WO2004083856A1

WO2004083856A1 - 大腸癌マーカー検出方法

Info

Publication number: WO2004083856A1
Application number: PCT/JP2003/011972
Authority: WO
Inventors: Shigeru Kanaoka
Original assignee: Hamamatsu Foundation For Science And Technology Promotion
Priority date: 2003-03-19
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2004-09-30
Also published as: US7816077B2; ATE451617T1; JP4134047B2; ES2335344T3; US20060216714A1; CN100567985C; US20100323367A1; CA2518933A1; US8080378B2; CA2518933C; JP2008271969A; EP1605261A1; US8445202B2; EP1605261A4; JPWO2004083856A1; AU2003264512A1; DE60330505D1; JP4206425B2; CN1759317A; EP1605261B1

Abstract

本発明は、従来の便潜血検査を超える感度及び特異度を有する非侵襲的かつ簡便な大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法を提供する。具体的には、採取された、場合により液体窒素を用いて直ちに凍結された生物学的サンプルを、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製し、得られた懸濁物からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを増幅し、増幅されたｃＤＮＡを検出する、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法であって、生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とする方法。

Description

明細書

大腸癌マーカー検出方法技術分野

本発明は、生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とする、生物学的サンプルから RN Aを抽出する工程を含む大腸癌診断のための腫瘍マ一力一の検出方法に関する。背景技術

大腸癌による死亡者が、増加している。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第 4番目、女性においては第 2番目に多い癌である（1 999年度癌死統計）。また、 2015年の癌患者推計では、男女とも似に第一位になると推計されており、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が求められており、癌の集団検診は、最も効果的な方法の一つである。

癌の集団検診（mass screening) のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。

しかし、便潜血検査は、糞便中にヘモグロビンが現れることが腫瘍に特異的なものではないことから、感度及び特異度が低く（感度 30〜 90 %、特異度 70〜98%)、そのため偽陰性や偽陽性が少なからず存在するという欠点がある。

また、大腸癌の診断には、免疫学的便潜血法によるスクリーニングの後か、又は同時に、全大腸内視鏡検査又は注腸検査と S状結腸内視鏡検査とが組み合わせて用いられており、多大な時間と労力がかかるという欠点がある。

便潜血検査の代替法としては、糞便中の K— r a s、 p— 53、 A PC遺伝子変異やマイクロサテライト不安定性を検出する等の DN Aを用いた方法が報告されている (シドランスキー等著 (D. Sidransky, et al. )、サイエンス (Science), 第 256巻、 1992年 4月 3日、第 102頁〜第 105頁；ドン等著（S.M.Dong, et al.)、ジャーナル 'ォブ'ザ 'ナショナル 'キャンサー ' インスティテュート（Journal of the National Cancer Institute), 第 93巻、第 1 1号、 2001年 6月 1 1日、第 858頁〜第 865頁；トラベルソ等著 (G.Traverso, et aし）、ザ ·ニューィングランド ·ジャーナル ·ォプ ·メディシン（The New England Journal of Medicine) , 第 3 4 6巻、第 5号、

2002年 1月 31日、第 31 1頁〜第 320頁；トラベルソ等著（G. Traverse et al.)、ザ · ランセット (The Lncet)、第 359巻、 2002年 2月 2日、第 403頁〜第 404頁）。

これらの D N Aを用いる方法は、非侵襲的で癌細胞の直接的変化を捉えることができる方法であり、特異度が高いという特徴を有し、将来性豊かな方法と考えられるが、従来技術である便潜血検査と比べると感度が低く、また、時間と労力もかなりかかるという欠点がある。

また、さらなる便潜血検査の代替法として、遺伝子発現をより直接的に検出するために、糞便中のタンパク質キナーゼ C (PKC) 等の mRNAを検出する方法も開発されている（デビッドソン等著（L.A.Davidson, et al.)、カーシノジェネシス（Carcinogenesis；)、第 19巻、第 2号、 1998年、第 253頁〜第 2 5 7頁；ァレキサンダー及びライハツト等著（R.J.Alexander and R.F.Raicht), ダイジエステイブ ·デジ一ジス 'アンド ·サイエンス（Digestive Diseases and Sciences), 第 43巻、第 12号、 1998年、第 2652頁〜第 2 6 5 8頁；ャマオ等著（T.Yamao et al. )、ガストロェンテロロジー

(Gastroenterology), 第 1 14巻、第 6号、 1 9 98年、第 1 1 98頁〜第 1205頁）。

しかし、上記の RNAを用いる方法によっても、少量の糞便から簡便かつ効率的に RN Aを抽出することができず、便潜血法を超える感度を得ることができなかった。

PCR法を逆転写酵素反応（RT) と組み合わせることによって、 RNAを定性的に、また定量的に検出する方法が知られている。この RT— PCR法は、微量分子を検出することができる感度の高さで、ノーザンプロット法に優り、また、手技の速さや容易さで in situハイブリダィゼ一ション法に優るものである。しかし、 RNAは、 DN Aに比べて不安定であり、かつ、全ての生物学的試料中に普遍的に存在し、極めて安定である RNA分解酵素（RNa s e) による分解の危険性に常にさらされていることから、 RT— P CR法においても、 RNA の精製過程及び精製後においても、 RNa s eが混入しないように厳密な管理が要求される。

したがって、糞便という生物学的に極めて粗製の試料から RN Aを抽出する際には、 RNa s eの影響を排除するために、予め細胞画分を分離する工程が必要とされていた。

したがって、極めて多量の微生物に由来する膨大な量の RN a s eが存在する糞便中から直接 RNAを検出することは、不可能であり、少なくとも微生物等に由来する外因性 RNa s e除去のために細胞画分の分離は、必須であると考えられていた。

しかし、本発明者は、驚くべきことに、場合により凍結した生物学的試料を R N A分解酵素阻害剤の存在下に均質化することによって、上記課題を解決することができることを発見し、本発明を完成させた。発明の開示

したがって、本発明の目的は、従来の便潜血検査を超える感度及び特異度を有する非侵襲的かつ簡便な大腸癌診断のための腫瘍マ一カーの検出方法を提供することにある。

本発明は、下記工程：

a) 採取された生物学的サンプルを RNA分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、

を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカ一の検出方法に用いる RN Aを抽出するための試料の調製方法であって、

生物学的サンプルから細胞成分を分離する工程を含まないことを特徴とする方法である。

ここで、該採取された生物学的サンプルは、凍結されていることが好ましい。また、本発明は、 RNA分解酵素阻害剤が、チォシアン酸グァニジンである、上記方法である。

また、本発明は、生物学的サンプルが、糞便である、上記の方法である。また、本発明は、上記の方法の工程に加えて、下記工程：

b) 得られた RNAを抽出するための試料から、 RNAを抽出する工程、 c) 抽出された RNAを逆転写し、 cDNAを得る工程、

d) 得られた c DN Aを増幅する工程、及び

e) 増幅された cDNAを検出する工程

を含む、大腸癌診断のための腫瘍マ一カーの検出方法である。

本発明は、腫瘍マ一カーが、 COX— 2である、大腸癌診断のための腫瘍マー力一の検出方法である。

また、本発明は、下記手段：

a) 採取された生物学的サンプルを RNA分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、

を含む大腸癌診断のための腫瘍マ一カーの検出方法に用いる RN Aを抽出するための試料の調製のためのキットであって、

生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とするキットである。

また、本発明のキットは、好ましくは、該採取された生物学的サンプルを凍結する手段を含む。 '

また、本発明は、 RNA分解酵素阻害剤が、チォシアン酸グァニジンである、上記のキットである。

また、本発明は、生物学的サンプルが、糞便である、上記のキットである。また、本発明は、さらに、下記手段：

b) 得られた RNAを抽出するための試料から、 RNAを抽出する手段、 c) 抽出された RNAを逆転写し、 cDNAを得る手段、

d) 得られた cDNAを増幅する手段、及び

e) 増幅された c D N Aを検出する手段

を含む、大腸癌診断のための腫瘍マ一カーの検出キットである。

また、本発明は、腫瘍マ一カーが、 COX— 2である、上記のキットである。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 2の電気泳動結果である。レーン 1は、ァレキサンダーらの方法でヒト糞便から抽出された全 RN Aである。レーン 2は、本発明の方法でヒ卜糞便から抽出された全 RNAである。レーン 3は、ヒト大腸癌組織から抽出された全 RNAである。レーン Mは、分子量マーカーである。発明を実施するための最良の形態

本発明の RNA分解酵素阻害剤としては、チォシアン酸グァニジン、ァイソジェン（ I s o g e n e)、ウルトラスペック II (登録商標) (U 1 t r a s p e c II) 等が挙げられる。

本発明の生物学的サンプルとしては、動植物組織、体液、排泄物等を挙げることができ、好ましくは、糞便、より好ましくは、ヒトの糞便である。

本発明の生物学的サンプルは、そのままか、又は場合により凍結して用いることができる。

凍結方法は、任意の従来技術を用いることができ、好ましくは、液体窒素を用いる方法である。凍結温度は、保存温度は、 _ 1〜一 196°C、好ましくは、一 20〜一 1 96° (：、好ましくは、 _ 7 5〜― 1 96 、より好ましくは、 ― 110〜一 196°C、最も好ましくは— 196°Cである。

凍結されたサンプルは、冷凍保存してもよい。保存温度は、一 7 5〜一 196°C、好ましくは、一 1 10〜― 196°C、より好ましくは— 196°Cである。保存期間は、 1日〜 10年、好ましくは、 1日〜 3年、より好ましくは、 1日〜 1年である。

本発明で用いられる腫瘍マーカーとしては、 COX— 2、マトリックスメタ口プロテア一ゼ（MMP；)、 c一 me t、 CD44変異体（variants)、 EGF_R、 EF - 1、 Wn t— 2、ブラディオン（Bradeion)、 SKP 2、 KP C - 1、 K

P C— 2、 P R L— 3、アンギオゲニン (Angiogenin)、インテグリン (Integrin), S n a i 1、 Dy s adh e r i n等が挙げられるが、好ましくは、 COX—2である。

上記工程 c) 〜e) は、 RT— PCR法と呼ばれるものであり、例えば、関谷剛男等編、 PCR法最前線、 1997年、共立出版、第 187頁〜第 196頁の記載にしたがって行うことができる。

懸濁物からの RN Aの抽出は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、 RNe a s y M i n i (Q I AGEN) や RNA E t r a c t i on K i t (Pharmacia Biotech) のような市販のキットを用いることができる。本発明で逆転写とは、逆転写酵素（Reverse Transcriptase) を用いて RNA を相補的な DNA (cDNA) に転換することをいう。逆転写反応は、通常、バッファ一、 Mg C 1₂や KC 1等の塩類、ジチオスレィ！ル (DTT)、ブライマ一、デォキシリボヌクレオチド類、 RNa s e阻害剤及び逆転写酵素を含む溶液を用いて行われる。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質や界面活性剤等を添加することもできる。

逆転写に続いて行われる c DNAの増幅は、通常、 PCRが用いられる。 PC Rの反応液は、通常、バッファ一、 MgC 1₂や KC 1等の塩類、プライマー、デォキシリポヌクレオチド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドゃ界面活性剤等を添加することもできる。 cDNAの増幅は、 LAMP法（特許第 3313358号公報）や I CAN法 (特開 2001— 136965) を用いることもできる。

本発明でプライマーとは、 cDN A合成や核酸増幅の際の合成開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、日本鎖も使用することができる。プライマーが二本鎖である場合には、増幅反応に先立ち、一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法にしたがって合成することができ、また、生物から単離することもできる。

逆転写反応に使用する逆転写酵素は、 RNAを cDNAに逆転写することができる酵素を意味する。逆転写酵素としては、 RAV (Rous associated virus) や AMV (Avian myeloblastosis virus) 等のレトロウイルス由来の逆転写酵素や、 MMLV (Moloney murine leukemia virus) 等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素があるが、これらに限定されるものではない。 P C Rに用いる耐熱性ポリメラ一ゼとしては、 T a qポリメラ一ゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。

増幅された D N Aの検出方法としては、ァガロースゲルを用いる電気泳動を用いることができるが、これに限定されるものではない。

また、本発明のキットには、本発明の方法を記載した指示書を含むこともできる。実施例 1

以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。

浜松医科大学第 1内科に精査 ·治療目的のために入院し、全大腸内視鏡によつて大腸癌の存在が確認された患者 30例、及び大腸に腫瘍又は炎症性変化のない (非大腸疾患）患者 22例を対象とした。なお、すべての患者からインフォ一ムドコンセントが得られている。

糞便は、採便後可及的速やかに 5 ml チューブに約 1 gずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、 — 80°Cで保存した。また、比較対照のため、それぞれの試料について免疫学的便潜血検査法により便中のヒトヘモグロビン（Hb) を測定した。組織は、治療前に受けた内視鏡検査時に癌部と正常部の生検材料を液体窒素で凍結してから一 80°Cで保存した。その後、ホモジナイザーとグァニジン塩とフエノールを用いてホモジナイズし、クロ口ホルムとエタノールで全 RNAを抽出した。

得られた RNAの 1 をリバ一スクリプト Π (登録商標）（反応液量 20 1、和光純薬）を用いて逆転写し c DN Αを得、その一部を Ge n e T a q (和光純薬）を用いて、ネステイド P CRによって増幅させた。得られた PCRを、 4 %ァガロースゲルを用いて電気泳動し、ェチジゥムブロマイドで染色した。なお、用いたプライマーは、逆転写では、ランダムプライマーであり、 PCR では、 CE Aについては、 Ge r h a r d (J J CO, 1994) に報告されたものであり、 COX— 2については、独自に設計したものを使用した。 PCRは、第 1ラウンドを 20サイクルで、第 2ラウンドを 25サイクルで行った。使用したプライマ一を下記に示す。

<CE A>

フォワード 1 ： 5 ' -TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG-3'

フォワード 2 ： 5' -GGGCCACTGCTGGCATCATGATTG-3'

リバース： 5' -TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3'

<COX- 2>

フォワード 1： 5' -CTGAAAACTCCAAACACAG-3'

'フォワード 2 ： 5' -GCACTACATACTTACCCACTTCAA-3'

リバース： 5' -ATAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT-3 '

結果

大腸癌 3 0例（早期癌 3例、進行癌 2 7例）と対照群 2 2例における糞便からの RT— P CRによる CEA、 C〇X— 2の検出を試みたところ、以下の結果を得た。

CEAは、大腸癌 3 0例中の全例で、対照群 2 2例中の 2 1例で検出された。また、両者から RT— P C Rで増幅し得る RN Aの抽出が行えることが判明した。

CQX— 2は、大腸癌 3 0例中の 2 7例（盲腸 2ノ2、上行結腸 3 Z 5、下行き結腸 1/1、 S状結腸 7Z7、直腸 12Z13、早期癌 2 3、進行癌 2 5ノ 2 7) で検出されたが、対照群 2 2例中では、 1例も検出されなかった（感度 9 0 %、特異度 1 0 0 %)。

免疫学的便潜血検査法では、大腸癌 2 8例中 2 3例及び対照群 2 2例中 3例が陽性であった（感度 8 2. 1 %、特異度 8 6. 3 %)₀

COX- 2陰性大腸癌 3例中では、 1例で免疫学的便潜血検査が陽性であり、 2例が陰性であった。

免疫学的便潜血検査が陰性の大腸癌 5例中 3例で、 COX— 2が検出された。実施例 2

ヒト糞便から得られる全 RNAの量及び分子量の分布を、本発明の方法とァレキサンダーの方法 (非特許文献 6) とで比較した。対象として、ヒ卜の大腸癌組織から市販の RNA抽出剤（アイソジェン、和光純薬）を用いて全 RNAを抽出した。それぞれの試料から抽出された全 RN Aの同一量をァガロースゲル上で電気泳動した。

レーン 3 (ヒト大腸癌組織由来 R N A ) において認められる 2本の主要パンドは、 28 S及び 18 S r RNAを示す。また、スメァ状の部分は、得られた全 R N A中に種々の高分子 R N Aが含まれていることを示す。

レーン 2 (本発明の方法による糞便由来 RNA) において認められる 2本の主要バンドは、腸内細菌由来の 23 S及び 16 S r RNAを示す。また、レーン 3と同様にスメァ状の部分が認められることから、本願発明の方法によって糞便から得られた全 RN A中には、種々の高分子 RN Aが含まれていると考えられる。これに対して、レーン 1では、いかなるバンドもスメァも全く認められず、試料抽出物中には、高分子 RN Aが含まれていないことを示した。

実際に、レーン 2のサンプルからは RT— PCRで目的の産物が得られたが、レーン 1のサンプルからは、 P C R産物は得られなかった。

本研究結果から、本発明の方法によってヒト糞便から抽出された RN Aは、 R T_ PC Rによる増幅が可能であることが明らかとなった。また、 RT— PCR による糞便からの COX— 2の検出は、 90 %の感度及び 100 %の特異度を有することから、従来技術である免疫学的便潜血法に比べて優れていることが証明された。

また、本発明の方法は、報告されている APC、 K一 r a sや p 53遺伝子変異の検出に比べて、検出に必要とする糞便の量が少なくかつ検出感度が高いことから、検出にかかる時間及び労力を大幅に節約することができる。

従来技術の便潜血法が、病変からの「出血」という一般的かつ間接的な事象を対象とするのに対し、本発明の方法は、発癌マーカ一である COX— 2発現という特異的かつ直接的な事象を対象とすることから、本発明の方法によって得られたデータは、より品質の高い診断を提供することができる。

したがって、本発明の方法は、特異度及び感度の高い新規大腸癌の非侵襲的スクリ一ニング方法として臨床的に極めて有用なものである。

Claims

請求の範囲

1. 下記工程：

a ) 採取された生物学的サンプルを R N A分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、

を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いる RN Aを抽出するための試料の調製方法であって、

生物学的サンプルから細胞成分を分離する工程を含まないことを特徴とする方法。

2. 採取された生物学的サンプルが、凍結されている、請求の範囲第 1項記載の方法。

3. RNA分解酵素阻害剤が、チォシアン酸グァニジンである、請求の範囲第 1項又は第 2項記載の方法。

4. 生物学的サンプルが、糞便である、請求の範囲第 1項〜第 3項いずれか 1項記載の方法。

5. 請求の範囲第 1項〜第 4項いずれか 1項記載の方法に加えて、下記工程： b) 得られた RNAを抽出するための試料から、 RNAを抽出する工程、 c) 抽出された RNAを逆転写し、 cDNAを得る工程、

d) 得られた c DN Aを増幅する工程、及び

e) 増幅された cDNAを検出する工程

を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカ一の検出方法。

6. 腫瘍マーカ一が、 COX— 2である、請求の範囲第 1項〜第 5項いずれか 1項記載の方法。

7. 下記手段：

を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカ一の検出方法に用いる RN Aを抽出するための試料の調製のためのキッ卜であって、

生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とするキッ卜。

8. さらに、採取された生物学的サンプルを凍結する手段を含む、請求の範囲第 7項記載のキット。

9. RNA分解酵素阻害剤が、チォシアン酸グァニジンである、請求の範囲第 7項又は第 8項記載のキット。

10. 生物学的サンプルが、糞便である、請求の範囲第 7項〜第 9項いずれか 1項記載のキット。

11. さらに、下記手段：

d) 得られた cDNAを増幅する手段、及び

e) 増幅された cDNAを検出する手段

を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカ一の検出キット。

12. 腫瘍マ一カーが、 COX— 2である、請求の範囲第 7項〜第 11項いずれか 1項記載のキット。