indirekte Immunfluoreszenz - H.-P. Seelig

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen MembranproteineZielsetzungIndirekter Immunfluoreszenz-Test (IIFT) zum Nachweis von Autoantikörpern gegen RezeptorundKanalproteine an transitorisch transfizierten Kulturzellen (HEK293-Zellen).Für die im Folgenden beschriebene Methode liegen eigene Erfahrungen mit den in Tabelle 1aufgeführten Membranrezeptoren und Kanalproteinen vor.Tabelle 1 Expression von Rezeptor- und Kanalproteinen in HEK293 Zellen mit Hilfe despcDNA 3.1/ CT-GFP-TOPO ® -Vektors (Invitrogen)Rezeptor Gen Masse [kDa] ProteinnameLrp4 LRP4 212 Low-density lipoprotein receptor-related protein 4MuSK MUSK 97 Muscle, skeletal receptor tyrosine-protein kinaseCav1.1 CACNA1S 212 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit -1SCav1.2 CACNA1C 249 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit -1CGlyR-1 GLRA1 48 Glycine receptor subunit -1GABA B R1 GABBR1 108 Gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1GABA B R2 GABBR2 106 Gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 2mGluR1 GRM1 132 Metabotropic glutamate receptor 1mGluR5 GRM5 133 Metabotropic glutamate receptor 5Kv1.4 KCNA4 73 Potassium voltage-gated channel subfamily A member 4Kir2.1 KCNJ2 48 Inward rectifier potassium channel 2Kir2.6 KCNJ18 49 Inward rectifier potassium channel 18Kir4.1 KCNJ10 43 ATP-sensitive inward rectifier potassium channel 10TestprinzipAls Antigen dienen transitorisch transfizierte HEK293-Zellen (Human Embryonic Kidney Cells),die das der Fragestellung entsprechende Rezeptor- oder Kanalprotein auf der Zytoplasmamembranexprimieren. Die Transfektion erfolgt mit Klonierungsvektoren, die das vollständigeRezeptor- oder Kanalprotein oder Fragmente desselben in Form eines Fusionsproteins miteinem C-terminalen grün fluoreszierenden Protein (GFP) exprimieren. Bei der hier beschriebenenMethode wurde der Vektor pcDNA 3.1/ CT-GFP-TOPO ® (Invitrogen) verwendet, der diekodierende Sequenz eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) von 239 Aminosäuren Längemit einer maximalen Anregung bei 395 nm und 478 nm und einer maximalen Emission bei 507nm enthält. Dieses GFP-Protein wird nur in Anwesenheit der korrekt orientierten cDNA des gewünschtenProteins exprimiert. Erfolgreich transfizierte Zellen lassen sich daher leicht anhandder durch das Fusionsprotein vermittelten Grünfluoreszenz fluoreszenzmikroskopisch identifizieren(Abbildung 1).Zum Nachweis von Autoantikörpern in humanen Proben (Serum, Liquor) werden die auf Deckgläsernkultivierten, transfizierten HEK293-Zellen mit geeigneten Verdünnungen des Untersuchungsmaterialsin Kulturmedium inkubiert. Eventuell vorhandene Autoantikörper binden sichan die auf der Zellmembran exprimierten Rezeptorproteine. Nach Entfernung überschüssiger,unspezifischer Immunglobuline durch mehrfaches Waschen der Zellen werden diese mit Paraformaldehydfixiert und anschließend mit einem gegen humane Immunglobuline gerichteten, in© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 1 13.05.2013

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen Membranproteineder Regel rot fluoreszierendem Sekundärantikörper inkubiert. Bei den eigenen Untersuchungenwurde Alexa-Fluor 658 (Invitrogen) verwendet.Abbildung 1 Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis grün fluoreszierender HEK293-Zellen einer Deckglaskultur.Die HEK293-Zellen wurden mit dem Vektor pcDNA 3.1/ CT-GFP-TOPO ® transfiziert, der die codierende Sequenzdes Glycinrezeptors 1 enthält. a: Durch die Expression des grün fluoreszierenden Fusionsproteins lassen sich dieerfolgreich transfizierten und die das Rezeptorprotein exprimierenden Zellen leicht identifizieren. b: Überlagerung derBildausschnitte a und b. c: Darstellung des gleichen Bildausschnittes mittels Phasenkontrast zeigt eine vollständigeKonfluenz der Kulturzellen.Objektiv-Vergrößerung: 40-fach.Sofern in dem Untersuchungsmaterial Autoantikörper vorliegen, die sich gegen die auf denvitalen Zellen exprimierten Rezeptor- oder Kanalproteine richten, können diese durch den rotfluoreszierenden Sekundärantikörper mikroskopisch sichtbar gemacht werden. Es resultierteine Rotfluoreszenz der Zellmembran nur der transfizierten, grün fluoreszierenden Zellen (Abbildung2). Die Auswertung der Fluoreszenz erfolgt mit Fluoreszenzmikroskopen, die mit Filtersätzenfür Rot- und Grünfluoreszenz ausgerüstet sind. Da die Zellen während der Inkubationmit dem Primärantikörper, d. h. mit der humanen Probe, noch vital sind und Antikörper dieMembran vitaler Zellen nicht permeieren, werden intrazytoplasmatisch gelegene Anteile derFusionsproteine (z. B. im Golgi-Apparat) nicht mit den konjugierten Sekundärantikörpern angefärbt(Abbildung 2).Abbildung 2 Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Antikörpern gegen den metabotropen GABA-Rezeptor GABA B R2 mit Deckglaskulturen transfizierter HEK293-Zellen. Die Transfektion erfolgte mit dem GFP exprimierendenVektor pcDNA 3.1/ CT-GFP-TOPO ® , der die kodierende Sequenz für das vollständige Rezeptorprotein enthielt.Die Immunreaktion erfolgte an noch vitalen, nicht fixierten und nicht permeabilisierten Zellen.a: Intrinsische Grünfluoreszenz dreier transfizierter HEK293-Zellen. Neben der Membranfluoreszenz findet sich aucheine Grünfluoreszenz von Fusionsproteinanteilen im Zytoplasma. b: Die an der Zellmembran gebundenen Autoantikörpergegen den GABA B R2-Rezeptor wurden mit einem Alexa Fluor 568-markierten Antikörper gegen human-IgGnachgewiesen. Es findet sich nur eine Membranfluoreszenz der Zellen. Die intrazytoplasmatischen Proteinanteilebleiben ungefärbt, da der Autoantikörper während der Reaktion mit den Antigenen auf der Membran vitaler Zellen dieZellmembran nicht penetrieren kann. c: Überlagerung von a und b. Die gelbgefärbten Strukturen kennzeichnen dieBindungsstellen des humanen Autoantikörpers.Objektiv-Vergrößerung: 100-fachDer Vorteil dieser Methode liegt darin begründet, dass sich die Membranproteine auf denvitalen Zellen in ihrer natürlichen Konformation befinden und dass in der Regel nur Autoantikörpergegen auch in vivo akzessible Konformationsepitope nachgewiesen werden, die möglicherweiseauch in vivo eine pathogene Rolle spielen.Zur Darstellung intrazytoplasmatisch gelegener Antigene müssen die Zellen vor der Inkubationmit dem Primärantikörper fixiert (z. B. mit Paraformaldehy) und permeabilisiert (z. B. mit Triton© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 2 13.05.2013

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen MembranproteineX-100) werden. Dies wird notwendig, wenn z. B. Fusionsproteine immunfluoreszenzmikroskopischnachgewiesen werden sollen, die keine intrinsische Fluoreszenzeigenschaften besitzen.Die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen zerstört allerdings die natürliche Konformationder Rezeptor- und Kanalproteine auf der Zellmambran.Abbildung 2 Demeaskierung von in vitro nicht akzessiblen Epitopepn duch Zellfixierung und -Permeabilisierung derMembran. HEK-293-Zellen transfiziert mit dem GFP exprimierenden Vektor pcDNA 3.1/ CT-GFP-TOPO ® , der diekodierende Sequenz für das gesamte Low density lipoprotein receptor-related protein-4 (Lrp4) enthält wurden vor undnach Denaturierung durch Paraformaldehydfixierung und Behandlung mit Triton X-100 mit einem polyklonalen Antikörpergegen Lrp4 vom Kaninchen (Sigma) inkubiert. Der Antikörper wurde gegen ein sythetisches Peptid erzeugt, dasein Sequenzfragment unmittelbar vor der Transmembranregion von Lrp4 umfasst.a, b: Untersuchung von vitalen, nicht fixierten Zellen. Erste Inkubation mit anti-Lrp4 vom Kaninchen, zweite Inkubationmit Alexa Fluor ® 568-markiertem anti-Kaninchen IgG. a: Intrinsische Fluoreszenz der transfizierten HEK293-Zellen. b:Nach Inkubation der vitalen Lrp4-transfizierten HEK293-Zellen mit anti-Lrp4 und anti-Kaninchen-IgG findet sich keineFärbung der Antigen-exprimierenden Zellen.c - e: Untersuchung an Paraforaldehyd und Triton X-100 vorbehandelten HEK293-Zellen. c: Intrinsische Grünfluoreszenzder transfizierten, Lrp4 exprimierenden Zellen. d: Nach Inkubation mit anti-Lrp4 von Kaninchen findet sich jetzteine deutliche Fluoreszenz der Zellmembran und der intrazytoplasmatischen Lrp4-Anteile. Offensichtlich wurde durchdie Fixierung und Triton-Behandlung die Konformation des Lrp4 so verändert, dass der Antikörper jetzt den kryptischenSequenzanteil erkennen kann. e: Überlagerung von c und d.Objektivvergrößerung: a, b: 100-fach; c - d: 40-fach.Es muss damit gerechnet werden, dass bei dieser Methode unter Umständen monoklonaleoder polyklonale Antikörper gegen Rezeptor- oder Kanalproteine, die durch Immunisierung mitdenaturierten Proteinen und synthetischen Peptiden gewonnen wurden, nicht mit auf vitalenZellen exprimierten Konformationsepitopen reagieren (Abbildung 3), ebenso nicht humaneAntikörper, die sich gegen kryptische oder denaturierte Peptidfragmente richten. Es ist dahermöglich, dass mit Assays, in denen denaturierte Antigene zum Nachweis der Autoantikörpereingesetzt werden (z. B. Elisa, Westernblot, RIA), diskrepante Resultate erhalten werden.© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 3 13.05.2013

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen MembranproteineDurchführung HEK293-Zellen - Lagerung und Kultivierung Deckglaskulturen - mit HEK293-Zellen für immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen Transfektion - von Deckglaskulturen der HEK293-Zellen mit Plasmid-DNA IIF-Test - Reagenzien und vorbereitende Arbeitsschritte Testablauf - IIFT mit nicht permeabilisierten und permeabilisierten HEK293-ZellenHEK293-Zellen Permanente Lagerung der HEK293-Zellen (ATCC ® CRL.1573) über flüssigem Stickstoff, in 1mL Kryogefäßen in RMPI-Medium 1640, Dimethylsulfoxid (DMSO), fetalem Kälberserum (FCS)(80 : 40 : 10 [Vol : Vol : Vol]). Der Inhalt eines Kryogefäßes entspricht der halben Zellzahl einernahezu konfluent bewachsenen 75 cm 2 Kulturflasche (ca. 10 7 Zellen). Die Zellen werden bei 37°C aufgetaut, in 10 mL Kulturmedium überführt, zur Entfernung von DMSO bei 600xg zentrifugiertund dann zur Kultivierung in frischem Medium aufgenommen. Die Kultivierung erfolgtnach den üblichen Kriterien der Zellkulturtechnik in 75 cm 2 Kulturflaschen bei 37 °C in 5 % CO 2 . Kulturmedien und Reagenzien Medium IFür die permanente Kultivierung der HEK293-Zellen.Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% FCS, je 100 U/mL Penicillin G undStreptomycin. Medium IIFür die Herstellung des Tranfektionsreagenz und kurzzeitige Kultivierung nach Transfektion.Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ohne FCS und ohne Antibiotika. Medium IIIFür die Kultivierung von transfizierten HEK293-Zellen.Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % FCS ohne Antibiotika. EDTA-PBSZum Ablösen der am Boden der Kulturflaschen adhärenten HEK293-Zellen.3 mM EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 8,0 (siehe Anhang).Die permanente Kultivierung der HEK293-Zellen erfolgt in 75 cm 2 Kulturflaschen mit 19 mLMedium I bei 37 °C in 5 % CO 2 . Erreicht die Zelldichte eine Konfluenz von >75 %, werden dieam Boden haftenden Zellen mit 3 mM EDTA-PBS abgelöst und in frischem Medium I bis zurTransfektion weiter kultiviert.Zum Ablösen der Zellen wird das in der Kulturflasche befindliche Kulturmedium vollständigabgesaugt. Zu den am Boden haftenden Zellen werden 2,0 mL 3 mM EDTA-PBS (Raumtemperatur)zugegeben und durch Schwenken gleichmäßig über den Zellrasen verteilt. Anschließendwerden 1,5 mL des EDTA-PBS abgesaugt und verworfen. In der Kulturflasche verbleiben 0,5mL PBS-EDTA. Zur vollständigen Ablösung der Zellen werden die Kulturflaschen noch 5 - 10Minuten bei 37 °C in 5 % CO 2 gehalten.Den abgelösten Zellen werden 19 mL frisches Kulturmediums (Medium I, 37 °C) zugegeben.Nach gutem Mischen zur Auflösung von größeren Zellverbänden wird diese Zellsuspension(19 mL) auf 3 Kulturflaschen (je 6 mL) verteilt. Jedem Aliquot der Zellsuspension werden 13 mLMedium I (37 °C) zugegeben: ergibt 19 mL Kulturmedium mit einem Drittel der ursprünglichenZelldichte pro Kulturflasche.© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 4 13.05.2013

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen MembranproteineDeckglaskultur Für immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen werden die HEK293-Zellen auf 15 mm 2großen Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläsern (zwecks besserer Zellhaftung) kultiviert. Anzucht,Transfektion und immunologische Untersuchungen erfolgen in Zellkulturplatten mit 12Kavitäten (12-Well Platten; Grundfläche der Kavitäten: 4 cm 2 ). Herstellung Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser Unter der Sterilbank Deckgläser (15 mm 2 ) in Aceton und 100 % Ethanol säubern, kurzabflammen, abkühlen lassen, in Poly-L-Lysin-Lösung (siehe Anhang) schwenken, aufsterilem Verbandmull oder sterilem Karton trocknen lassen. Nach vollständigem Trocknen (ca. 30 Minuten) Deckgläser flach in die Kavitäten der 12-Well Kulturplatten legen. Deckgläser müssen plan dem Boden aufliegen, dürfen keineRisse oder sonstigen Beschädigungen aufweisen. Deckgläser mit 1 mL Kulturmedium (Medium I) überschichten und 12 - 24 Stunden bei37 °C bis zum Einbringen der HEK293-Zellen vorinkubieren. Kulturmedium unmittelbar vor Einbringung der für die Transfektion vorgesehenenHEK293-Zellen von den Deckgläsern absaugen.TransfektionHEK293-Zellen werden 24 Stunden vor der geplanten Transfektion in frischem Medium I (37 °C)wie oben beschrieben aufgenommen, in die mit sterilen Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsernbestückten sterilen 12-Well-Kulturplatten überführt und bei 37 °C in 5 % CO 2 kultiviert. DieGrundfläche einer Kavität beträgt 4 cm 2 . Eingefüllt werden pro Kavität 1 mL der Zellsusupension(Füllhöhe 0,25 cm). Die Zelldichte soll bis zum Beginn der Transfektion einer Zellkonfluenzvon 50 % entsprechen. Dies wird in der Regel innerhalb von 24 Stunden erreicht erreicht. TransfektionsreagenzDie Transfektion von HEK293-Zellen erfolgt mit einer Suspension von► Lipofectamine ® 2000 Reagent (Invitrogen) und der► cDNA des zu untersuchenden Proteins, kloniert in pcDNA 3.1/CT-GFP-TOPO ® -Vektor(Stratagene).Zur Herstellung des gebrauchsfertigen Transfektionsreagenz wird Kulturmedium ohne Antibiotika-und FCS-Zusatz (Medium II, reduziertes Kulturmedium) verwendet. Die Verdünnungenvon Lipofectamine und cDNA sind inTabelle 3 angegebene. Das DNA / Lipofectamine - Verhältnisbeträgt 1 : 2,5 [Gew / Vol]. Bei unzureichender Transfektionsrate kann das Mengenverhältnisden Angaben des Herstellers entsprechend modifiziert werden. Alle Arbeitsschritte erfolgenunter der Sterilbank mit sterilen Gefäßen und Pipetten.Für je eine Deckglaskultur, d. h. für eine Kavität der 12-Well-Kulturplatte, werden je 1,6 µgPlasmid-DNA und je 4 µL Lipofectamine benötigt (Tabelle 2).Die benötigte Menge Plasmid-DNA wird bei Raumtemperatur in der in der Tabelle 2 angegebenenMenge von Medium II gelöst. Die benötigte Menge Lipofectamine ® 2000 (vor Entnahme vorsichtig mischen) in der angegebenenMenge Medium II bei Raumtemperatur lösen und 5 Minuten bei Raumtemperaturhalten. Die Plasmid-DNA-Lösung der Lipofectamine-Lösung zugegeben und vorsichtig mischen.Die Suspension (es bilden sich DNA-enthaltende Lipofectamine-Mizellen) 20 Minuten beiRaumtemperatur halten und gelegentlich vorsichtig von Hand mischen.© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 5 13.05.2013

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen Membranproteine Kurz vor Beendigung der 20-minütigen Inkubation der DNA-Lipofectamine-Suspension dasin den Kavitäten der Kulturplatten enthaltene alte Kulturmedium sorgfältig steril absaugen(Quetschpipette, Wasserstrahlpumpe etc.). Zugabe von je 200 µL der Plasmid-DNA-Lipofectamine-Suspension in jede Kavität der Kulturplatte(Entspricht einer Füllhöhe von 0,5 mm). Nach Füllung aller Kavitäten die Platte vorsichtigschwenken um die Suspension gleichmäßig zu verteilen und ohne Verzögerung in jede Kavität 1mL vorgewärmtes Medium II (37 °C) pipettieren. Anschließendvorsichtig mischen. Kulturplatten abdecken und die Zellen bei 37 °C in 5 % CO 25 Stunden inkubieren. Nach 5 Stunden Inkubation das Transfektionsmedium absaugen und durch 1 mL frisches,auf 37 °C vorgewärmtes Kulturmedium ohne Antibiotika aber mit FCS (Medium III) ersetzen. Weitere 19 Stunden bei 37 °C in 5 % CO 2 kultivieren (insgesamt ca. 24 Stunden) bis diegewünschte Zelldichte erreicht wurde. Überprüfen der Transfektionsrate: Ein Deckglas entnehmen, 3-mal in PBS abgespülen undmit der zellbewachsenen Seite nach unten auf einen Objektträger mit Eindeckmedium auflegen.Überprüfung mittels Auflicht-Fluoreszenz mit einem für FITC geeigneten Filtersatz.Tabelle 2 Transformationsreagenz, benötigte Reagenzmengen (Plasmid-DNA und Lipofectamin® 2000) für Deckglaskulturen in 12-Well-Kulturplatten.Kulturplatte Plasmid-DNA Lipofectamine-Lösung TransfektionsreagenzKavitätenDNA[ µg]Medium II[ µL]Lipofectamin[ µL]Medium II[ µL]Endvolumen[µL]1 1,6 100 4 100 2002 3,2 200 8 200 4003 4,8 300 12 300 6004 6,4 400 16 400 8005 8,0 500 20 500 1.0006 9,6 600 24 600 1.2007 11,2 700 28 700 1.4008 12,8 800 32 800 1.6009 14,4 900 36 900 1.80010 16,0 1.000 40 1.000 2.00011 17,6 1.100 44 1.100 2.20012 19,2 1.200 48 1.200 2.400© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 6 13.05.2013

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen MembranproteineIIF-TestDie Untersuchungen können in der Regel 18 - 24 Stunden nach Transfektion erfolgen. Reagenzien und vorbereitende Arbeiten DMEM-HEPES-BSA: DMEM mit 20 mM HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure) und 1 % BSA DMEM-HEPES: DMEM mit 20 mM HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure) 3 % Paraformaldehyd in PBS (frisch herstellen) 0,1 % Triton X100 in PBS PBS, phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung Fluorochrommarkierte Konjugate: z. B. Alexa Fluor ® 568 (A21090 molecular probes, lifetechnologies, 4 mole dye/mole). Verdünnung der Konjugate siehe unten. Eindeckmedium (PBS : Glycerin 1 : 9 [Vol : Vol]) DAPI (40,60-diamidino-2-phenylindole dichloride): DAPI-Lösung 500 ng/mL (alternativ300 ng/mL): Stammlösung: 1 mg/mL auf 1:100 verdünnen ergibt 10 µg/mL davon 150µL [10 µg/mL] + 2850 µL Aqua bidest, ergibt 500 ng/mL. Verdünnen der Patienten- und Kontrollseren in DMEM-HEPES-BSA-Puffer. Ausgangsverdünnungfür Patientenseren beträgt in der Regel 1: 20 (25 µL Serum und 475 µL Puffer).In die Kavitäten der Zellkulturplatten werden je 500 µL der Serumverdünnungen eingefüllt.Verdünnungen der Kontrollseren sind individuell zu ermitteln. Verdünnen der Konjugate in DMEM-HEPES-BSA-Puffer. Es empfiehlt sich die Verwendungvon Alexa Fluor ® 568 markierten Sekundärantikörpern. Die geeigneten Konjugatverdünnungenwerden durch Schachbretttitration ermittelt. Als Faustregel für anti-Human-IgG, konjugiert mit Alexa Fluor ® 568 (Invitrogen, Molecular Probes), kann eineVerdünnung von 1: 500 - 1:750 gelten. Die Kavitäten der Kulturplatten werden mit je 500µL der Konjugatverdünnungen befüllt (6 mL Konjugatverdünnung für 12 Deckglaskulturen).Die Auswahl der zu verwendenden Konjugate ist abhängig von der fluoreszenzoptischenAusstattung der verwendeten Mikroskope. Säubern von Objektträgern mit 100 % Ethanol und beschriften. Sie dienen als Unterlagefür die Deckglaskuluren.Testablauf Nicht permeabilisierte Zellen. Alle Reaktionsschritte erfolgen bei Raumtemperatur mitauf Raumtemperatur äquilibrierten Reagenzien.1. Absaugen des alten Kulturmediums.2. 2-mal waschen mit je 500 µL DMEM-HEPES-BSA.3. 60 Minuten inkubieren mit je 500 µL der Patienten- oder Kontrollserumverdünnungen.4. 3-mal waschen mit je 1 mL DMEM-HEPES und sofort danach.5. 15 Minuten fixieren mit 3% Paraforformaldehyd.6. 3-mal waschen mit je 1 mL PBS.7. 45 Minuten inkubieren mit je 500 µL der entsprechenden Konjugatverdünnungen.8. 3-mal waschen mit je 1 mL PBS.© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 7 13.05.2013

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen Membranproteine9. 15 - 20 µL Eindeckmedium auf die gereinigten und beschrifteten Objektträger tropfen10. Deckglas vorsichtig aus der Kavität entnehmen und mit der zellbewachsenen Seite nachunten auf dem Objektträger positionieren.11. Präparate bis zum Mikroskopieren lichtgeschützt bei 4 °C lagern.DAPI-Färbung der ZellkerneDie Gegenfärbung mit DAPI erfolgt nach Reaktionsschritt 8.8a. je 500 µL DAPI-Lösung zugegeben und 10 Minuten inkubieren.8b. 3-mal waschen mit je 1 mL PBS Protokoll für permeabilisierte und denaturierte ZellenDie Permeabilisierung der Zellmembran mit Triton X-100 und die Denaturierung und Fixierungder Proteine durch Paraformaldehyd kann je nach Fragestellung entweder zu Beginndes indirekten Immunfluoreszenztests oder während des Testablaufs (siehe oben) vor derInkubation der Zellpräparate mit den fluorochrommarkierten Konjugaten erfolgen. Sie dienender Freilegung solcher Epitope, die auf vitalen Zellen konformationsbedingt nicht fürAntikörper akzessibel sind.1. Absaugen des alten Kulturmediums.2. 3-mal waschen mit je 1 mL DMEM-HEPES.3. 15 Minuten fixieren mit 3% Paraforformaldehyd.4. 3-mal waschen mit je 1 mL PBS.5. 5 Minuten permeabilisieren mit je 1 mL 0,1 % Triton X100-PBS.6. 2-mal waschen mit je 1 mL PBS.7. 60 Minuten inkubieren mit je 500 µL der Patienten- oder Kontrollserumverdünnungen beiRaumtemperatur.8. 3-mal waschen mit je 1 mL DMEM-HEPES-BSA-Puffer.9. 45 Minuten inkubieren mit je 500 µL der entsprechenden Konjugatverdünnungen.10. 3-mal waschen mit je 1 mL PBS.11. 15 - 20 µL Eindeckmedium auf die gereinigten und beschrifteten Objektträger tropfen.12. Deckglas vorsichtig aus der Kavität entnehmen und mit der zellbewachsenen Seite nachunten auf dem Objektträger positionieren.13. Präparate bis zum Mikroskopieren lichtgeschützt bei 4 °C lagern.© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 8 13.05.2013

Autoantikörper - Autoantibodies - AutoanticorpiProf. Dr. med. Hans-Peter Seelig - Dr. rer. nat. Claudia A. SeeligKarlsruhe - MeranoIIFT - Autoantikörper gegen MembranproteineAnhang EDTA-PBSDie 0,3 mM EDTA-PBS Gebrauchslösung wird wie folgt aus den unten aufgeführten Stammlösungenhergestellt und anschließend autoklaviert. 1000 mL 1x PBS Puffer 6 mL EDTA 0,5 M, pH 8,0Stammlösungen EDTA 0,5 M, pH 8,0 enthält 18,6 g EDTA Dinatrium Salz und 2,3 g NaOH in 100 mL Aquabidest. pH kontrollieren und gegebenenfalls nachjustieren. 10x PBS Puffer enthält 1,4 M Natriumchlorid (81,82 g), 75 mM Dinatriumhydrogenphosphatp. A. (13,38 g), 20 M Kaliumdihydrogenphosphat p. A. (3,4 g) in 1 Liter Aqua bidest.Der 1x PBS Puffer wird durch 1 : 10 Verdünnung hergestellt. Poly-L-Lysin: Poly-L-Lysin Hydrobromid (Sigma P-9155, 5mg).Inhalt des Fläschchens (5 mg) mit 5 mL sterilem Aqua bidest (Millipore) oder Ampuva lösenund in Portionen zu 500 µL in sterilen Mikrotitergefäßen mit Schraubverschluss bei -20 °Clagern (Stammlösung). Die Poly-L-Lysin-Gebrauchslösung enthält 50 µg/mL Polylysin. Hierzuwerden 500 µL Stammlösung in 9,5 mL sterilem Wasser gelöst (steriles Röhrchen verwenden).© Prof. Dr. HP Seelig, Dr. CA Seelig 9 13.05.2013

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