies against coagulation factors which can cross-react with human coagulation factors and thus delay blood clotting.
  • thromboplastin which was produced from animal starting material, mostly bovine brain, was frequently used to activate the thrombin because of the good yield. Because of the possibility of transferring prions, thromboplastin from animal starting material is largely excluded for the production of thrombin and a poorer yield of thrombin is accepted.
  • the invention therefore has the object, inter alia, of providing a virus-safe, thrombin-generating, pharmaceutical active substance preparation which
  • thrombin Formulated into a medicinal product capable of producing thrombin and mixed with a medicinal product containing fibrinogen, a complete and homogeneous mixture of these components results without complete mixing being prevented by clotting that is too rapid. However, not only the complete mixing, but also the adaptation of the tissue parts to be sealed or sealed should be made possible before the coagulation begins. The formation of thrombin must continue even after the onset of coagulation in order to convert all the fibrinogen, factor XIII and TAFI present in the clot into fibrin, factor Xllla and TAFIa in order to ensure permanent wound closure formed by fibrin, and in that
  • the prothrombin contained is converted as completely as possible into thrombin and, after further purification, it can be processed into a medicinal product containing thrombin.
  • This medicinal product can be used as such or together with other medicinal products containing fibrinogen.
  • the pharmaceuticals produced from the thrombin-generating pharmaceutical active substance preparations should only contain allogeneic material of this species and likewise only species-specific proteins should be used in the production. All starting materials and auxiliary materials used are to exclude the possibility of transmission of prions.
  • the generation of thrombin from prothrombin in vivo and in vitro should be as complete as possible, since only the prothrombin present in the clot is available for the formation of further thrombin in the already clotted fibrinogen.
  • A from plasma or genetically engineered prothrombin (coagulation factor II), (B) plasma or gene coagulation factors V, VIII, IX, X, which may be at least partially in the activated state, and plasma or gene coagulation factor Xla, and
  • the active substance preparation according to the invention preferably contains coagulation factor VII obtained from plasma or genetically engineered or a mixture of coagulation factors VII and VIIa obtained from plasma or genetically engineered. It also preferably contains a genetically engineered tissue factor as such or in a relipid form.
  • the active substance preparation according to the invention can also consist of two or more plasma fractions and the coagulation-active phospholipids, the individual plasma fraction containing one or more coagulation factors or activated coagulation factors of components (A) and (B).
  • the plasma fraction mixture must contain all coagulation factors or activated coagulation factors contained in components (A) and (B), with tissue factor preferably also being added.
  • the coagulation factors are in particular produced exclusively from blood plasma of a particular mammal species or from the corresponding genetically engineered coagulation factors or activated coagulation factors, including tissue factor.
  • the prothrombin, the coagulation factors V, VIII, IX, X, Xla and, if appropriate, the coagulation factors VII and Vlla, and the tissue factor by virus inactivation and / or virus depletion are advantageously virus-safe.
  • the pharmaceutical active substance preparation according to the invention can be in deep-frozen or freeze-dried form.
  • the invention further relates to a drug capable of thrombin generation, which can be produced from a pharmaceutical preparation according to the invention.
  • the medicinal product capable of generating thrombin can be in the deep-frozen or freeze-dried state.
  • a preferred embodiment of the medicinal product capable of generating thrombin is characterized in that it additionally contains thrombin in such an amount that it does not contain more than 1 unit of thrombin per ml after thawing or reconstitution.
  • the invention further relates to a thrombin-containing medicament which can be produced from a pharmaceutical active substance preparation capable of generating thrombin according to the invention. It can be frozen or freeze-dried.
  • the invention also relates to a pharmaceutical mixture which coagulates within 30 to 300 seconds before it is used by mixing a pharmaceutical according to the invention with a pharmaceutical containing fibrinogen.
  • the invention also relates to a thrombin-containing drug, which is mixed with the above drug mixture, clots within 3 to 10 seconds.
  • a preferred method for producing a thrombin-containing pharmaceutical active substance preparation according to the invention is characterized in that a thrombin-generating active substance preparation according to the invention is mixed with Ca ions, a thrombin-containing product being formed, which is then purified by chromatography.
  • an advantageous embodiment of the method according to the invention is that the active substance preparation is made virus-safe by virus inactivation during or after thrombin formation, and by virus depletion after thrombin formation has been completed.
  • the invention also relates to a method for producing a procofactor concentrate containing the coagulation factors V and VIII, and is characterized in that cryoprecipitate obtained from plasma is dissolved and fibrinogen is separated from the solution, a solution containing the coagulation factors V and VIII being obtained. which can be mixed with calcium chloride.
  • Another method according to the invention relates to the production of a coagulation factor-XI-containing prothrombin complex concentrate containing the coagulation factors II, VII, VIIa, IX, X and XI, with 1.0 ⁇ g of prothrombin per At least 0.030 ⁇ g of coagulation factor Xla are contained, and is characterized in that cryoprecipitate supernatant obtained from plasma is adsorbed on an anion exchanger and, after washing the adsorbate and stored in the cold, eluting with a clot factor Xla-containing prothrombin complex.
  • the invention is based on the knowledge that a practically complete, time-controllable formation of ⁇ -thrombin from virus-safe prothrombin takes place through a virus-safe intrinsic tenase-prothrombinase complex.
  • the intrinsic tenase-prothrombinase complex is formed by activating the corresponding virus-safe or virus-made coagulation factors in the presence of optimal cation concentrations with prion-safe, coagulation-active phospholipids and the virus-safe activator substance coagulation factor Xla and / or the virus-safe activator substances coagulation factor Vlla.
  • a pharmaceutical active substance preparation consisting of three components (components A, B and C) for the production of a virus-safe, thrombin-generating or thrombin-containing medicament, the pharmaceutical active substance preparation being characterized in that
  • component A is a virus-safe prothrombin made from plasma or genetically engineered as a pharmaceutically active substance
  • virus-safe, plasma or genetically engineered coagulation factors V, VIII, IX, X, Xla as pharmaceutically active substances and, if in addition to the formation of the prothrombinase and intrinsic tenase complexes, the formation of extrinsic tenase complex is also to be induced, the virus-safe coagulation factors VII and / or Vlla and tissue factor as pharmaceutically active substances, and
  • Component C fully synthetic, coagulation-active phospholipids as pharmaceutically active substances with a transition point of the paracrystalline to the liquid-crystalline form that is above 15 ° C contains.
  • a mixture of the pharmaceutically active substances contained in components (A) and (B), ie the coagulation factors or activated coagulation factors, can also be obtained by mixing two or more plasma fractions, in which all necessary, pharmaceutically active substances are contained and those Tissue factor can be added if necessary.
  • thrombin After mixing the three components and adding an optimal amount of CaCl 2 , thrombin is formed depending on the temperature between 0 ° and 40 ° C., the rate of thrombin formation increasing with increasing temperature.
  • Component A is produced by dissolving freeze-dried, virus-safe prothrombin or thawing a frozen solution of virus-safe prothrombin and the preparation of a prothrombin stock solution with 10-100 units of prothrombin per ml and a content of 0.1% sodium citrate at pH 7.3.
  • the value of the stock solution is determined by determining the prothrombin units with the help of a coagulation factor II deficiency plasma, with which a calibration curve was created using a reference normal plasma.
  • Component B is produced by mixing stock solutions of virus-safe coagulation factors V, VIII, IX, X, Xla, and coagulation factors VII, Vlla and tissue factor.
  • concentrations of the individual coagulation factors in their stock solutions are between 10 - 100 units per mL; the tissue factor stock solution contains 25 ⁇ g / mL.
  • a coagulation factor Va stock solution can also be used instead of a stock solution of coagulation factor V a coagulation factor Va stock solution can also be used.
  • the content of an individual coagulation factor in a stock solution is determined using the corresponding deficiency plasmas and a standard curve with pooled normal plasma is established to determine each individual coagulation factor.
  • mixtures of components A and B are prepared, each containing a unit of coagulation factors II, V, VIII, IX, X, Xla and II, and Xla , VII, Vlla with 2.5 ⁇ g tissue factor per mL of the preparation.
  • the thrombin formation at 26 ° C. is determined at appropriate time intervals.
  • Prothrombin consumption and the formation of ß- and ⁇ -thrombin are also determined in these approaches.
  • the conversion of prothrombin to thrombin is carried out in the presence of 0.1% PEG and the amounts of coagulation factors and tissue factor per ml are determined which are necessary in order to achieve optimal thrombin generation.
  • Mixtures of components A and B can also be obtained from two or more plasma fractions, provided that they contain all coagulation factors and activated coagulation factors, which are necessary for the formation of the intrinsic tenase and prothrombinase complexes, as pharmaceutically active substances.
  • the intrinsic tenase pathway is activated either by the coagulation factor Xla or via the extrinsic tenase pathway, especially if no TFPI is present. It is also possible to activate the intrinsic tenase pathway simultaneously using the coagulation factor Xla and via the extrinsic tenase pathway.
  • coagulation factors which are necessary for the formation of the intrinsic tenase complex, it can be determined, both by adding or by the presence of the coagulation factor Xla, whether at least 90% of the prothrombin present is converted to thrombin, and if not, which Amounts of factor VIIa and tissue factor are required to achieve such a practically complete conversion of prothrombin to thrombin.
  • An excess of coagulation-active phospholipids is used to generate thrombin.
  • the activation is carried out either at 26 ° C or 37 ° C and an optimal Ca ion concentration.
  • virus safety of the coagulation factors used, or of the plasma fractions containing coagulation factor, and of the tissue factor obtained by genetic engineering is achieved by virus inactivation, for example by the solvent / detergent method, and subsequent virus depletion by means of nanofiltration.
  • Component C is produced from mixtures of fully synthetic, and thus prion-safe, choline or serine phospholipids or from choline-serine-ethanolamine phospholipids. Only phospholipids are used whose phase transition temperature from the paracrystalline gel state to the liquid crystalline state is between 15 ° and 40 ° C.
  • the phospholipid mixtures can be used to produce emulsions which have liposomes with a diameter of 20 nm to 1,000 nm and which have polar components of the phospholipids in an outer membrane. With the help of temperatures between 50 ° C and 100 ° C, liposomes with a diameter of 20 nm - 200 nm can be produced.
  • Such emulsions can be sterilized with the aid of bacteria-proof filters, filled sterile, dried and stored and stored under nitrogen. The freeze-dried emulsions can be reconstituted by adding water.
  • virus safety of the coagulation factors used and of the non-relipidated tissue factor is achieved by virus inactivation, preferably with the solvent / detergent method and subsequent, extensive removal of the solvent / detergent. Quantifiable traces of the solvent used, trinitrobutyl phosphate, and the detergent, Tween 80 remain in the thrombin-containing solution.
  • Virus depletion is preferably carried out by nanofiltration after prior clarification filtration, which is gradually achieved with increasingly narrow-pored filters, starting with a pore size of 5,000 nm, descending to 35 nm. Preferably, after filtration through a 35 nm nanofilter, nanofilters with pore sizes of 20 can also be used nm and 15 nm are filtered.
  • the thrombin generation of this pharmaceutical preparation is strongly temperature-dependent. It is therefore possible, by mixing components A, B, and C, even with optimal Ca ion concentration, to prevent thrombin formation from prothrombin, provided that work is carried out at low temperatures around freezing point.
  • the active substance preparation according to the invention can be deep-frozen for storage. It can also be freeze-dried and stored at temperatures between 0 ° C and 25 ° C.
  • the thrombin-generating, pharmaceutical active substance preparation can be formulated at low temperatures to form a medicament with a thrombin generation capacity of preferably 100 to 1,000 units of thrombin per ml, sterile filtered and portioned.
  • the thrombin-generating, pharmaceutical active ingredient preparation is also used for the production of thrombin-containing drugs.
  • Thrombin generation is preferably carried out at temperatures between 20 ° C and 40 ° C.
  • the virus inactivation can be carried out during or after thrombin generation.
  • the virus-inactivating substances can be removed together with a subsequent cleaning of the generated thrombin. It is possible to obtain a thrombin-containing, pharmaceutical active substance preparation with a thrombin content of 1,000 to 10,000 units per ml, which can be virus-depleted by clarifying filtrations and subsequent nanofiltration.
  • the virus-safe preparation of active ingredient can then be formulated and sterile filtered to be processed into a pharmaceutical.
  • medicinal products capable of generating thrombin and / or thrombin together with medicinal products containing fibrinogen can be used for hemostasis, for tissue bonding in combination with sutures or for sealing cavities and vessels against the escape of gases and liquids.
  • the clotting time of such a mixture can be adjusted to 30 to 300 seconds by mixing a drug capable of producing thrombin with a drug containing fibrinogen and possibly adding small amounts of thrombin become. This enables complete mixing of the medicinal products even when such a mixture has a high viscosity.
  • a drug capable of producing thrombin with a drug containing fibrinogen and possibly adding small amounts of thrombin become.
  • This enables complete mixing of the medicinal products even when such a mixture has a high viscosity.
  • the pharmaceuticals after the pharmaceuticals have been mixed thoroughly, there is a sufficiently long period of time for the necessary adaptation of the tissue parts which are to be glued or sealed.
  • thrombin is further formed in the already partially coagulated fibrinogen, so that after some time - up to several hours - practically all of the prothrombin is converted into thrombin and all of the fibrinogen converted into fibrin.
  • Such continued thrombin formation not only enables the homogeneous formation of fibrin in the already clotted fibrinogen, but also the uniform activation of factor XIII and the resulting crosslinking of the fibrin formed, as well as the activation of TAFI and the resulting cleavage of the terminal lysine residues of the fibrin ,
  • fibrinogen-containing mixtures for hemostasis requires a very short clotting time.
  • drugs containing fibrinogen can be mixed completely with drugs capable of producing thrombin and such mixtures then together with a thrombin solution which has a high Has thrombin content to be applied to the bleeding site.
  • a further possibility of triggering spontaneous thrombin formation in a thrombin-generating coagulation factor mixture consisting of prothrombin complex and factor VIII is the addition of factors of the contact system.
  • the coagulation factors XI and XII if they are not already present in the mixture, must be added.
  • coagulation factor XI The activation of the coagulation factor XI in vivo has not yet been fully clarified. What is certain is that blood cells and cells of the endothelium play an essential role in this activation process.
  • Factor XI is bound in the blood in a non-covalent form to high molecular weight kininogen (K d 10 "8 ) and prothrombin (K d 10 " 7 ). These complexes can attach to activated platelets, with the coagulation factor XI being activated in the presence of thrombin and / or coagulation factor XIla.
  • the coagulation factor XI can be activated in vitro by coagulation factor Xlla on negatively charged surfaces, in that coagulation factor Xlla is formed from clotting factor XII by kallikrein.
  • the formation of kallikrein from the pre-kallikrein present in the blood can take place by different mechanisms, such as by precallic acid activator or metal salts of ellagic acid.
  • spontaneous thrombin generation can be triggered in a thrombin-forming coagulation factor mixture consisting of prothrombin complex and coagulation factor VIII by activating the coagulation factor XI contained therein, all components of this mixture having been virus-inactivated beforehand.
  • This activation is preferably carried out in the presence of prion-safe, coagulation-active phospholipids with virus-safe kallikrein.
  • virus-inactivated precallikrein with virus-inactivated precallicin activator or activators e.g. Metal salts of ellagic acid can be used.
  • virus inactivation can also take place during or after thrombin generation.
  • 100 mg of virus-safe prothrombin is dissolved in 1 L 0.1% sodium citrate solution at pH 7.5 and the prothrombin content per mL is determined using a prothrombin-deficient plasma.
  • the amount of meizothrombin and thrombin formed is determined by reaction of chromogenic substrate S-2238 after the addition of ecarin.
  • thrombin formation is carried out using a prothrombinase preparation.
  • the thrombin formed is determined as a thrombin time using a fibrinogen solution. With this fibrinogen solution, a standard curve was previously established using the international standard for ⁇ -thrombin.
  • This prothrombin stock solution can be stored frozen at -20 ° C for at least six months.
  • Virus-safe, highly purified coagulation factor concentrates which were obtained from plasma or by genetic engineering, are dissolved in 0.1% sodium citrate pH 7.5 and mixed with stirring: 3.2 mg factor V, 0.2 mg factor VIII, 5.0 mg factor IX, 11 mg factor X and 0.5 mg factor Xla. After sampling, the solution is frozen and stored at -20 ° C or below. The amount of a 1 M CaCl 2 solution which is required in order to bring the Ca ion activity equivalent to a 5 mM - 8 mM CaCl 2 solution is determined on an equivalent sample.
  • Example 1 The frozen solutions of component A, manufactured according to Example 1, and component B, manufactured according to Example 2, are carefully thawed, the temperature should not rise above 4 ° C.
  • a mixture of equal parts of component A and component B is prepared from the solutions obtained, the necessary samples are taken, and the mixture of the components is again frozen and stored at -20 ° C. Preparation of a mixture of plasma fractions containing the coagulation factors of components A and B.
  • cryoprecipitate After 10 g of deep-frozen source plasma, the cryoprecipitate is separated from the cryoprecipitate supernatant after careful thawing, which does not exceed 4 ° C., by centrifugation at 6,000 g for 15 minutes.
  • the cryoprecipitate supernatant is mixed with 16 g of weak DEAE-Sephadex A-50 anion exchanger, the pH is adjusted between 7.8 and 8.8 with 0.1 normal sodium hydroxide solution and for one hour at a temperature between 3 ° C and 6 ° C touched.
  • the mixture can be kept at this temperature for a maximum of 24 hours before the ion exchanger is separated off by filtration and / or centrifugation.
  • the liquid freed from the ion exchanger is kept for obtaining further plasma fractions and the separated ion exchanger is further processed for obtaining the prothrombin complex.
  • the ion exchanger thus separated can be stored for up to 100 hours at a temperature between 4 ° and 6 ° C.
  • the separated ion exchanger is washed twice with 1 L of 0.5% saline solution and the coagulation factor-Xla-containing prothrombin complex is obtained by eluting the ion exchanger with 1,000 mL of a 0.3 M NaCI solution at pH 7.5. After the elution, the ion exchanger is washed again with 500 ml of 0.3 M saline solution at pH 7.5 and the washing liquid is combined with the eluate. In this total eluate, the amount of prothrombin present is determined with the aid of Ecarin and the total eluate is diluted to the desired prothrombin content, which can be between 2 and 5 prothrombin units per mL.
  • the total eluate as a coagulation factor-Xla-containing prothrombin complex concentrate can be stored in a frozen state at -20 ° C after freezing.
  • the content of coagulation factors and activated coagulation factors is determined with the aid of samples taken before freezing.
  • the cryoprecipitate sedimented from plasma by centrifugation is dissolved in 750 mL 0.3% citrate buffer pH 7.0 and mixed with 110 g glycine. After stirring for one hour at a temperature between 0 ° C. and 2 ° C., the precipitated fibrinogen is separated off by centrifugation at 3,000 g for 15 minutes and the supernatant, which contains the coagulation factors V and VIII, is frozen. In a sample of the supernatant diluted 1:10 with water, the content of factor VIII is determined, as is the amount of CaCl 2 required for recalcification in order to obtain an ion activity equivalent to a 5 mM CaCL 2 solution. The frozen solution can be stored at -20 ° C.
  • Pro-cofactor concentrate is produced in amounts of 0.1; 0.2; 0.4 and 0.8 mL to 1 mL each according to example 4 a.
  • Prothrombin concentrate prepared added. 0.1 ml of a liposome emulsion prepared according to Example 5 is added to each of these mixtures. After incubation for 8 hours at 26 ° C., the amount of the pro-cofactor concentrate is determined which is required to convert 90% or more of the prothrombin present to thrombin.
  • component C without emulsifier.
  • Fully synthetic and therefore virus and prion safe phospholipids are used.
  • 200 mg 2Na-1, 2-di-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine, 400 mg 1, 2, di-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine and 400 mg of di-oleoyl-ethanolamine- Phospholipid are dissolved in 10 mL chloroform and the solution is evaporated to dryness in a 250 mL round bottom flask by heating and rotating the flask. The residues of chloroform are completely removed with the aid of a stream of nitrogen and 10 ml of a 0.1% citrate buffer solution pH 7.3 are added.
  • the phospholipid film located on the inner wall of the round bottom flask is completely emulsified in the buffer solution at 65 ° C and repeatedly shaken during the emulsification with a vortex device until the entire lipid film has disappeared from the inner surface of the flask.
  • the emulsion as such or 1:10 is diluted with 0.1% citrate buffer pH 7.0, filtered through a filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m and subsequently sterile filtered through a filter with a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • This liposome emulsion can be stored sterile in the refrigerator and is shaken with a vortex device for 1 minute before use.
  • the emulsion according to the European Pharmacopoeia tested for sterility and pyrogens (Eur Pharm 4 th Edition 2002 Pages 123-126, 2.6.1 Sterility pages 131 -.... 132 2.6.8 pyrogen.).
  • Either coagulation factor Xla alone or together with coagulation factor XI or coagulation factor Vlaa is used as activator substance. preferably with tissue factor.
  • Coagulation factor Xla can also be used together with coagulation factor Vlla and tissue factor.
  • the activated coagulation factors or the tissue factor are virus-inactivated by a solvent detergent method and, after removal of the solvent / detergent, subjected to virus depletion by nanofiltration.
  • tissue factor Xla / mL a. 30 ⁇ g factor Xla / mL; b. 30 ⁇ g factor Xla and 50 ng factor XI / mL; c. 30 ⁇ g factor Xla and 20 ng factor VI la / mL; d. 30 ⁇ g factor Xla and 20 ng factor Vlla and 10 ng tissue factor / mL; e. 10 ⁇ g / mL tissue factor
  • a dilution series of the individual activator substances are added to 1 mL of coagulation factor mixture, which is obtained according to Example 3 or 4, and mixed with 10 ⁇ L of a 1: 100 diluted liposome emulsion according to Example 5. After recalcification, the mixtures are kept at 26 ° C and 37 ° C, respectively. At intervals of 10, 30, 60 and 120 min, the amount of factor Xa formed is determined using the chromogenic substrate S-2251.
  • the activator substance used to produce a thrombin-generating pharmaceutical active substance preparation which, after recalcification, forms the largest amount of factor Xa with the coagulation factor mixtures prepared according to Example 3 or 4.
  • a virus-safe coagulation factor mixture (components A and B) prepared according to Example 3 is, after thawing, if necessary, mixed with a virus-safe activator substance selected according to Example 7 in the appropriate amount and the mixture is stirred at 0 ° to 2 ° C. for 15 minutes , The amount of liposome emulsion (component C) determined according to Example 5 is added to this mixture.
  • This mixture is brought to a concentration of 0.9% NaCl with solid sodium chloride, if necessary, subjected to clarification filtration and then sterile filtered through a filter with a pore size of 0.22 ⁇ m and / or 0.1 ⁇ m.
  • thrombin-generating active substance preparation thus obtained is frozen after sampling and stored at -20 ° C.
  • the necessary tests for stability and freedom from pyrogens are carried out according to the European Pharmacopoeia.
  • the thrombin-generating capacity is determined after recalcification at 37 ° C. for 2 hours, and protarin, which is still present, can be activated by ecarin in order to ensure the at least 90% conversion of the existing prothrombin to thrombin.
  • the thrombin-containing solution can either be frozen and stored or processed immediately or after thawing.
  • an appropriate sodium citrate solution By adding an appropriate sodium citrate solution, a 25 mMolarity and a pH of 6.5 are set and, with further stirring at room temperature, as much polyethylene glycol with a molecular weight between 6,000 and 8,000 is added until a 0.1% solution is obtained.
  • a 20% strength CM Sepharose suspension washed with 0.025 M sodium citrate pH 6.5 is added with stirring until at least 95% of the thrombin present is adsorbed on the CM Sepharose.
  • the required amount of CM-Sepharose is determined in a request by determining the smallest amount of the 20% emulsion which adsorbs at least 95% of the thrombin present.
  • CM-Sepharose is centrifuged off between 3,000 and 5,000 g for 30 minutes, the sediment is resuspended in 25 mM citrate buffer pH 6.5 and poured into an appropriate column.
  • the column is washed with 1% citrate buffer, which still contains 0.1% PEG, at pH 6.5 and eluted with a saline gradient in the presence of 0.1% citrate and 0.1% PEG at pH 6.5.
  • the saline gradient is established between 10 and 200 mM.
  • the fractions containing the most thrombin are collected, diafiltered and brought to a concentration of about 500 U thrombin per ml.
  • Such a solution can be frozen, stored after freeze-drying or processed immediately.
  • the thrombin-containing solution is filtered through a nanofilter with a pore size of 35 nm and preferably through further nanofilters with pore diameters of 20 and 15 nm.
  • the virus-depleted thrombin solution thus obtained is concentrated by ultrafiltration with the aid of a 30 KD filter to a content of more than 5,000 U thrombin per ml and stored frozen or freeze-dried.
  • Such a diluted sample is mixed with equal parts of a 5-10% fibrinogen-containing drug, which is provided as part of a fibrin glue kit, and the clotting time of this mixture is determined after recalcification. If the clotting time at 37 ° C. is longer than 150 seconds, as much thrombin produced according to example 8 is added to the active substance preparation according to example 7 until the clotting time has dropped to between 100 and 150 seconds.
  • the amounts of thrombin thus determined are added to the active ingredient obtained according to Example 9 with stirring at a temperature of between 0 ° C. and 2 ° C. and this mixture is sterile filtered after clarification filtration.
  • the sterile bulk solution obtained is preferably portioned, filled and freeze-dried into end-user bottles at the same low temperature.
  • the freeze-dried powder is dissolved with a sterile 5 mM CaCl 2 solution.
  • thrombin-containing, virus-safe drug After thawing or dissolving with sodium chloride, an active substance preparation according to Example 10 is brought to a concentration of 0.9% NaCl and then the desired thrombin concentration is adjusted to between 500 and 5000 units per ml by adding an isotonic sodium chloride solution. It is added as much PEG that a 0.1% strength solution is formed and with the aid of a 10% CaCl 2 - solution is a 5 mM CaCl 2 solution is obtained. This solution is sterile filtered, portioned sterile and filled into end-user vessels and can be frozen or stored after freeze-drying. The freeze-dried thrombin solution is reconstituted with WFI.
  • the mixture of these two drugs is stirred vigorously under sterile conditions for about 20 seconds and the homogeneous mixture obtained in this way is applied to the area to be glued or sealed after the tissue parts to be glued or sealed have been adapted and held in the adapted position for as long as until the mixture of both drugs has curdled. If necessary, the tissue parts can remain in a fixed position for a long time, which can be up to several hours.
  • 0.2 ml of a thrombin-containing medicament according to example 12 with 2,000 units of thrombin per ml are added to 2.0 ml of a pharmaceutical mixture according to the invention according to Example 13 and mixed rapidly. To stop the bleeding, this mixture is quickly applied to bleeding areas, if possible after removal of accumulated blood, either by suction or suction or by blowing the blood. 15. Determination of the coagulation factor XI and the coagulation factor XII in ion exchanger eluates according to Example 4a, which are not stored after loading, but eluted immediately after washing the loaded ion exchanger. The determination is made with the help of the corresponding coagulation factor deficiency plasmas from American Diagnostica.
  • kallikrein activity is determined using the chromogenic substrate S-2403, a 4 mM chromogenic substrate solution being used for the determination, which is present in a 0.4 mM concentration in the total batch.
  • the precallicine concentration is also determined using chromogenic substrate S-2403 by adding the same volume of a 0.5% kaolin suspension in a 1:10 dilution and incubating for 5 minutes at 37 ° C. with shaking. The absorbance, which is obtained without activation with kaolin suspension, is subtracted from the measured absorbance and the quantities or units of precallikrein are determined on a standard curve.
  • precallikrein activator The determination is carried out in the same way as the determination of precallikrein, except that a series of concentrations of precallikrein activators is produced instead of kaolin suspensions. If copper salts of ellagic acid are used, a concentration series of between 10 ng and 10000 ng is used, which forms the maximum amount of kallikrein from a given amount of prekallikrein within 5 minutes at 37 ° C.
  • TAFIa is determined using a
  • TAFI Activity Kits from American Diagnostika without the addition of activator (thrombin).
  • the TAFIa content is derived from a standard curve calculated, which was determined with dilutions of plasma and subsequent activation with thrombin and measurement of TAFIA activity using a chromogenic substrate.
  • XII takes place according to the European Pharmacopoeia Suppl. 4.5. 07/2003, p. 3687 without using activators of factor XIII (thrombin).
  • the activity of the sonicated phospholipid Emulsion is carried out with the aid of a reference plasma and a kaolin suspension by determining the partial thromboplastin time, 100 ⁇ L plasma are incubated with 50 ⁇ L of a liposome emulsion and 50 ⁇ L of a 0.5% kaolin suspension for 5 minutes at 37 ° C., recancified, and the clotting time at 37 ° C.
  • the required amount of liposome emulsion, which causes the shortest clotting time, is determined ..
  • the effectiveness of the liposome emulsions listed in Examples 5 and 6 can be determined by this method, as can the phospholipid emulsions listed in Example 18.
  • the optimal mixture of a phospholipid mixture with kaolin is determined, which shows the greatest activity in the APTT with plasma with optimal ultrasonication.
  • the test is carried out with 100 ⁇ L of the sonicated mixture, which was incubated with 100 ⁇ L plasma for 5 min at 37 ° C. and is recalcified by adding 100 ⁇ L of a CaCl solution.
  • the sound is carried out as in Example 21, with an 80% pulsation interval being used at levels 1, 2 and 3 and, in corresponding approaches, a 10, 30, 100 and 300 second sound exposure ,
  • MacFarlane R.G An enzyme cascade in the blood clotting mechanism and its funetion as an biochemical amplifier. Nature 1964; 202: 498-9

Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Wirkstoffzubereitung zur Herstellung eines thrombingenerierfähigen oder thrombinhältigen Arzneimittels und ist dadurch gekennzeichnet, dass sie enthält: (A) aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenes Prothrombin (Gerinnungsfaktor II), (B) aus Plasma oder gentechnologisch gewonnene Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, die zumindest teilweise in aktiviertem Zustand vorliegen können, und aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor Xla, und (C) prionensichere, gerinnungsaktive Phospholipide, wobei die Phospholipide gegebenenfalls in Liposomen enthalten sind.

Description

THROMBINGENERIERFAHIGE UND THROMBINHALTIGE PHARMAZEUTISCHE WIRKSTOFFZUBEREITUNGEN UND ARZNEIMITTEL
Die Erfindung betrifft eine thrombingenerierfäliige und thrombinhältige pharmazeutische Wirkstoffzubereitung und daraus hergestellte Arzneimittel.
Einleitung
Werden Blutgefäße verletzt, so tritt Blut aus dem vaskulären Raum aus und gerinnt. Die verletzten Blutgefäße werden durch das gerinnende Blut verschlossen und schützen so den Organismus vor großen Blutverlusten. Die Blutgerinnung wird durch das Enzym Thrombin verursacht, das sich aus seinem Zymogen, Prothrombin, generiert und die Umwandlung des im Blutplasma vorhandenen Proteins Fibrinogen in unlösliches Fibrin bewirkt. Das austretende Blut gerinnt innerhalb von Minuten, wobei nur ein Sechstel des im Plasma enthaltenen Fibrinogens in Fibrin umgesetzt wird. In dem noch stark fibrinogenhältigen geronnenen Blut setzt sich die Thrombinbildung weiter fort, so dass es schließlich zu einer kompletten Umwandlung des gesamten, im geronnenen Blut noch vorhandenen Fibrinogens in Fibrin kommt. Dieser Vorgang der fortgesetzten Thrombinbildung und Gerinnung nimmt längere Zeit in Anspruch und kann auch erst nach mehreren Stunden vollständig beendet sein.
Bei der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin bewirkt Thrombin zunächst die Abspaltung bzw. teilweise Abspaltung der Fibrinopeptide A und B von den beiden Enden des Fibrinogenmoleküls, wodurch zunächst noch lösliche Fibrinmonomere entstehen. Diese können lateral zu Fibrillen aggregieren, die sich dann zu einem Fibrinnetzwerk ausbilden (Blombäck). Dieses im geronnenen Blut entstandene Fibrinnetzwerk haftet am verletzten Gewebe bzw. dem Wundbett an und führt so zur Blutstillung und zum Wundverschluss.
Thrombin bewirkt auch die Überführung des Gerinnungsfaktors XIII, des Zymogens des Gerinnungsfaktors Xllla, in eine Transglutaminase. Diese vernetzt Proteine wie Fibrin, Fibrinmonomere, Fibrinogen und andere im Blutplasma vorkommende Proteine durch kovalente Bindungen. Insbesondere die Quervernetzung von Fibrin ist für die Stabilität des sich ausbildenden Fibrinnetzwerkes von großer Bedeutung (Siebenlist et al.).
Thrombin führt auch den thrombinaktivierbaren Fibrinolyseinhibitor (TAFI) in eine Karboxypeptidase (TAFIa) über, die von Fibrin karboxyterminale Lysinreste abspaltet und dadurch die Bildung des Tissue-Plasminogen-Aktivator-Plasminogen-Fibrin- Komplexes unterbindet, der für die Überführung von Plasminogen in Plasmin erforderlich ist (Booth).
In vitro wird die Bildung von Thrombin im Blut oder Blutplasma und damit das Einsetzen des Gerinnungsvorganges durch Gewebsextrakte ermöglicht. Solche Extrakte können am besten aus Gehirn mit wässrigen Medien oder auch mit organischen Lösungsmitteln erhalten werden (Morawitz).
Das mit geeigneter Pufferlösung extrahierbare, als Thromboplastin bezeichnete gerinnungsaktive Material besteht aus einem Apoprotein, dem Tissue Faktor, und gerinnungsaktiven Lipiden. Schon geringe Mengen Thromboplastin, wenn sie Blut oder Plasma zugesetzt werden, führen zu einer schnellen Gerinnung.
Der mit organischen Lösungsmitteln extrahierbare gerinnungsaktive Bestandteil des Gehirns wird als partielles Thromboplastin bezeichnet und besteht im wesentlichen aus gerinnungsaktiven Lipiden. Bei Zusatz zu Blut oder Blutplasma kommt es nur dann zu einer schnellen Gerinnung, wenn noch aktivierende Substanzen, wie z.B. Kaolin oder Glaspulver, zugesetzt werden.
Daraus entstand die Vorstellung einer Aktivierungskaskade von Enzymen, die letztlich in der Entstehung des Enzyms Thrombin endet, das die Blutgerinnung veranlasst (Davie et al.; MacFarlane)
Der durch Thromboplastin ausgelöste Gerinnungsvorgang wird als extrinsic Pathway der Blutgerinnung bezeichnet, der durch das partielle Thromboplastin bewirkte Gerinnungsvorgang als intrinsic Pathway. Beide Vorgänge haben gemeinsam, dass sie, wenn auch auf unterschiedlichem Weg, den Gerinnungsfaktor X in Xa umsetzen. Demnach wird bei dem ersten Teil des Gerinnungsvorganges, der zur Aktivierung des Gerinnungsfaktors X führt, zwischen dem extrinsic und intrinsic Tenase-Pathway unterschieden. In einem weiteren Enzymkomplex, der Prothrombinase, setzt der Gerinnungsfaktor Xa Prothrombin in Thrombin um. Dieser Vorgang wird als common Pathway bezeichnet. Das Enzymsystem, das mit Hilfe von Thromboplastin den Gerinnungsfaktor Xa generiert, wird als extrinsic Tenasekomplex bezeichnet, im Gegensatz zu dem Enzymsystem, in dem das partielle Thromboplastin eine Rolle spielt, dem intrinsic Tenasekomplex.
Es ist die vorherrschende Ansicht, dass der Tissue Faktor gemeinsam mit dem Gerinnungsfaktor Vlla der nach Verletzungen unter Mitwirkung der Blutplättchen die Blutgerinnung auslöst (Rapaport et al.). Tissue Faktor kommt in fast allen Geweben in stark unterschiedlichen Mengen gemeinsam mit gerinnungsaktiven Lipiden vor und beide Substanzen bilden, wenn sie mit Blut in Berührung kommen, den extrinsic Tenasekomplex, da im Blut ständig geringe Mengen des aktivierten Gerinnungsfaktors VII vorhanden sind (Drake et al.). Der extrinisic Tenasekomplex führt sowohl den Gerinnungsfaktor X in Xa über als auch den Gerinnungsfaktor IX in IXa, der weiters X in Xa umwandelt. Die Aktivierung von Faktor X und die in weiterer Folge resultierende Bildung von Thrombin kommt aber durch den Tissue-Faktor- Pathway-Inhibitor (TFPI) sehr rasch zum Stillstand. Der temporär gebildete extrinsic Tenasekomplex sowie der Gerinnungsfaktor Xla führen unabhängig voneinander zur Aktivierung des intrinsic Tenasekomplexes, der in bezug auf Aktivierung des Gerinnungsfaktors X etwa 50fach aktiver ist als der extrinsic Tenasekomplex. Der intrinsic Tenasekomplex setzt sich aus den aktivierten Gerinnungsfaktoren IXa, Villa und gerinnungsaktiven Phospholipiden zusammen und wird nicht durch TFPI gehemmt (von dem Borne et al.). Das Enzym Gerinnungsfaktor IXa, das den Gerinnungsfaktor X in Xa überführt, ist im intrinsic Tenase-Komplex in seiner Wirkung um das 100.000 bis 1 ,000.000fache gesteigert. Diese Steigerung erfolgt durch den Kofaktor Villa, der selbst kein Enzym ist, und bestimmte Phospholipide bei optimaler Ca-Ionenkonzentration.
Da der intrinsic Tenasekomplex sehr schnell Gerinnungsfaktor X in Xa überführt und dieser mit dem Kofaktor Va und gerinnungsaktiven Phospholipiden Prothrombin aktiviert, kommt es zu einer äußerst raschen Bildung großer Mengen Thrombins (Mann et al.).
Die einzelnen Gerinnungsfaktoren und Blutplättchen - die wesentlichen, für den Gerinnungsvorgang verantwortlichen Komponenten im Blut -, sind normalerweise in großem Überschuss vorhanden. Erst bei einer Verminderung um 90% oder mehr einer dieser Komponenten macht sich eine erhöhte Blutungsneigung bemerkbar. Zu lebensbedrohiichen Blutungen kommt es erst, wenn Mangelzustände auftreten, bei denen ein Gerinnungsfaktor bzw. die Blutplättchen nur mehr einige Prozent ihres Normalwertes aufweisen. Die zentrale Bedeutung des Tissue Faktors für die Auslösung des Gerinnungsvorganges und seine weite Verbreitung in allen Organen steht zwar außer Frage, aber in Geweben mit niederem Tissue-Faktorgehalt treten schwere Störungen der Blutgerinnung gerade dann auf, wenn ein Faktor des intrinsic Tenasekomplexes oder des Prothrombinasekomplexes pathologisch vermindert ist. Die wichtigsten Beispiele hierfür sind Patienten, die an einer Hämophilie A oder Hämophilie B leiden. Blut dieser Patienten gerinnt in den meisten Fällen noch, aber es kommt wegen der ungenügenden oder fehlenden Ausbildung des intrinsic Tenasekomplexes zu einer ungenügenden Thrombinbildung im geronnenen Blut und zur raschen Auflösung desselben, so dass keine ausreichende Hämostase zustande kommt.
Thrombin, meist bovinen Ursprungs, wird als nicht parenteral zu verabreichendes Arzneimittel zur Blutstillung oberflächlicher Verletzungen eingesetzt. Seine hämostyptische Wirkung konnte durch die gemeinsame Anwendung mit fibrinogenhältigen Arzneimitteln entscheidend verbessert werden (Grey; Young et al.). Fibrinogen und Thrombin werden entsprechend ihrer speziesspezifischen Anwendung nunmehr überwiegend aus allogenem Ausgangsmaterial gewonnen. Durch die kombinierte Anwendung von Thrombin mit fibrinogenhältigen Arzneimitteln wird versucht, die physiologische Blutgerinnung und die dabei auftretende Hämostase nachzuvollziehen, bzw. zu verbessern. Dies kann auch bei Patienten mit schweren Blutgerinnungsstörungen erreicht werden (Matras et al.).
Durch die gemeinsame Anwendung von Fibrinogenkonzentraten, deren Fibrinogengehalt das 10- bis 20fache des Blutes beträgt, und hohen Mengen Thrombins (100 - 1000 E pro mL) gelingt es, die Gerinnungszeit in einem solchen Fibrinogen-Thrombingemisch in den Sekundenbereich zu bringen und im Vergleich zur physiologischen Blutungszeit eine 10 bis 100fache Verkürzung zu erlangen. Dadurch wurde es möglich, bei optimaler Applikation solcher Fibrinogen-Thrombin- gemische praktisch eine sofortige Blutstillung zu erreichen, soweit keine großen Blutgefäße, insbesondere arterielle, verletzt wurden (Spängier).
Das durch Thrombin zu Fibrin umgewandelte Fibrinogen haftet ebenso wie geronnenes Blut am Wundbett an, wobei es offenbar durch die unter Thrombinwirkung aktivierten Transglutaminasen auch zu kovalenten Bindungen zwischen dem verletzten Gewebe und dem gebildeten Fibrin kommt. Diese starke Anhaftung des gebildeten Fibrins am Gewebe kann auch zum Kleben von nicht blutenden Geweben genützt werden, da das gebildete Fibrin in den meisten Fällen die Heilung des geklebten Gewebes nicht stört und innerhalb von Tagen bis Wochen weitgehend abgebaut wird (Matras et al.).
Im Gegensatz zur möglichst raschen Einleitung des Gerinnungsvorganges bei der Blutstillung mit Fibrinogen-Thrombingemischen ist bei der Klebung von Gewebeteilen und bei Abdichtungen ein verzögerter Beginn des Gerinnungsvorganges erwünscht. Dadurch können die zu klebenden Gewebsteile besser adaptiert werden, und ähnliche Adaptierungen sind auch bei Abdichtungen erforderlich. Bisher wurde die Verzögerung des Gerinnungsvorganges durch Verminderung der Thrombinkonzentration auf etwa 1% der Thrombinmenge, die zur Blutstillung verwendet wird, bewerkstelligt. Jedoch bringen sowohl die Anwendung hoher als auch niederer Thrombinkonzentrationen verschiedene Nachteile mit sich.
Hochviskose Fibrinogenlösungen mit einem Fibrinogengehalt zwischen 5 und 10% können mit Thrombinmengen zwischen 100 und 1.000 Einheiten innerhalb von Sekunden zur Gerinnung gebracht werden. Diese kurze Gerinnungszeit ist erforderlich, damit nach Aufbringung eines solchen Gemisches auf eine blutende Stelle die Gerinnung rasch einsetzt und die Blutung dadurch zum Stillstand gebracht wird. Der Nachteil einer solchen Vorgangsweise ist die schlechte Durchmischung der Fibrinogenlösung mit der Thrombinlösung, da die hohe Viskosität des Gemisches eine komplette Durchmischung in kurzer Zeit nicht erlaubt. Dies bewirkt eine inhomogene Gerinnung und damit eine Benachteiligung der biomechanischen Qualität.
Andererseits besteht bei der Anwendung von Fibrinogen-Thrombingemischen, die nicht der Blutstillung, sondern der Klebung von Gewebeteilen dienen, meistens die Notwendigkeit, das Auftreten der Gerinnung im Fibrinogen-Thrombingemisch zu verzögern, um die zu klebenden Gewebeteile oder Abdichtungen optimal adaptieren zu können, bevor die Gerinnung eintritt. Dies wird derzeit durch Reduktion der Thrombinmenge auf ein Zehntel bis auf ein Hundertstel der für die Hämostase verwendeten Quantität Thrombin versucht, allerdings mit dem Nachteil, dass nicht alles vorhandene Fibrinogen in Fibrin und Faktor XIII in Xllla übergeführt werden kann. Auch bei dieser Vorgangsweise kann keine optimale Ausbildung eines Fibringerinnsels erhalten werden, da die niedere Thrombinkonzentration nicht ausreicht, um TAFI in TAFIa überzuführen.
Eine weitere Problematik stellt die Verwendung von bovinem Material zur Herstellung von thrombinhältigen Arzneimitteln dar. Da die mögliche Übertragung von Prionen durch jegliche, von Rindern verwendete Organe nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden kann, ist heute die Anwendung von bovinem Thrombin stark zurück gegangen.
Bovines Thrombin hat den weiteren Nachteil, dass es für andere Spezies antigen wirkt und Allergien und Anaphylaxien verursachen kann. Des Weiteren wurden auch Blutgerinnungsstörungen bei mit bovinem Thrombin behandelten Patienten beobachtet, da Thrombin die Bildung von Antikörpern gegen Gerinnungsfaktoren verursachen kann, die mit menschlichen Gerinnungsfaktoren kreuzreagieren und so die Blutgerinnung verzögern können.
Bei der Herstellung von Thrombin aus Prothrombin wurde wegen der guten Ausbeute häufig zur Aktivierung des Thrombins Thromboplastin, das aus tierischem Ausgangsmaterial, meist Rinderhirn, hergestellt war, verwendet. Wegen der Möglichkeit der Übertragung von Prionen wird Thromboplastin aus tierischem Ausgangsmaterial weitgehend zur Thrombinherstellung ausgeschlossen und eine schlechtere Ausbeute von Thrombin in Kauf genommen. Die Erfindung stellt sich daher u.a. die Aufgabe, eine virussichere, thrombingenerierfähige, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung zur Verfügung zu stellen, die
1. zu einem thrombingenerierfähigen Arzneimittel formuliert und mit einem fibrinogenhältigen Arzneimittel vermischt, eine komplette und homogene Mischung dieser Komponenten ergibt, ohne dass eine komplette Vermischung durch zu schnelle Gerinnung verhindert wird. Es soll aber nicht nur die vollständige Durchmischung, sondern auch die Adaptierung der zu versiegelnden oder abzudichtenden Gewebsteile ermöglicht werden, bevor die Gerinnung einsetzt. Die Thrombinbildung muss sich auch nach der einsetzenden Gerinnung weiter fortsetzen, um alles im Gerinnsel vorhandene Fibrinogen, Faktor XIII und TAFI in Fibrin, Faktor Xllla und TAFIa überzuführen, um einen dauerhaften, durch Fibrin gebildeten Wundverschluss zu gewährleisten, und in der
2. das enthaltene Prothrombin möglichst vollständig in Thrombin übergeführt und dieses nach weiterer Reinigung zu einem thrombinhältigen Arzneimittel verarbeitet werden kann. Dieses Arzneimittel kann als solches oder gemeinsam mit anderen, fibrinogenhältigen Arzneimitteln verwendet werden.
Die aus den thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitungen hergestellten Arzneimittel sollen je nach Anwendung bei einer bestimmten Spezies nur allogenes Material dieser Spezies enthalten und ebenso sollen bei der Herstellung nur speziesspezifische Proteine verwendet werden. Alle verwendeten Ausgangsmaterialien und Hilfsmaterialien sollen die Übertragungsmöglichkeit von Prionen ausschließen. Die Thrombingenerierung aus Prothrombin in vivo und in vitro soll so vollständig wie möglich erfolgen, da nur das im Gerinnsel vorhandene Prothrombin zur Bildung von weiterem Thrombin in dem bereits geronnenen Fibrinogen zur Verfügung steht.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Wirkstoffzubereitung dient zur Herstellung eines thrombingenerierfähigen oder thrombinhältigen Arzneimittels und ist dadurch gekennzeichnet, dass sie enthält:
(A) aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenes Prothrombin (Gerinnungsfaktor II), (B) aus Plasma oder gentechnologisch gewonnene Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, die zumindest teilweise in aktiviertem Zustand vorliegen können, und aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor Xla, und
(C) prionensichere, gerinnungsaktive Phospholipide, welche gegebenenfalls in Liposomen enthalten sind.
Die erfindungsgemäße Wirkstoffzubereitung enthält bevorzugt aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor VII oder ein Gemisch von aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktoren VII und Vlla. Femer enthält sie bevorzugt einen gentechnologisch hergestellten Tissue Faktor als solchen oder in relipidierter Form.
Die erfindungsgemäße Wirkstoffzu bereitungkann auch aus zwei oder mehreren Plasmafraktionen und den gerinnungsaktiven Phospholipiden bestehen, wobei die einzelne Plasmafraktion einen oder mehrere Gerinnungsfaktoren bzw. aktivierte Gerinnungsfaktoren der Komponenten (A) und (B) enthält. Das gesamte '
Plasmafraktionengemisch muß jedoch alle, in den Komponenten (A) und (B) enthaltenen Gerinnungsfaktoren bzw. aktivierte Gerinnungsfaktoren enthalten, wobei vorzugsweise noch Tissue-Faktor zugesetzt wird.
Die Gerinnungsfaktoren sind insbesondere ausschließlich aus Blutplasma einer bestimmten Säugetierspezies oder aus den entsprechenden gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktoren oder aktivierten Gerinnungsfaktoren, einschließlich Tissue Faktor, hergestellt.
In der erfindungsgemäßen pharmazeutische Wirkstoffzubereitung sind vorteilhaft das Prothrombin, die Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, Xla und gegebenenfalls die Gerinnungsfaktoren VII und Vlla, sowie der Tissue Faktor durch Virusinaktivierung und/oder Virusabreicherung virussicher.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Wirkstoffzubereitung kann in tiefgefrorener oder gefriergetrockneter Form vorliegen.
Die Erfindung betrifft ferner ein thrombingenerierfähiges Arzneimittel, welches aus einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung herstellbar ist.
Das erfindungsgemäße thrombingenerierfähige Arzneimittel kann in tiefgefrorenem oder in gefriergetrocknetem Zustand vorliegen. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen thrombingenerierfähigen Arzneimittels ist dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Thrombin in einer solchen Menge enthält, dass es nach Auftauen oder Rekonstitution nicht mehr als 1 Einheit Thrombin pro ml enthält.
Die Erfindung betrifft ferner ein thrombinhältiges Arzneimittel, das aus einer erfindungsgemäßen thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung herstellbar ist. Es kann in tiefgefrorenem oder gefriergetrockneten Zustand vorliegen.
Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittelgemisch, das vor seiner Anwendung durch Vermischen eines erfindungsgemäßen Arzneimittels mit einem fibrinogenhältigen Arzneimittel innerhalb von 30 bis 300 Sekunden gerinnt.
Die Erfindung betrifft darüberhinaus auch ein thrombinhältiges Arzneimittel, das mit dem obigen Arzneimittelgemisch versetzt, innerhalb von 3 bis 10 Sekunden gerinnt.
Eine bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen thrombinhältigen pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße thrombingenerierfähige Wirkstoffzubereitung mit Ca-Ionen versetzt wird, wobei ein thrombinhältiges Produkt gebildet wird, welches anschließend chromatographisch gereinigt wird.
Eine vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Wirkstoffzubereitung durch Virusinaktivierung während oder nach der Thrombinbildung, sowie durch Virusabreicherung nach abgeschlossener Thrombinbildung virussicher gemacht wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Pro- Kofaktorenkonzentrates enthaltend die Gerinnungsfaktoren V und VIII, und ist dadurch gekennzeichnet, dass aus Plasma gewonnenes Kryopräzipitat gelöst und aus der Lösung Fibrinogen abgetrennt wird, wobei eine die Gerinnungsfaktoren V und VIII hältige Lösung erhalten wird, welche mit Calciumchlorid versetzt werden kann.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren betrifft die Herstellung eines Gerinnungsfaktor-XI-hältigen Prothrombinkomplexkonzentrates enthaltend die Gerinnungsfaktoren II, VII, Vlla, IX, X und XI, wobei pro 1 ,0 μg Prothrombin mindestens 0,030 μg Gerinnungsfaktor Xla enthalten sind, und ist dadurch gekennzeichnet, dass aus Plasma gewonnener Kryopräzipitatüberstand an einem Anionenaustauscher adsorbiert und nach Waschen des Adsorbats und Lagerung in der Kälte Gerinnungsfaktor-Xla-hältiger Prothrombinkomplex eluiert wird.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass eine praktisch komplette, zeitlich steuerbare Bildung von α-Thrombin aus virussicherem Prothrombin durch einen virussicheren intrinsic Tenase-Prothrombinasekomplex erfolgt. Der intrinsic Tenase- Prothrombinasekomplex wird durch Aktivierung der entsprechenden virussicheren, bzw. virussicher gemachten Gerinnungsfaktoren in Gegenwart optimaler Ca- lonenkonzentrationen mit prionensicheren, gerinnungsaktiven Phospholipiden und der virussicheren Aktivatorsubstanz Gerinnungsfaktor Xla und/oder die virussicheren Aktivatorsubstanzen Gerinnungsfaktor Vlla und Tissue-Faktor gebildet.
Die Aufgabenstellung wird somit erfindungsgemäß mit einer aus drei Komponenten (Komponenten A, B und C) bestehenden, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung zur Herstellung eines virussicheren, thrombingenerierfähigen oder thrombinhältigen Arzneimittels gelöst, wobei die pharmazeutische Wirkstoffzubereitung dadurch gekennzeichnet ist, dass
die Komponente A ein aus Plasma oder gentechnologisch hergestelltes, virussicheres Prothrombin als pharmazeutisch aktive Substanz,
die Komponente B virussichere, aus Plasma oder gentechnologisch gewonnene Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, Xla als pharmazeutisch aktive Substanzen und, falls zusätzlich zur Bildung der Prothrombinase- und intrinsic Tenasekomplexe auch die Bildung von extrinsic Tenasekomplex veranlasst werden soll, noch die virussicheren Gerinnungsfaktoren VII und/oder Vlla sowie Tissue Faktor als pharmazeutisch aktive Substanzen, und
die Komponente C vollsynthetisch hergestellte, gerinnungsaktive Phospholipide als pharmazeutisch aktive Substanzen mit einem über 15° C liegenden Umwandlungspunkt der parakristallinen in die flüssig kristalline Form enthält. Ein Gemisch der in den Komponenten (A) und (B) enthaltenen, pharmazeutisch aktiven Substanzen, d.h. die Gerinnungsfakoren bzw. aktivierten Gerinnungsfaktoren, kann auch durch Mischen zweier oder mehrerer Plasmafraktionen erhalten werden, in denen alle erforderlichen, pharmazeutisch aktiven Substanzen enthalten sind und denen Tissue-Faktor erforderlichenfalls zugesetzt werden kann.
Nach Mischung der drei Komponenten und Zugabe einer optimalen CaCI2-Menge wird temperaturabhängig zwischen 0 ° und 40 ° C Thrombin gebildet, wobei die Geschwindigkeit der Thrombinbildung mit steigender Temperatur zunimmt.
Die Herstellung der Komponente A erfolgt durch Auflösen von gefriergetrocknetem, virussicherem Prothrombin oder Auftauen einer eingefrorenen Lösung von virussicherem Prothrombin und der Zubereitung einer Prothrombinstammlösung mit 10 - 100 Einheiten Prothrombin pro mL und einem Gehalt von 0,1% Natriumzitrat bei pH 7,3.
Die Wertbemessung der Stammlösung erfolgt durch Bestimmung der Prothrombineinheiten mit Hilfe eines Gerinnungsfaktor-Il-Mangelplasmas, mit dem eine Eichkurve unter Verwendung eines Referenz-Normalplasmas erstellt wurde.
Mit Hilfe von Ecarin wird die maximale Menge Meizothrombin/Thrombin bestimmt, die von einer Einheit Prothrombin generierbar ist. Die Meizothrombin/ Thrombinbestimmung erfolgt mit dem chromogenen Substrat S-2238. Weiters wird die Menge Thrombin in NIH-Einheiten bestimmt, die aus einer Einheit Prothrombin nach Thromboplastinzusatz generiert wird. Eine entsprechende Standardkurve zur Thrombinbestimmung wird mit Hilfe des internationalen α-Thrombinstandards errichtet.
Die Komponente B wird durch Vermischen von Stammlösungen virussicherer Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, Xla, sowie der Gerinnungsfaktoren VII, Vlla und Tissue Faktor hergestellt. Die Konzentrationen der einzelnen Gerinnungsfaktoren in ihren Stammlösungen liegen zwischen 10 - 100 Einheiten pro mL; die Tissue-Faktor- Stammlösung enthält 25 μg/mL. Anstelle einer Stammlösung von Gerinnungsfaktor V kann auch eine Stammlösung von Gerinnungsfaktor Va verwendet werden. Der Gehalt eines einzelnen Gerinnungsfaktors in einer Stammlösung wird mit Hilfe der entsprechenden Mangelplasmen bestimmt und zur Bestimmung jedes einzelnen Gerinnungsfaktors eine Standardkurve mit gepooltem Normalplasma errichtet.
Um festzustellen, welche Mengen der einzelnen Gerinnungsfaktoren erforderlich sind, um noch eine optimale Thrombingenerierung zu erhalten, werden Mischungen der Komponenten A und B hergestellt, die je eine Einheit der Gerinnungsfaktoren II, V, VIII, IX, X, Xla und II, sowie Xla, VII, Vlla mit 2,5 μg Tissue Faktor pro mL des Ansatzes enthalten. Nach Zusatz der Liposomenemulsion und nachfolgender Rekalzifizierung wird die Thrombinbildung bei 26° C in entsprechenden Zeitintervallen bestimmt. Ebenso wird in diesen Ansätzen der Prothrombinverbrauch und die Bildung von ß- und γ-Thrombin festgestellt. Die Überführung von Prothrombin in Thrombin wird in Anwesenheit von 0,1% PEG vorgenommen und jene Mengen Gerinnungsfaktoren und Tissue Faktor pro mL bestimmt, die erforderlich sind, um noch eine optimale Thrombingenerierung zu erreichen.
Gemische von Komponenten A und B können auch aus zwei oder mehreren Plasmafraktionen erhalten werden, soweit sie alle Gerinnungsfaktoren und aktivierten Gerinnungsfaktoren, die zur Bildung der intrinsic Tenase- und Prothrombinasekomplexe erforderlich sind, als pharmazeutisch aktive Substanzen enthalten. Die Aktivierung des intrinsic Tenase-Pathways erfolgt entweder durch den Gerinnungsfaktor Xla oder über den extrinsic Tenase-Pathway, insbesondere wenn kein TFPI vorhanden ist. Es ist auch möglich, den intrinsic Tenase-Pathway gleichzeitig durch den Gerinnungsfaktor Xla und über den extrinsic Tenase-Pathway zu aktivieren. In einem Gemisch von Gerinnungsfaktoren, die zur Bildung des intrinsic Tenasekomplexes erforderlich sind, kann sowohl durch Zusatz, bzw. Vorhandensein des Gerinnungsfaktors Xla bestimmt werden, ob mindestens 90% des vorhandenen Prothrombins in Thrombin übergeführt werden, und wenn dies nicht der Fall ist, welche Mengen Faktor Vlla und Tissue Faktor erforderlich sind, um eine solche praktisch vollständige Umsetzung von Prothrombin in Thrombin zu erreichen. Zur Thrombingenerierung wird ein Überschuss von gerinnungsaktiven Phospholipiden verwendet. Die Aktivierung wird entweder bei 26° C oder 37° C und einer optimalen Ca-Ionenkonzentration durchgeführt. Die Virussicherheit der verwendeten Gerinnungsfaktoren, bzw. der gerinnungsfaktorhältigen Plasmafraktionen, wie auch des gentechnologisch gewonnenen Tissue Faktors wird durch Virusinaktivierung, z.B. nach dem Solvent/Detergent-Verfahren, und nachfolgende Virusabreicherung mittels Nanofiltration erreicht.
Die Komponente C wird aus Mischungen von vollsynthetischen, und dadurch prionensicheren, Cholin- oder Serinphospholipiden oder aus Cholin-Serin- Äthanolaminphospholipiden hergestellt. Es werden nur Phospholipide verwendet, deren Phasenübergangstemperatur vom parakristallinen Gelzustand in den flüssigkristallinen Zustand zwischen 15° und 40° C liegt. Aus den Phospholipidgemischen können Emulsionen hergestellt werden, die Liposome mit einem Durchmesser von 20 nm bis 1.000 nm aufweisen und die polaren Anteile der Phospholipide in einer äußeren Membran ausgebildet haben. Mit Hilfe von Temperaturen zwischen 50° C und 100° C können Liposome mit einem Durchmesser von 20 nm - 200 nm hergestellt werden. Solche Emulsionen können mit Hilfe bakteriendichter Filter sterilisiert, steril abgefüllt, getrocknet und unter Stickstoff aufbewahrt und gelagert werden. Durch Zusatz von Wasser können die gefriergetrockneten Emulsionen rekonstituiert werden.
Die Virussicherheit der verwendeten Gerinnungsfaktoren und des nicht relipidierten Tissue Faktors wird durch Virusinaktivierung, vorzugsweise mit dem Solvent/ Detergent-Verfahren und nachfolgender, weitgehender Entfernung des Solvent/Detergent erreicht. Quantitierbare Spuren des verwendeten Solvente, Trinitrobutylphosphat, und des Detergents, Tween 80 verbleiben in der thrombinhältigen Lösung. Die Virusabreicherung erfolgt vorzugsweise durch Nanofiltration nach vorheriger Klärfiltration, die stufenweise mit immer enger porigen Filtern erreicht wird, beginnend mit einer Porenweite von 5.000 nm, absteigend bis 35 nm. Vorzugsweise kann nach der Filtration durch einen 35 nm Nanofilter noch durch Nanofilter mit Porenweiten von 20 nm und 15 nm filtriert werden.
Die Thrombingenerierung dieser pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung ist stark temperaturabhängig. Daher ist es möglich, durch Vermischen der Komponenten A, B, und C, selbst bei optimaler Ca-Ionenkonzentration, die Thrombinbildung aus Prothrombin hintanzuhalten, sofern bei niederen Temperaturen um den Gefrierpunkt gearbeitet wird. Zur Lagerung kann die erfindungsgemäße Wirkstoffzubereitung tiefgefroren werden. Sie kann aber auch gefriergetrocknet und bei Temperaturen zwischen 0° C und 25° C gelagert werden.
Die thrombingenerierfähige, pharmazeutische Wirkstoffzubereitung kann bei niederen Temperaturen zu einem Arzneimittel mit einer Thrombin- generierungskapazität von vorzugsweise 100 bis 1.000 Einheiten Thrombin pro mL formuliert, steril filtriert und portioniert abgefüllt werden.
Die thrombingenerierfähige, pharmazeutische Wirkstoffzubereitung wird auch zur Herstellung von thrombinhältigen Arzneimitteln verwendet. Die Thrombingenerierung wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 20° C bis 40° C durchgeführt.
Für die Herstellung von Thrombin aus einer thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung, bei der noch keiner oder nicht alle Komponenten einer Virusinaktivierung unterzogen waren, kann die Virusinaktivierung während oder nach der Thrombingenerierung durchgeführt werden. Die Entfernung der virusinaktivierenden Substanzen kann gemeinsam mit einer anschließenden Reinigung des generierten Thrombins erfolgen. Es ist möglich, eine thrombinhältige, pharmazeutische Wirkstoffzubereitung mit einem Thrombingehalt von 1.000 bis 10.000 Einheiten pro mL zu erhalten, die durch Klärfiltrationen und nachfolgende Nanofiltration virusabgereichert werden kann. Die virussichere Wirkstoffzubereitung kann dann formuliert und sterilfiltriert zu einem Arzneimittel verarbeitet werden.
Die Verwendung von thrombingenerierfähigen und/oder thrombinhältigen Arzneimitteln gemeinsam mit fibrinogenhältigen Arzneimitteln kann zur Hämostase, zur Gewebeklebung in Kombination mit Nähten oder zur Abdichtung von Hohlräumen und Gefäßen gegen Austritt von Gasen und Flüssigkeiten verwendet werden.
Durch Vermischen eines thrombingenerierfähigen Arzneimittels mit einem fibrinogenhältigen Arzneimittel und eventuellen Zusatz geringer Mengen Thrombin kann die Gerinnungszeit eines solchen Gemisches auf 30 bis 300 Sekunden eingestellt werden. Dadurch ist eine komplette Vermischung der Arzneimittel selbst bei hoher Viskosität einer solchen Mischung möglich. Ebenso steht nach vollständiger Durchmischung der Arzneimittel ein genügend langer Zeitraum für die erforderliche Adaptierung der Gewebeteile, die geklebt oder abgedichtet werden sollen, zur Verfügung. Nach Eintreten der Gerinnung kommt es dann - ähnlich wie bei dem physiologischen Gerinnungsvorgang - zu einer weiteren Bildung von Thrombin im bereits teilweise geronnenen Fibrinogen, so dass nach einiger Zeit - bis zu mehreren Stunden - praktisch alles Prothrombin in Thrombin umgewandelt ist und dieses das gesamte Fibrinogen in Fibrin überführt. Eine solche fortgesetzte Thrombinbildung ermöglicht nicht nur die homogene Ausbildung von Fibrin im bereits geronnenen Fibrinogen, sondern auch die gleichförmige Aktivierung von Faktor XIII und die dadurch einsetzende Quervernetzung des gebildeten Fibrins, ebenso wie die Aktivierung von TAFI und die dadurch erfolgende Abspaltung der endständigen Lysinreste des Fibrins.
Die Anwendung fibrinogenhältiger Gemische zur Hämostase erfordert eine sehr kurze Gerinnungszeit. Um diese zu erreichen und trotzdem eine homogene Ausbildung des geronnenen Fibrinogens und die Aktivierung von Zymogenen, wie Faktor XIII und/oder TAFI, zu gewährleisten, können fibrinogenhältige Arzneimittel komplett mit thrombingenerierfähigen Arzneimitteln vermischt werden und solche Gemische dann zusammen mit einer Thrombinlösung, die einen hohen Gehalt an Thrombin aufweist, auf die blutende Stelle aufgebracht werden. Obwohl die einsetzende Gerinnung zunächst nicht zu einem homogenen Fibrinklot führt, setzt die nachfolgende Thrombingenerierung des im Fibrinklot enthaltenen thrombingenerierfähigen Arzneimittels die Überführung von Prothrombin in Thrombin fort, so dass es schließlich zu einem homogen geronnenen Fibrinklot mit homogen verteiltem Faktor Xllla und homogen verteiltem TAFIa kommt. Dadurch ist es möglich, auch bei schnell gerinnenden Mischungen von thrombinhältigen mit fibrinogenhältigen Arzneimitteln eine ausgezeichnete Fibrinstruktur und eine besondere Resistenz gegenüber fibrinolytischen Einflüssen zu erzielen.
Eine weitere Möglichkeit, in einem thrombingenerierfähigen Gerinnungsfaktorengemisch, bestehend aus Prothrombinkomplex und Faktor VIII, eine spontane Thrombinbildung auszulösen, ist die Zugabe von Faktoren des Kontaktsystems. Hierzu müssen die Gerinnungsfaktoren XI und XII, soweit sie nicht bereits in dem Gemisch vorhanden sind, zugesetzt werden.
Die Aktivierung des Gerinnungsfaktors XI in vivo ist noch nicht in allen Einzelheiten vollständig geklärt. Fest steht, dass Blutzellen und Zellen des Endothels bei diesem Aktivierungsvorgang eine wesentliche Rolle spielen. Faktor XI ist im Blut in nicht kovalenter Form an hochmolekulares Kininogen (Kd10"8) und Prothrombin (Kd10"7) gebunden. Diese Komplexe können sich an aktivierte Plättchen anlagern, wobei es in Anwesenheit von Thrombin und/oder Gerinnungsfaktor Xlla zu einer Aktivierung des Gerinnungsfaktors XI kommt.
In vitro kann die Aktivierung des Gerinnungsfaktors XI durch Gerinnungsfaktor Xlla an negativ geladenen Oberflächen erfolgen, indem Gerinnungsfaktor Xlla durch Kallikrein aus Gerinnungsfaktor XII gebildet wird. Die Bildung von Kallikrein aus dem im Blut vorhandenen Präkallikrein kann durch unterschiedliche Mechanismen erfolgen, wie z.B. durch Präkallikreinaktivator oder Metallsalze der Ellagsäure.
Erfindungsgemäß kann in einem thrombinbildungsfähigen Gerinnungsfaktorengemisch, bestehend aus Prothrombinkomplex und Gerinnungsfaktor VIII, eine spontane Thrombingenerierung durch Aktivierung des darin enthaltenen Gerinnungsfaktors XI ausgelöst werden, wobei alle Komponenten dieses Gemisches vorher virusinaktiviert wurden. Vorzugsweise wird diese Aktivierung in Anwesenheit von prionensicheren, gerinnungsaktiven Phospholipiden mit virussicherem Kallikrein durchgeführt. Anstelle von Kallikrein kann auch virusinaktiviertes Präkallikrein mit virusinaktiviertem Präkallikreinaktivator oder -aktivatoren, wie z.B. Metallsalzen der Ellagsäure, verwendet werden.
Für die Herstellung thrombinhältiger, pharmazeutischer Wirkstoffe kann die Virusinaktivierung auch während oder nach der Thrombingenerierung erfolgen.
Mit den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben.
Beispiele 1. Herstellung der Komponente A.
100 mg virussicheres Prothrombin wird in 1 L 0,1%iger Natriumzitratlösung bei pH 7,5 gelöst und der Gehalt an Prothrombin pro mL mit Hilfe eines Prothrombinmangelplasmas bestimmt. Ebenso wird nach Ecarinzusatz die gebildete Menge Meizothrombin und Thrombin durch Umsetzung von chromogenem Substrat S-2238 bestimmt. Weiters wird dieThrombinbildung mit Hilfe einer Prothrombinasepräparation durchgeführt. Das gebildete Thrombin wird mit Hilfe einer Fibrinogenlösung als Thrombinzeit bestimmt. Mit dieser Fibrinogenlösung wurde vorher eine Standardkurve mit Hilfe des internationalen Standards für α-Thrombin errichtet. Diese Prothrombinstammlösung kann eingefroren bei -20° C minidestens sechs Monate gelagert werden.
2. Herstellung der Komponente B aus einzelnen Gerinnungsfaktoren.
Virussichere, hochgereinigte Gerinnungsfaktorenkonzentrate, die aus Plasma oder gentechnologisch gewonnen wurden, werden in 0,1%igem Natriumzitrat pH 7,5 gelöst und unter Rühren vermischt: 3,2 mg Faktor V, 0,2 mg Faktor VIII, 5,0 mg Faktor IX, 11 mg Faktor X und 0,5 mg Faktor Xla. Nach Probenziehung wird die Lösung eingefroren und bei -20° C oder darunter liegenden Temperaturen gelagert. An einer äquivalenten Probe wird die Menge einer 1 M CaCI2-Lösung bestimmt, die erforderlich ist, um die Ca-Ionenaktivität äquivalent zu einer 5 mM - 8 mM CaCI2-Lösung zu bringen.
3. Herstellung eines Gemisches der Komponenten A und B.
Die eingefrorenen Lösungen der Komponente A, hergestellt nach Beispiel 1 , und der Komponente B, hergestellt nach Beispiel 2, werden vorsichtig aufgetaut, wobei die Temperatur nicht über 4° C ansteigen soll. Aus den erhaltenen Lösungen wird eine Mischung aus gleichen Teilen der Komponente A und der Komponete B hergestellt, die erforderlichen Proben werden gezogen, und das Gemisch der Komponenten wird wieder eingefroren und bei -20° C gelagert. Herstellung eines Gemisches aus Plasmafraktionen, das die Gerinnungsfaktoren der Komponenten A und B enthält.
Aus 10 L tiefgefrorenem Source Plasma wird nach vorsichtigem Auftauen, wobei eine Temperatur von 4° C nicht überschritten wird, durch Zentrifugation bei 6.000 g über 15 Minuten das Kryopräzipitat vom Kryopräzipitatüberstand abgetrennt.
a. Gerinnungsfaktor-Xla-hältiges Prothrombinkomplexkonzentrat:
Der Kryopräzipitatüberstand wird mit 16 g schwachem Anionenaustauscher DEAE-Sephadex A-50 versetzt, der pH Wert zwischen 7,8 und 8,8 mit 0,1 normaler Na-Lauge eingestellt und eine Stunde bei einer Temperatur zwischen 3° C bis 6° C gerührt. Das Gemisch kann längstens 24 Stunden bei dieser Temperatur gehalten werden, bevor der Ionenaustauscher durch Filtration und/oder Zentrifugation abgetrennt wird. Die vom Ionenaustauscher befreite Flüssigkeit wird zur Gewinnung weiterer Plasmafraktionen aufbewahrt und der abgetrennte Ionenaustauscher zur Gewinnung des Prothrombinkomplexes weiterverarbeitet. Die Lagerung des so abgetrennten Ionenaustauschers kann bis zu 100 Stunden bei einer Temperatur zwischen 4° und 6° C erfolgen. Zur Weiterverarbeitung wird der abgetrennte Ionenaustauscher zwei Mal mit je 1 L 0,5%iger Kochsalzlösung gewaschen und der Gerinnungsfaktor-Xla-hältige Prothrombinkomplex durch Elution des Ionenaustauschers mit 1.000 mL einer 0,3 M NaCI-Lösung bei pH 7,5 gewonnen. Der Ionenaustauscher wird nach der Elution nochmals mit 500 mL 0,3 M Kochsalzlösung bei pH 7,5 gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Eluat vereinigt. In diesem Gesamteluat wird mit Hilfe von Ecarin die vorhandene Menge Prothrombin bestimmt und das Gesamteluat durch Verdünnung auf den gewünschten Prothrombingehalt, der zwischen 2 und 5 Prothrombineinheiten pro mL liegen kann, gebracht. Das Gesamteluat als Gerinnungsfaktor-Xla-hältiges Prothrombinkomplexkonzentrat kann nach dem Einfrieren in gefrorenem Zustand bei -20° C gelagert werden. Mit Hilfe von Proben, die vor dem Einfrieren entnommen wurden, wird der Gehalt an Gerinnungsfaktoren und aktivierten Gerinnungsfaktoren bestimmt. b. Herstellung eines Pro-Kofaktorenkonzentrates:
Das aus Plasma durch Zentrifugation sedimentierte Kryopräzipitat wird in 750 mL 0,3%igem Zitratpuffer pH 7,0 gelöst und mit 110 g Glyzin versetzt. Nach einstündigem Rühren bei einer Temperatur zwischen 0° C und 2° C wird das ausgefällte Fibrinogen durch Zentrifugation bei 3.000 g mit einer Dauer von 15 Minuten abgetrennt und der Überstand, der die Gerinnungsfaktoren V und VIII enthält, eingefroren. In einer mit Wasser 1 :10 verdünnten Probe des Überstandes wird der Gehalt an Faktor VIII bestimmt, ebenso die Menge CaCI2, die zur Rekalzifizierung erforderlich ist, um eine lonenaktivität äquivalent zu einer 5mM CaCL2-Lösung zu erhalten. Die eingefrorene Lösung kann bei -20° C gelagert werden.
c. Herstellung eines Gemisches aus Gerinnungsfaktor-Xla-hältigem Prothrombinkonzentrat und Pro-Kofaktorenkonzentrat:
Eine mit destilliertem Wasser 1 :10 verdünnte, rekalzifizierte Probe des nach Beispiel 4 b. hergestellten Pro-Kofaktorenkonzentrates wird in Mengen von 0,1 ; 0,2; 0,4 und 0,8 mL zu je 1 mL dem nach Beispiel 4 a. hergestellten Prothrombinkonzentrat zugesetzt. Diesen Gemischen wird je 0,1 mL einer nach Beispiel 5 hergestellten Liposomenemulsion zugefügt. Nach Inkubation von 8 Stunden bei 26° C wird jene Menge des Pro-Kofaktorenkonzentrats bestimmt, die erforderlich ist, um 90% oder mehr des vorhandenen Prothrombins in Thrombin überzuführen.
Zur Herstellung des Gemisches aus Gerinnungsfaktor-Xla-hältigem Prothrombinkomplexkonzentrat und Pro-Kofaktorenkonzentrat, die aus 10 L tiefgefrorenem Plasma gewonnen und eingefroren gelagert sind, werden diese Konzentrate nach dem Auftauen entsprechend in dem im Vorversuch gefundenen, optimalen Verhältnis vermischt. Diese Mischung wird eingefroren und bei -20° C gelagert.
5. Herstellung der Komponente C ohne Emulgator. Es werden vollsynthetische und daher virus- und prionensichere Phospholipide verwendet. 200 mg 2Na-1 ,2-Di-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin, 400 mg 1 ,2,Di-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und 400 mg Di-Oleoyl-Äthanolamin- Phospholipid werden in 10 mL Chloroform gelöst und die Lösung in einem 250 mL Rundkolben durch Erwärmung und laufendes Drehen des Kolbens zur Trockerne eingedampft. Mit Hilfe eines Stickstoffstroms werden die Reste von Chloroform vollständig entfernt und 10 mL einer 0,1%igen Zitratpufferlösung pH 7,3 zugefügt. Der sich an der Innenwand des Rundkolbens befindliche Phospholipidfilm wird komplett in der Pufferlösung bei 65° C emulgiert und bei der Emulgierung so lange wiederholt mit einer Vortex-Vorrichtung geschüttelt, bis der ganze Lipidfilm von der inneren Oberfläche des Kolbens verschwunden ist. Die Emulsion wird als solche oder 1 :10 mit 0,1%igem Zitratpuffer pH 7,0 verdünnt, durch ein Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm filtriert und nachfolgend durch ein Filter mit einer Porenweite von 0,22 μm sterilfiltriert. Diese Liposomenemulsion kann steril im Kühlschrank gelagert werden und wird vor Gebrauch mit einer Vortex-Vorrichtung 1 Minute geschüttelt. Die Emulsion wird entsprechend der europäischen Pharmakopöe auf Sterilität und Pyrogenfreiheit geprüft (Eur. Pharm. 4th Edition 2002 Seiten 123-126, 2.6.1. Sterility. Seiten 131 - 132, 2.6.8. Pyrogens).
6. Herstellung der Komponente C mit Natriumcholat.
250 mg 2Na-1 ,2-Di-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin, 750 mg 1 ,2, Di- Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und 500 mg Natrium-Cholat werden in 10 mL einer 1 + 1 Mischung von Chloroform und Methylalkohol gelöst und beide Lösungsmittel in Vakuum abgedampft, in einer Weise, dass ein dünner, gleichmäßiger Film an der Innenwand eines Rundkolbens entsteht. Der Film wird mit 10 mL 0,1%igem Zitratpuffer pH 7,3 von der Gefäßwand abgeschwemmt und die so erhaltene Emulsion wie in Beispiel 1 weiterbehandelt und sterilfiltriert.
7. Virussichere Aktivatorsubstanzen zur Aktivierung des intrinsic Tenase-Pathways.
Als Aktivatorsubstanz wird entweder Gerinnungsfaktor Xla allein, bzw. gemeinsam mit Gerinnungsfaktor XI verwendet oder Gerinnungsfaktor Vlla, vorzugsweise mit Tissue Faktor. Gerinnungsfaktor Xla kann auch gemeinsam mit Gerinnungsfaktor Vlla und Tissue Faktor angewandt werden. Zur Verwendung der aktivierten Gerinnungsfaktoren bzw. des Tissue Faktors als pharmazeutisch aktive Substanzen werden sie durch ein Solvent Detergent-Verfahren virusinaktiviert und nach Entfernung des Solvent/Detergents einer Virusabreicherung durch Nanofiltration unterzogen.
Nachstehende, pharmazeutisch aktive Substanzen, gelöst in einem 0,3%igen Zitratpuffer pH 7,3, werden als Stammlösungen der Aktivatorsubstanzen verwendet:
a. 30 μg Faktor Xla /mL; b. 30 μg Faktor Xla und 50 ng Faktor XI/mL; c. 30 μg Faktor Xla und 20 ng Faktor VI la/mL; d. 30 μg Faktor Xla und 20 ng Faktor Vlla und 10 ng Tissue Faktor/mL; e. 10 μg /mL Tissue Faktor
Zur Auswahl der bestgeeigneten Aktivatorsubstanz werden je 10 μL einer Verdünnungsreihe der einzelnen Aktivatorsubstanzen zu je 1 mL Gerinnungsfaktorengemisch, das nach Beispiel 3 oder 4 erhalten wird, hinzugefügt und mit 10 μL einer 1 :100 verdünnten Liposomenemulsion nach Beispiel 5 vermischt. Nach erfolgter Rekalzifizierung werden die Gemische bei 26° C bzw. 37° C gehalten. In Intervallen von 10, 30, 60 und 120 min wird mit Hilfe des chromogenen Substrats S-2251 die gebildete Menge Faktor Xa bestimmt. Es wird jene Aktivatorsubstanz zur Herstellung einer thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung verwendet, die mit den nach Beispiel 3 oder 4 hergestellten Gerinnungsfaktorengemischen nach Rekalzifizierung die größte Menge Faktor Xa bildet.
8. Bestimmung der erforderlichen Mengen von Komponente C, die in einem Gemisch der Komponenten A und B innerhalb von 8 Stunden bei 26° C bzw. 2 Stunden bei 37° C mindestens 90% des vorhandenen Prothrombins in Thrombin umsetzen. Gerinnungsfaktorengemische nach Beispiel 3 oder 4, die erforderlichenfalls noch mit nach Beispiel 7 ermittelten Mengen von Aktivatorsubstanz versetzt sind, werden mit steigenden Mengen Liposomenemulsion vermischt. Zu je 10 mL eines Gerinnungsfaktorengemisches werden 0,1 , 0,2, 0,4 und 0,8 mL einer 1 :100 verdünnten, nach Beispiel 5 hergestellten Liposomenemulsion zugesetzt und nach Rekalzifizierung bei 26° C über 8 Stunden oder bei 37° C über 2 Stunden inkubiert. Es wird die geringste Menge Liposomenemulsion bestimmt, die erforderlich ist, um mindestens 90% des vorhandenen Prothrombins in Thrombin umzuwandeln.
9. Herstellung einer thrombingenerierfähigen, virussicheren pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung.
Ein nach Beispiel 3 hergestelltes, virussicheres Gerinnungsfaktorengemisch (Komponenten A und B) wird nach dem Auftauen, falls erforderlich, mit einer nach Beispiel 7 ausgewählten, virussicheren Aktivatorsubstanz in der entsprechenden Menge versetzt und das Gemisch bei 0° bis 2° C 15 Minuten lang gerührt. Zu diesem Gemisch wird die nach Beispiel 5 ermittelte Menge Liposomenemulsion (Komponente C) zugesetzt. Dieses Gemisch wird mit festem Kochsalz auf eine Konzentration von 0,9% NaCI gebracht, falls erforderlich, einer Klärfiltration unterzogen und dann durch ein Filter mit einer Porenweite von 0,22 μm und/oder 0,1 μm sterilfiltriert. Die gesamten Manipulationen, inklusive der Sterilfiltration, finden bei einer Temperatur zwischen 0° C und 2° C statt. Die so gewonnene, thrombingenerierfähige Wirkstoffzubereitung wird nach Probenziehung eingefroren und bei -20° C gelagert. Die erforderlichen Untersuchungen auf Stabilität und Pyrogenfreiheit werden nach der europäischen Pharmakopöe durchgeführt. In in-process Kontrollen und im sterilen Filtrat wird die thrombingenerierfähige Kapazität nach Rekalzifizierung bei 37° C über 2 Stunden bestimmt und ebenso noch vorhandenes, durch Ecarin aktivierbares Prothrombin, um die mindestens 90%ige Umwandlung des vorhandenen Prothrombins in Thrombin zu gewährleisten.
10. Herstellung einer thrombinhältigen, virussicheren, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung. Das nach Beispiel 4 aus einem Faktor-Xla-hältigen Prothrombinkomplexkonzentrat und einem Pro-Kofaktorenkonzentrat hergestellte, eingefrorene Gemisch wird aufgetaut und, wenn nach Beispiel 7 noch erforderlich, mit einer ausgewählten, berechneten Menge Aktivatorsubstanz versetzt. Durch Zugabe von 10 mg Tween 80 und 0,3 mg Trinitrobutylphosphat pro g Protein des Gerinnungsfaktorengemisches bei 26° C nach erfolgter Rekalzifizierung und Zusatz einer nach Beispiel 6 ermittelten Menge Liposomenemulsion wird in acht Stunden die Hauptmenge des Prothrombins in Thrombin übergeführt und gleichzeitig die erforderliche Virusinaktivierung durchgeführt.
Die thrombinhältige Lösung kann entweder eingefroren und gelagert oder sofort bzw. nach Wiederauftauen weiterverarbeitet werden. Durch Zusatz einer entsprechenden Natriumzitratlösung wird eine 25 mMolarität und ein pH-Wert von 6,5 eingestellt und unter weiterem Rühren bei Zimmertemperatur soviel Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 6.000 und 8.000 zugesetzt, bis eine 0,1%ige Lösung entsteht. Nunmehr wird eine mit 0,025 M Natriumzitrat pH 6,5, gewaschene, 20%ige CM-Sepharose-Suspension unter Rühren zugesetzt, bis mindestens 95% des vorhandenen Thrombins an die CM-Sepharose adsorbiert sind. Die erforderliche Menge CM-Sepharose wird in einem Von/ersuch bestimmt, indem die geringste Menge der 20%igen Emulsion ermittelt wird, die mindestens 95% des vorhandenen Thrombins adsorbiert. Die CM-Sepharose wird während 30 Minuten zwischen 3.000 bis 5.000 g abzentrifugiert, das Sediment in 25 mM Zitratpuffer pH 6,5 resuspendiert und in eine entsprechende Kolonne eingefüllt. Die Kolonne wird mit 1%igem Zitratpuffer, der noch 0,1% PEG enthält, bei pH 6,5 gewaschen und mit einem Kochsalzgradienten in Anwesenheit von 0,1% Zitrat und 0,1% PEG bei pH 6,5 eluiert. Der Kochsalzgradient wird zwischen 10 und 200 mM errichtet. Die Fraktionen, die das meiste Thrombin enthalten, werden gesammelt, diafiltriert und dadurch auf eine Konzentration von etwa 500 E Thrombin pro mL gebracht. Eine solche Lösung kann eingefroren, nach Gefriertrocknung gelagert oder sofort weiterverarbeitet werden. Nach vorheriger Klärfiltration durch Filter verschiedener Porengröße zwischen 5.000 und 75 nm wird die thrombinhältige Lösung durch einen Nanofilter mit 35 nm Porengröße und vorzugsweise durch weitere Nanofilter mit Porendurchmessern von 20 und 15 nm filtriert. Die so erhaltene virusabgereicherte Thrombinlösung wird durch Ultrafiltration mit Hilfe eines 30 KD Filters auf einen Gehalt von über 5.000 E Thrombin pro mL konzentriert und eingefroren oder gefriergetrocknet gelagert.
11. Herstellung eines thrombingenerierfähigen virussicheren Arzneimittels.
Eine äquivalente Probe des nach Beispiel 9 hergestellten, eingefrorenen oder gefriergetrockneten, virussicheren, pharmazeutischen Wirkstoffes wird mit einer 0,9%'ιgen NaCI-Lösung so verdünnt, dass die Probe nach Rekalzifizierung bei 37° C innerhalb von 2 Stunden 500 + 50 Einheiten Thrombin pro mL generiert.
Eine solche verdünnte Probe wird mit gleichen Teilen eines 5 - 10%igen, fibrinogenhältigen Arzneimittels, das als Bestandteil eines Fibrinkleberkits vorgesehen ist, vermischt und die Gerinnungszeit dieser Mischung nach Rekalzifizierung bestimmt. Wenn die Gerinnungszeit bei 37° C länger als 150 Sekunden ist, wird der Wirkstoffzubereitung nach Beispiel 7 noch soviel nach Beispiel 8 hergestelltes Thrombin zugesetzt, bis die Gerinnungszeit auf zwischen 100 und 150 Sekunden gesunken ist.
Die so ermittelten Mengen Thrombin werden dem nach Beispiel 9 erhaltenen Wirkstoff unter Rühren bei einer Temperatur von zwischen 0° C und 2° C zugesetzt und diese Mischung nach Klärfiltration sterilfiltriert. Die erhaltene, sterile Bulklösung wird vorzugsweise bei derselben niederen Temperatur in Endverbraucherfläschchen portioniert, verfüllt und gefriergetrocknet. Die Auflösung des gefriergetrockneten Pulvers erfolgt mit einer sterilen 5 mM CaCI2- Lösung.
12. Herstellung eines thrombinhältigen, virussicheren Arzneimittels. Eine Wirkstoffzubereitung nach Beispiel 10 wird nach Auftauen oder Auflösen mit Kochsalz auf eine Konzentration von 0,9% NaCI gebracht und dann durch Zugabe einer isotonen Kochsalzlösung die gewünschte Thrombinkonzentration auf zwischen 500 und 5.000 Einheiten pro mL eingestellt. Es wird soviel PEG zugesetzt, dass eine 0,1%ige Lösung entsteht und mit Hilfe einer 10%igen CaCI2- Lösung eine 5 mM CaCI2-Lösung erhalten wird. Diese Lösung wird sterilfiltriert, portioniert in Endverbrauchergefäße steril abgefüllt und kann eingefroren oder nach Gefriertrocknung gelagert werden. Die Rekonstitution der gefriergetrockneten Thrombinlösung erfolgt mit WFI.
13. Anwendung eines thrombingenerierfähigen Arzneimittels gemeinsam mit- einem thrombinhältigen Arzneimittel.
1 mL eines fibrinogenhältigen Arzneimittels, das 50 - 100 mg Fibrinogen pro mL enthält, wird mit 1 mL eines thrombingenerierfähigen Arzneimittels nach Beispiel 11 vermischt. Die Mischung dieser beiden Arzneimittel wird unter sterilen Bedingungen etwa 20 Sekunden lang stark gerührt und die so erhaltene homogene Mischung auf die zu klebende bzw. abzudichtende Stelle aufgebracht, nachdem die zu verklebenden oder abzudichtenden Gewebeteile adaptiert wurden, und so lange in der adaptierten Position gehalten, bis das Gemisch beider Arzneimittel geronnen ist. Falls erforderlich, können die Gewebeteile auch noch längere Zeit in einer fixierten Position verbleiben, die bis zu mehreren Stunden betragen kann.
14. Anwendung eines thrombinhältigen Arzneimittels.
Zu 2,0 mL eines erfindungsgemäßen Arzneimittelgemisches nach Beispiel 13 werden 0,2 mL eines thrombinhältigen Arzneimittels nach Beispiel 12 mit 2.000 Einheiten Thrombin pro mL zugesetzt und rasch vermischt. Dieses Gemisch wird zur Blutstillung rasch auf blutende Stellen aufgebracht, möglichst nach Entfernung von angesammeltem Blut, entweder durch Absaugen bzw. Aufsaugen oder durch Verblasen des Blutes. 15. Bestimmung des Gerinnungsfaktors XI und des Gerinnungsfaktors XII in lonenaustauscher-Eluaten nach Beispiel 4a, die nicht nach ihrer Beladung gelagert, sondern nach dem Waschen des beladenen Ionenaustauschers sofort eluiert werden. Die Bestimmung erfolgt mit Hilfe der entsprechenden Gerinnungsfaktoren-Mangelplasmen von American Diagnostica.
16. Bestimmung von Kallikrein und Präkallikrein in Eluaten von Ionenaustauschern, die mit Prothrombinkomplexen beladen und nach dem Waschen sofort oder erst nach Lagerung bis zu 100 Stunden bei Kühlschranktemperatur eluiert wurden . Die Kallikreinaktivität wird mit Hilfe des chromogenen Substrats S-2403 bestimmt, wobei zur Bestimmung eine 4 mM chromogene Substratlösung verwendet wird, die im Gesamtansatz in einer 0,4 mM Konzentration vorliegt. Die Präkallikreinkonzentration wird ebenfalls mit chromogenem Substrat S-2403 bestimmt, indem das Eluat in einer 1 :10 Verdünnung mit gleichem Volumen einer 0,5%igen Kaolinsuspension versetzt und 5 Minuten bei 37° C unter Schütteln inkubiert wird. Von der gemessenen Extinktion wird die Extinktion, die ohne Aktivierung mit Kaolinsuspension erhalten wird, abgezogen und auf einer Standardkurve die Mengen, bzw. Einheiten Präkallikrein ermittelt.
17. Bestimmung von Präkallikrein-Aktivator. Die Bestimmung erfolgt gleichartig wie die Bestimmung von Präkallikrein, nur dass anstelle von Kaolinsuspensionen eine Konzentrationsreihe von Präkallikrein-Aktivatoren hergestellt wird. Wenn Kupfersalze der Ellagsäure verwendet werden, wird eine Konzentrationsreihe von zwischen 10 ng bis 10000 ng verwendet, die aus einer vorgelegten Menge Präkallikrein innerhalb von 5 Minuten bei 37° C die maximale Menge Kallikrein bildet.
18. Herstellung pflanzlicher und/oder synthetischer Phospholipid-Emulsionen aus L-α-Phosphatidylcholin, L-α-Phosphatidyl-L-Serin und L-α-Phosphatidyl- äthanolamin, die in gleicher Form erfolgt wie sie in Beispiel 5 angegeben ist.
19. Bestimmung von TAFIa. Die Bestimmung von TAFIa erfolgt mit Hilfe eines
Chromogenic TAFI Activity Kits von American Diagnostika ohne Zusatz von Aktivator (Thrombin). Der Gehalt an TAFIa wird aus einer Standardkurve errechnet, die mit Verdünnungen von Plasma und nachfolgender Aktivierung mit Thrombin und Messung der TAFIa- Aktivität mit Hilfe eines chromogenen Substrats ermittelt wurde.
20. Bestimmung von Gerinnungsfaktor Xllla. Die Bestimmung von aktiviertem Faktor
XII erfolgt nach der European Pharmacopoeia Suppl. 4.5. 07/2003, p. 3687 ohne Verwendung von Aktivatoren des Faktors XIII (Thrombin).
21. Ultraschallbehandlung von Phospholipid-Emulsionen. Es werden durch Verdünnung mit isotoner Kochsalzlösung aus den Phospholipid-Gemischen 1%ige Suspensionen hergestellt und 2 mL einer Beschallung unterzogen. Die Beschallung wird mit dem Ultraschall-Desintegrator Sonifire II W-250 durchgeführt. Die Ausgangsleistung beträgt maximal 200 Watt bei einer Arbeitsfrequenz von 20 kHz. Verwendet wurde Konverter 102 C mit Standard- Resonator 1/2" mit Mikrospitze 101-148-062. Die Beschallungsdauer wird zwischen 10 und 100 Sekunden ohne Kühlung der beschallten Emulsion bei Stufe 1 und bei 10% Pulsierintervall durchgeführt. Die Aktivität der beschallten Phospholipid-Emulsion wird mit Hilfe eines Referenzplasmas und einer Kaolinsuspension durch Bestimmung der partiellen Thromboplastinzeit durchgeführt. 100 μL Plasma werden mit 50 μL einer Liposomenemulsion und 50 μL einer 0,5%igen Kaolinsusension 5 Minuten bei 37° C inkubiert, rekaizifiziert, und die Gerinnungszeit bei 37° C bestimmt. Es wird die erforderliche Menge Liposomenemulsion bestimmt, die die kürzeste Gerinnungszeit verursacht. Die Wirksamkeit der in Beispiel 5 und 6 angeführten Liposomen-Emulsionen kann ebenso wie die in Beispiel 18 angeführten Phospholipid-Emulsionen durch diese Methode bestimmt werden.
22. Ermittlung der geeigneten Ca-Ionenkonzentration zur erwünschten Einstellung der Gerinnungszeit einer thrombingenerierungsfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung. Thrombingenerierende, pharmazeutische Zubereitungen werden hergestellt, und die zu untersuchende pharmazeutische Zubereitung wird in einer geometrischen Verdünnungsreihe mit Ca-Ionen versetzt, in der die höchste Ca-Ionenkonzentration 1 mM ist. Die Verdünnungsreihe wird von 125 μm bis 1000 μm angesetzt. In gleichartiger Weise wird eine Ca-Ionen- konzentrationsreihe von 10 mM bis 640 mM angesetzt und die Gerinnungszeit bestimmt. Die erforderliche Ca-Ionenkonzentration wird mit Hilfe einer Standardkurve ermittelt.
23. In einem schachbrettförmigen Ansatz wird das optimale Gemisch einer Phospholipidmischung mit Kaolin ermittelt, das bei einer optimalen Ultrabeschallung die größte Aktivität in der APTT mit Plasma zeigt. Der Test wird mit 100 μL des beschallten Gemisches, das mit 100 μL Plasma 5 min bei 37° C inkubiert war und durch Zusatz von 100 μL einer CaCI-Lösung rekalzifiziert wird, durchgeführt. Um die optimale Beschallungsintensität zu ermitteln, wird die Beschallung wie in Beispiel 21 vorgenommen, wobei ein 80%iges Pulsierungsintervall bei den Stufen 1 , 2 und 3 angewendet und in entsprechenden Ansätzen eine 10-, 30-, 100- und 300-Sekundenbeschallung vorgenommen wird.
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Claims

Patentansprüche:
1. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung zur Herstellung eines thrombingenerierfähigen oder thrombinhältigen Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, dass sie enthält:
(A)aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenes Prothrombin
(Gerinnungsfaktor II), (B) aus Plasma oder gentechnologisch gewonnene Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, die zumindest teilweise in aktiviertem Zustand vorliegen können, und aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor Xla, und (C)prionensichere, gerinnungsaktive Phospholipide, wobei die Phospholipide gegebenenfalls in Liposomen enthalten sind.
2. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie auch aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktor VII oder ein Gemisch von aus Plasma oder gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktoren VII und Vlla enthält.
3. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen gentechnologisch hergestellten Tissue Faktor als solchen oder in relipidierter Form enthält.
4. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gerinnungsfaktoren ausschließlich aus Blutplasma einer bestimmten Säugetierspezies hergestellt sind oder aus den entsprechenden gentechnologisch gewonnenen Gerinnungsfaktoren oder aktivierten Gerinnungsfaktoren, einschließlich Tissue Faktor, hergestellt sind.
5. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Prothrombin, die Gerinnungsfaktoren V, VIII, IX, X, Xla und gegebenenfalls die Gerinnungsfaktoren VII und Vlla, sowie der Tissue Faktor durch Virusinaktivierung und/oder Virusabreicherung virussicher sind.
6. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie in tiefgefrorener oder gefriergetrockneter Form vorliegt.
7. Thrombingenerierfähiges Arzneimittel, herstellbar aus einer pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
8. Thrombingenerierfähiges Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es in tiefgefrorenem oder in gefriergetrocknetem Zustand vorliegt.
9. Thrombingenerierfähiges Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Thrombin in einer solchen Menge enthält, dass es nach Auftauen oder Rekonstitution nicht mehr als 1 Einheit Thrombin pro ml enthält.
10. Thrombinhältiges Arzneimittel, herstellbar aus einer thrombingenerierfähigen, pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
11. Thrombinhältiges Arzneimittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es in tiefgefrorenem oder gefriergetrockneten Zustand vorliegt.
12. Arzneimittelgemisch, das vor seiner Anwendung durch Vermischen eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 7 bis 9 mit einem fibrinogenhältigen Arzneimittel innerhalb von 30 bis 300 Sekunden gerinnt.
13. Thrombinhältiges Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , das mit einem Arzneimittelgemisch nach Anspruch 12 versetzt, innerhalb von 3 bis 10 Sekunden gerinnt.
14. Verfahren zur Herstellung einer thrombinhältigen pharmazeutischen Wirkstoffzubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass eine thrombingenerierfähige Wirkstoffzubereitung mit Ca-Ionen versetzt wird, wobei ein thrombinhältiges Produkt gebildet wird, welches anschließend chromatographisch gereinigt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkstoffzubereitung durch Virusinaktivierung während oder nach der Thrombinbildung, sowie durch Virusabreicherung nach abgeschlossener Thrombinbildung virussicher gemacht wird.
16. Verfahren zur Herstellung eines Pro-Kofaktorenkonzentrates enthaltend die Gerinnungsfaktoren V und VIII, dadurch gekennzeichnet, dass aus Plasma gewonnenes Kryopräzipitat gelöst und aus der Lösung Fibrinogen abgetrennt wird, wobei eine die Gerinnungsfaktoren V und VIII hältige Lösung erhalten wird, welche mit Calciumchlorid versetzt werden kann.
17. Verfahren zur Herstellung eines Gerinnungsfaktor-XI-hältigen Prothrombinkomplexkonzentrates enthaltend die Gerinnungsfaktoren II, VII, Vlla, IX, X und XI, wobei pro 1 ,0 μg Prothrombin mindestens 0,030 μg Gerinnungsfaktor Xla enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, dass aus Plasma gewonnener Kryopräzipitatüberstand an einem Anionenaustauscher adsorbiert und nach Waschen des Adsorbats und Lagerung in der Kälte Gerinnungsfaktor-Xla-hältiger Prothrombinkomplex eluiert wird.
18. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 1 - 6 aus virusinaktivierten, thrombin-generierenden, Gerinnungsfaktor-Xl- und Gerinnungsfaktor-XII-hältigen Prothrombinkomplexen, die vorzugsweise in Anwesenheit gerinnungsaktiver Phospholipide durch Zusatz von virusinaktiviertem oder von virussicherem Kallikrein oder virusinaktiviertem bzw. virussicherem Präkallikrein und mit virussicheren Präkallikreinaktivatoren aktiviert werden.
19. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 1 - 6 und 18, die außer Prothrombinkomplexen auch noch TAFI oder TAFI und Gerinnungsfaktor XIII enthalten und nach der Aktivierung von Prothrombin einen Gehalt von mindestens 3 E (50 μg) TAFIa bzw. 3 E TAFIa und 5 E Gerinnungsfaktor Xllla pro 1000 E Thrombin aufweisen.
20. Pharmazeutische Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 1 - 6 und Zubereitungen von Arzneimittelgemischen nach den Ansprüchen 7 - 13, 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass prionensichere, gerinnungsaktive Phospholipide pflanzlichen Ursprungs oder solche pflanzlichen und synthetischen Ursprungs verwendet werden, vorzugsweise in einem Verhältnis von Phosphatidylcholinen zu Phosphatidylserinen von 3 + 1 oder von Phosphatidylcholinen zu Phosphatidylserinen zu Phosphaäthanolaminen von 2 + 2 + 1.
21. Herstellung von pharmazeutischen Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 1 - 6, 18, 19 und 20 sowie von Arzneimitteln nach Ansprüchen 7 - 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zu verwendenden Phospholipidemulsionen noch einer Ultraschallbehandlung und daraffolgend allenfalls einer Sterilfiltration unterzogen werden.
22. Herstellung von thrombingenerierfähigen, virussicheren Arzneimitteln nach Anspruch 9 und pharmazeutischen Wirkstoffzubereitungen nach Ansprüchen 18 und 19, wobei als Komponente C nach Ansprüchen 20 und 21 hergestellte Phospholipidemulsionen verwendet werden.
23. Herstellung von thrombinhältigen, virussicheren Arzneimitteln nach Anspruch 10 und pharmazeutische Wirkstoffzubereitungen nach den Ansprüchen 18 oder 19, wobei als Komponente C nach Ansprüchen 20 und 21 hergestellte Phospholipidemulsionen verwendet werden.
24. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln nach den Ansprüchen 7 - 9, 22, sowie eines Arzneimittelgemisches nach Anspruch 12, indem eine Ca- Ionenkonzentration unter 1 mM oder über 10 mM zur Anwendung kommt.
25. Herstellung von Phospholipidmischungen nach den Ansprüchen 20, 21 , 22 und 23, die mit Kaolin versetzt und nach Ultraschallbehandlung zur Aktivierung von Prothrombinkomplex-hältigen Lösungen verwendet werden.
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