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VeröffentlichungsnummerDE102005013712 A1
PublikationstypAnmeldung
AnmeldenummerDE200510013712
Veröffentlichungsdatum28. Sept. 2006
Eingetragen24. März 2005
Prioritätsdatum24. März 2005
Veröffentlichungsnummer0510013712, 200510013712, DE 102005013712 A1, DE 102005013712A1, DE 2005/10013712 A1, DE-A1-102005013712, DE0510013712, DE102005013712 A1, DE102005013712A1, DE2005/10013712A1, DE200510013712
AntragstellerEmc Microcollections Gmbh
Zitat exportierenBiBTeX, EndNote, RefMan
Externe Links: DPMA, Espacenet
Testvorrichtung zur Herstellung von Substanzmischungen und zur Testung dieser Substanzmischungen in zellulären Tests
DE 102005013712 A1
Zusammenfassung
Testvorrichtung zur Herstellung von Mischungen zweier Substanzen durch Diffusion und Testung der Aktivität dieser Substanzmischungen in biologischen, insbesondere zellbiologischen Tests.
Ansprüche(7)
  1. Testvorrichtung zur Herstellung von Mischungen zweier Substanzen durch Diffusion und Testung der Aktivität dieser Substanzmischungen in biologischen, insbesondere zellbiologischen Tests.
  2. Eine Testvorrichtung (1) nach Anspruch 1 gefertigt aus einem geeigneten Metall oder Kunststoff, die in einem geeigneten Behältnis (6) auf eine polymere Diffusionsmatrix (7) aufgesetzt wird, und die Testvorrichtung gekennzeichnet durch – Reservoire (2) für die Aufnahme von Substanzlösungen, gekennzeichnet durch – eine Öffnung zur Befüllung an der Oberseite und eine Öffnung an der Unterseite, die einen Kontakt mit einer Diffusionsmatrix ermöglicht. – optional eine Erweiterung (8), die das Befüllen mit Pipetten und automatisierten Pipettierrobotern erleichtern. – bevorzugt einer Anordnung an zwei benachbarten Seiten der Testkammer – einer Testkammer (3), in der Tests auf die biologische Aktivität von Substanzenmischungen durchgeführt werden – keilförmigen Kanten (4), die sich in die polymere Diffusionsmatrix schneiden und auf diese Weise ein Unterfließen der Substanzlösung unter den Rändern der Testvorrichtung verhindern, gekennzeichnet dadurch – dass die an den Reservoiren innenliegenden Kanten weniger tief in die Diffusionsmatrix schneiden als die außenliegenden Kanten – sowie optional Kerben (5), die mit einem geeigneten Griffwerkzeug das Einsetzen und Herausnehmen der Testvorrichtung aus dem Behältnis erleichtern.
  3. Eine Testvorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Testvorrichtung aus – einem Rahmen (9) gekennzeichnet – durch zu Schraublöchern (12) passenden Gewinden (11) – und einer vorstehenden Kante (15), die beim Einsetzen eines Netz (14) dieses straff zieht – und einem Einsatz (10) gekennzeichnet – durch Löcher für Schrauben (12) – und eine Auflagekante (13), auf die ein Netz (14) aufgelegt werden kann, besteht
  4. Eine Testvorrichtung nach Anspruch 1, die bevorzugt einen Außendurchmesser von unter 22 mm besitzt, so dass als Behältnis (6) eine Probenkammer einer handelsüblichen Testplatte im Format einer Microtiterplatte (ca. 127 × 86 mm) mit 12 Probenkammern verwendet werden kann.
  5. Eine Testvorrichtung nach Anspruch 2, die bevorzugt einen Außendurchmesser von unter 22 mm besitzt, so dass als Behältnis (6) eine Probenkammer einer handelsüblichen Testplatte im Format einer Microtiterplatte (ca. 127 × 86 mm) mit 12 Probenkammern verwendet werden kann.
  6. Eine Testvorrichtung nach Anspruch 6, die bevorzugt einen Außendurchmesser von unter 22 mm besitzt, so dass als Behältnis (6) eine Probenkammer einer handelsüblichen Testplatte im Format einer Microtiterplatte (ca. 127 × 86 mm) mit 12 Probenkammern verwendet werden kann.
  7. Die Durchführung eines biologischen Tests dadurch gekennzeichnet, – dass ein Netz (14), entweder unter die Testvorrichtung nach Anspruch 2 oder 3 gelegt wird oder zwischen Auflagekante (13) und Einsatz eingeklemmt wird. Im zweiten Fall sind die Maße des Netz durch die Masse des Rahmens vorgegeben im ersten Fall ist das Netz größer als die Testkammer aber kleiner als die Fläche, die durch die keilförmigen Kanten eingegrenzt wird, zu wählen und das Netz durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet ist – das Material des Netzes darf den durchzuführenden biologischen Test nicht stören – ist bevorzugt aus einem gereinigten Metall oder geeigneten Plastik, wobei das gewählte Material eine starke nicht-kovalente Wechselwirkung mit Antikörpern eingehen muss – hat bevorzugt eine Maschenweite von mehr als 1 μm und weniger als 200 μm und einen Drahtdurchmesser von mehr als 1 μm und weniger als 100 μm. – erlaubt das Auslesen eines biologischen Tests mit Fluoreszenzmikroskopie – Der biologische Test aus den folgenden Schritten besteht – das Netz mit einem Antikörper (16) belegt wird und während des Einstellens des Konzentrationsgradienten ein Kontakt mit der Diffusionsmatrix gewährleistet ist, so dass das Netz nicht trocknet – nach dem Einstellen des Diffusionsgradienten die Testkammer mit einer Zellsuspension befüllt wird, so dass sich Zellen (17), für die der Einfluss der Testsubstanz untersucht werden soll in den Maschen des Netzes absetzen und die Testsubstanzen durch Diffusion aus der Diffusionsmatrix in die Testkammer in den Zellen ihre Wirkung entfalten können – die Zellen einem Stimulus (23) ausgesetzt werden, wobei die Antwort der Zellen auf den Stimulus die Freisetzung eines Zytokins (18) ist, das durch die Antikörper (16) gebunden wird und die Testsubstanzen einen Einfluss auf die Quantität des freigesetzten Zytokins haben. – die Bindung des Zytokins an den Antikörper durch einen geeigneten Zweitantikörper (19) der mit einem Enzym (20) gekoppelt ist, dass die Umsetzung eines Substrates (21) in ein Produkt (22), gekennzeichnet dadurch • dass es mit einem Mikroskop oder Spektrometer nachgewiesen werden kann • sich bevorzugt auf dem Netz niederschlägt, – katalysiert, nachgewiesen werden kann.
Beschreibung
  • Hintergrund der Erfindung
  • [0001]
    Die Erfindung beschreibt eine Testvorrichtung zur effizienten Erzeugung und Testung von Mischungen zweier unterschiedlicher Substanzen in Hinblick auf ihre biologische Aktivität. Die Testvorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzmischungen durch Diffusion erzeugt werden. Auf diese Weise ist die Anzahl der Arbeitsschritte zur Vorbereitung des biologischen Tests unabhängig von der Zahl der Substanzmischungen, die auf ihre biologische Aktivität getestet werden sollen. Darüber hinaus ist die Testvorrichtung in handelsüblichen Trägern zur Durchführung biologischer Tests von Substanzen einsetzbar. Protokolle zum Nachweis der biologischen Aktivität von Substanzen insbesondere in zellbiologischen Tests können an die Erfordernisse der Testvorrichtung angepasst werden.
  • [0002]
    Die gezielte Steuerung komplexer zellulärer Antworten ist eines der vordringlichsten Ziele in der Wirkstoffentwicklung. Dabei ist zu berücksichtigen, dass eine spezifische zelluläre Antwort meist nicht über die Stimulation eines Rezeptors alleine, sondern erst durch die kombinierte Stimulation mehrerer unterschiedlicher Rezeptoren hervorgerufen wird. Insbesondere für therapeutisch hochrelevante Organe wie das Immunsystem ist der Mangel wirksamer und spezifischer Therapien auf die mangelnde Spezifität von Wirkstoffen zurückzuführen, die monokausal immunkompetente Zellen beeinflussen. In ähnlicher Weise ist durch die Kombination von Wirkstoffen, die in der Zelle wirken, eine spezifischere Steuerung zellulärer Vorgänge möglich. Die Herstellung und Testung von Mischungen von Substanzen, die zelluläre Antworten beeinflussen (typischerweise Wirkstoffkandidaten), und insbesondere die systematische Herstellung und Testung einer großen Zahl von Mischungen zweier Wirkstoffkandidaten, die sich jeweils in der relativen und/oder absoluten Konzentration der Wirkstoffkandidaten unterscheiden, für eine große Zahl von Kombinationen von Wirkstoffkandidaten ist jedoch mit den gegenwärtigen Technologien sehr zeit- und materialaufwändig. Zur Verfügung stehen automatisierte Pipettierer, die die Mischungen einzeln durch Pipettieren unterschiedlicher Volumina von Stammlösungen der Testsubstanzen in einzelne Probenkammern von Testplatten herstellen.
  • [0003]
    Zur systematischen Testung aller Kombinationen von z. B. 5 Substanzen, wobei für jede Kombination z. B. 100 verschiedene Mischungsverhältnisse zu untersuchen sind, sind 5 × 4 × 3 × 2 × 198 Pipettierschritte zur Herstellung aller Mischungen mindestens erforderlich (für jedes Array von 10 × 10 Mischungen 2 × 99, da in je einer Probe eine Substanz in reiner Form vorliegt. D. h. es sind 23760 Pipettierschritte erforderlich und 12000 Probenkammern (es ist zu berücksichtigen, dass im Hinblick auf die Entwicklung von Wirkstoffkombinationen die Testung von nur 5 Substanzen an der unteren Grenze der in der Praxis durchzuführenden Tests liegt). Zur Durchführung einer derart großen Zahl von biologischen Tests wird unweigerlich eine Miniaturisierung einzelner Probenkammern angestrebt werden. So stehen für die biologische Testung von Substanzen z. B. Microtiterplatten mit 1536 Probenkammern zur Verfügung. Aufgrund der kleinen Volumina, die in diese Probenkammern pipettiert werden und aufgrund des ungünstigen Oberfläche zu Volumenverhältnisses, ist insbesondere die Durchführung von zellbiologischen Tests in diesen Microtiterplatten nur eingeschränkt möglich.
  • [0004]
    Die hier beschriebene Testvorrichtung zur Herstellung und Testung von Substanzmischungen und Testung dieser Mischungen in zellulären Tests löst daher sowohl das Problem der enormen Zunahme erforderlicher Pipettierschritte bei Zunahme der zu testenden Substanzen und ihrer Mischungen als auch das Problem des ungünstigen Oberfläche zu Volumenverhältnisses, das bei der bislang üblichen Miniaturisierung biologischer Tests entsteht.
  • Inhalt der Erfindung
  • [0005]
    Die Erfindung löst die oben genannten Probleme, indem die Substanzmischungen durch Diffusion hergestellt werden. Auf diese Weise reduziert sich die Anzahl der erforderlichen Pipettierschritte auf die Zahl der zu testenden Substanzkombinationen. Es sind keine Pipettierschritte zur Herstellung von Mischungen, in denen die Substanzen einer Kombination in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen, erforderlich. Für das oben genannte Beispiel bedeutet dies, dass anstelle von 23760 Pipettierschritten nur 120 Pipettierschritte erforderlich sind.
  • [0006]
    Durch Diffusion liegen die Substanzen in Konzentrationsgradienten vor, die bei einer Diffusionsstrecke von 1 cm bis zu 3 Größenordnungen an Konzentrationen abdecken. Die Testvorrichtung stellt in ihren wesentlichen Merkmalen Reservoire für die Aufnahme von Testsubstanzen und eine Testkammer zur Verfügung. Die Reservoire liegen bevorzugt in an zwei benachbarten Seiten der Testkammer. Die Form der Diffusiongradienten ist von der offenen Kontaktfläche der Reservoire mit der Diffusionsmatrix und der Anordnung relativ zur Testkammer abhängig. In der Testkammer werden geeignete Nachweise zur Untersuchung der biologischen Aktivität der Substanzmischungen durchgeführt. Die Durchführung des Tests für alle Mischungsverhältnisse einer Substanzkombination in einer Testkammer löst das oben genannte Problem des ungünstigen Oberfläche zu Volumen Verhältnisses bei der Miniaturisierung von biologischen Tests nach dem Stand der Technik. Wie in Ausführungsbeispiel 3 dargelegt wird, lassen sich etablierte biologische Nachweisverfahren an die Anforderungen der hier beschriebenen Testvorrichtung anpassen.
  • [0007]
    Die Testvorrichtung wird wie in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen beschrieben, typischerweise auf eine Diffusionsmatrix aufgesetzt. Wesentliche Aufgabe der Diffusionsmatrix ist Vermeidung von Konvektion zur Gewährleistung der Entstehung von Konzentrationsgradienten durch Diffusion. Ein geeignetes Material zur Herstellung der Diffusionsmatrix für den Einsatz in biologischen Tests ist z. B. Agarose der Konzentration von 1–4%. Alternativ zu Gelen und Polymeren können aber auch feine Netz verwendet werden, sofern durch Temperatur- und Feuchtigkeitskonstanz während der Herstellung des Diffusionsgradienten Konvektion ausreichend vermieden werden kann. Netz anstelle von Gelen und Polymeren sind z. B. für die Diffusion von großen Molekülen wie z. B. Antikörpern vorteilhaft oder wenn in die Diffusionsmatrix Partikel, z. B. Nano- und Mikropartikel eingelagert werden, die nach einer Immobilisierung der Substanzen auf diesen Partikeln für eine weitere Testung z. B. mit einem Kapillarnetz der Diffusionsmatrix entnommen werden sollen.
  • [0008]
    Die Konzentrationen der Testsubstanzen an den einzelnen Orten der Diffusionsmatrix werden bevorzugt über Simulationen oder Zusatz fluoreszent markierter Referenzsubstanzen mit sehr ähnlichen Diffusionseigenschaften ermittelt.
  • [0009]
    Biologische Tests werden, wie z. B. in Ausführungsbeispiel 3 beschrieben, bevorzugt in der Testkammer durchgeführt. Auf diese Weise kann das Ergebnis des Tests an einem Ort direkt einer Substanzmischung zugeordnet werden. Die Anzahl der individuellen Testergebnisse ist allein durch die räumliche Auflösung des Instrumentes, mit dem das Testergebnis ausgelesen wird, gegeben. Besteht das Detektionsprinzip in der Bildung eines fluoreszenten Niederschlags, so kann der Test z. B. mit einem Fluoreszenzmikroskop mit digitaler CCD Kamera ausgelesen werden. In diesem Fall können aus einem Test tausende von Datenpunkten generiert werden.
  • [0010]
    1. Aufbau der Testvorrichtung zur Herstellung und Testung von Substanzmischungen gemäß Ausführungsbeispiel 1
  • [0011]
    2. Aufbau der Testvorrichtung zur Herstellung und Testung von Substanzmischungen gemäß Ausführungsbeispiel 2.
  • [0012]
    3. Darstellung der zusammengesetzten Testvorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel 2 mit eingelegtem Netz
  • [0013]
    4. Schematische Darstellung der Durchführung eines Sandwich-ELISA-artigen Nachweises in der Testvorrichtung
  • Ausführungsbeispiel 1: Testvorrichtung zur Erzeugung und Testung von Substanzmischungen.
  • [0014]
    Dieses Ausführungsbeispiel beschreibt die Testvorrichtung zur Erzeugung und Testung von Substanzmischungen in einer einfachen. Form. Die äußeren Dimensionen und die Bauhöhe der Testvorrichtung (1) sind bevorzugt kompatibel mit dem Einsatz der Testvorrichtung in handelsüblichen Testplatten (6) mit 12 Probenkammern (12-well ELISA-Platten).
  • [0015]
    Probenreservoire (2) dienen der Aufnahme von Lösungen der Testsubstanzen, die durch Diffusion die Konzentrationsgradienten bilden. Um die manuelle oder automatisierte Befüllung zu erleichtern können die Reservoire über Ausbuchtungen (8) verfügen. In der Testkammer (3) werden die Lösungen eingefüllt, die dem Nachweis der Aktivität der Testsubstanzen dienen. Dies kann z. B. eine Zellsuspension sein. Kerben (5) erleichtern das Herausheben der Testvorrichtung aus den Probenkammern z. B. mit einer Uhrmacherpinzette. Die Zähne (4) verhindern zum einen ein Unterfließen der Testlösung unter den Rändern der Reservoire bei nicht befüllter Testkammer durch hydrostatischen Druck und stellen sicher, dass Testsubstanz aus den Reservoiren nur durch Diffusion in die Diffusionsmatrix (7) gelangt. Zum anderen verankern sie die Halterung in der Diffusionsmatrix.
  • Ausführungsbeispiel 2: Testvorrichtung zur Erzeugung von Substanzmischungen und Durchführung von biologischen Tests mit, auf einem Netz immobilisierten, Probenmolekülen
  • [0016]
    Bei diesem Ausführungsbeispiel besteht die Testvorrichtung aus einem äußerem Rahmen (9) und einem Einsatz (10). Beide können durch Einsetzen von Schrauben in die Schraublöcher (12) über die Gewinde (11) verschraubt werden. Zwischen äußeren Rahmen und Einsatz kann ein Netz (14) eingelegt werden. Vorstehende Kanten (15) spannen das Netz in dem Rahmen auf. Eine Verschraubung ist bei einer Fertigung der Bauteile aus Metall eine bevorzugte Realisierung. Bei einer Fertigung aus einem geeigneten Kunststoff ist auch ein festes Eindrücken des Einsatzes in den Rahmen denkbar. Das Netz ist so beschaffen, dass Proteine, bevorzugt Antikörper, absorbieren können. Z. B. erfüllen Netze aus Gewebsstahl, die für den Siebdruck und als Filter eingesetzt werden, diese Anforderung. Diese Netze verfügen in einer bevorzugten Realisierung über eine Drahtdicke von 50 μm und einer Maschenweite von 100 μm. Vor dem Einsatz in der Testvorrichtung werden diese Netze gereinigt. Dies kann z. B. durch Waschen mit Aceton und Ethanol oder durch ein Sauerstoffplasma geschehen.
  • Ausführungsbeispiel 3: Testung von Substanzmischungen in Hinblick auf die Beeinflussung der Zytokinexpression in T-Lymphozyten
  • [0017]
    Ein Einsatz der Testvorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel 2 in einer bevorzugten Realisierung zur Durchführung eines zellulären Assays wird nachfolgend beschrieben. In diesem zellulären Assay wird die Wirkung von Substanzmischungen auf die Zytokinexpression von Zellen, z. B. T-Lymphozyten erfasst. Eine Anpassung anderer Assays (z. B. Expression von Reportergenen in Zellen) an das Format der Testvorrichtung ist möglich. Auch für solche zellulären Assays ist der Einsatz eines Netzes sinnvoll, da das Netz die Bewegung von Zellen durch Flüssigkeitsströmungen verhindert. Auf diese Weise kann eine zelluläre Antwort eindeutig einer Position des Konzentrationsgradienten zugeordnet werden. Kann diese Bewegung vermieden, werden so ist die Durchführung eines solchen Reporterassays auch mit einer Testvorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel 1 möglich.
  • [0018]
    In einer Realisierung wird in eine Probenkammer einer handelsüblichen Polystyrol 12-Loch Testplatte (6) eine Agaroselösung als Diffusionsmatrix (7) eingegossen und durch Abkühlen geliert. Für die Dimensionen einer Testvorrichtung, die in einer 12-Loch Testplatte verwendet werden kann, ist das Volumen des Gels bevorzugt 3 ml. Die Konzentration der Agarose ist bevorzugt 1–4% (w/v). Je größer das Molekulargewicht der Testsubstanzen ist, umso geringer wird die bevorzugte Konzentration der eingesetzten Agarose sein. Neben Agarose können weitere gelierende und vernetzte Polymere bildende Materialien eingesetzt werden. Auch der Einsatz feinmaschiger Gitter ist denkbar. Wichtig ist, dass die Störung der Bildung der Gradienten durch Diffusion infolge von Konvektion verhindert wird.
  • [0019]
    Die Testvorrichtung wird in die Probenkammer eingesetzt und leicht angedrückt. Anschließend werden die Testsubstanzen in die Reservoire für Testsubstanz (2) eingefüllt (5 bis 50 μl). Durch den leichten Druck schneiden die Zähne (4) in die Agarose. Vor dem Einsatz der Testvorrichtung in die Probenkammer wird das Netz mit einer Lösung inkubiert, die einen Antikörper (16) enthält. Dieser Antikörper ist gegen Substanzen gerichtet, die von Zellen im Zusammenhang mit dem durch den Assay zu untersuchenden Signaltransduktionsweg abgegeben werden. In dem hier beschriebenen Fall ist diese Substanz ein Zytokin (18). Der Antikörper dient der Bindung der Zytokine für einen nachfolgenden Zytokinnachweis im Rahmen eines sogenannten Sandwich-ELISA. Durch die Fixierung der Antikörper auf dem Netz spiegelt die Menge des gebundenen Zytokins die zelluläre Antwort in Nachbarschaft.
  • [0020]
    Durch Diffusion entstehen in der Diffusionsmatrix Konzentrationsgradienten der Testsubstanzen und durch Überlagerung der Gradienten der beiden Testsubstanzen unterschiedliche Mischungen der Testsubstanzen in der Diffusionsmatrix. Die von links nach rechts weisenden spitzen Dreiecke deuten den Konzentrationsgradienten der Testsubstanz an. Die Dauer, die zur Einstellung der Gradienten gewartet wird, hängt (i) von der Konzentration der Agaroselösung, (ii) der Größe der Testmoleküle, (iii) der Temperatur und (iv) dem zu testenden Konzentrationsgradienten ab. Bei einer Konzentration des Agarosegels von 4%, einer Inkubationstemperatur von 20°C und Testmolekülen von einem Molekulargewicht von 500 Da beträgt die Inkubationsdauer typischer weise 16–40 h. Die Zeit zur Durchführung des Testes muss nach Möglichkeit kurz gegenüber der Zeit sein, die zur Einstellung des Konzentrationsgradienten verstrichen ist. Dies ist z. B. bei einer Zeit für die Einstellung des Konzentrationsgradienten von 12 h und der Zeit für die Durchführung des Tests von 1 h gegeben. In einzelnen Fällen wird es erforderlich sein, die Zellen für längere Zeit in der Testkammer zu belassen, z. B. um zur Expression von ausreichend Zytokinen Zeit zu geben. In diesem Fall ist davon auszugehen, dass sich die Konzentration an Testsubstanz während der Testdurchführung ändert. Da für eine zelluläre Antwort häufig die Konzentration eines Inhibitors zu Beginn einer Zellantwort von Bedeutung ist, ist eine Interpretation der Ergebnisse also dennoch möglich.
  • [0021]
    Nach Einstellung der Konzentrationsgradienten wird die Testkammer (3) mit einer Zellsuspension befüllt. Typischerweise wird die Füllhöhe um einige 100 μm über der Oberkante der Netze liegen. Die Zellen sinken ab und setzen sich in den Maschen des Netz auf der Agarose ab. Die Testsubstanzen treten aus der Agaroseschicht in die darüber befindliche Zellsuspension aus. Die Zellen werden nach einer geeigneten Wartezeit, die dem Eintreten der Testsubstanzen in die Zellen dient stimuliert (23). Diese Stimulation erfolgt z. B. durch Aufsprühen einer Lösung, die einen geeigneten Stimulus enthält, in Form eines Aerosols. Infolge der Stimulation exprimieren die Zellen das Zytokin. Das Ausmaß der Zytokinexpression wird durch die Testsubstanzen beeinflusst. Die Zytokine, die von den Zellen abgegeben werden, werden lokal durch die am Netz befindlichen Antikörper gebunden.
  • [0022]
    Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die Testvorrichtung der Probenkammer entnommen, gewaschen und die an die Antikörper gebundenen Zytokine nachgewiesen. Dies erfolgt gemäß der gängigen Praxis bei der Durchführung eines Sandwich-ELISA durch Inkubation mit einem zweiten, gegen das Zytokin gerichteten Antikörper (19). Der Antikörper kann entweder direkt mit einem Enzym konjugiert sein (20), das eine mit einer geeigneten Auslesemethode detektierbare Umsetzung eines Präzipitat (22)-bildendes Substrates (21) katalysiert, oder der Antikörper kann biotinyliert sein und das Enzym wird in Streptavidin-gekoppelter Form zugegeben oder es wird ein Enzym-gekoppelter Zweitantikörper eingesetzt. Ein geeignetes Beispiel ist ein Sekundärantikörper, der mit dem Enzym alkalischer Phosphatase konjugiert ist. Für dieses Enzym steht ein Substrat ELF97 (Molecular Probes, Invitrogen Technologies, Technologiepark Karlsruhe, Emmy-Noether Straße 10, 76131 Karlsruhe) zur Verfügung, das durch die enzymatische Umsetzung durch Phosphatase ein unlösliches, fluoreszentes Präzipitat bildet, das auf dem Netz abgeschieden wird. Dieses Präzipitat kann z. B. mit einem Fluoreszenzmikroskop ortsaufgelöst detektiert werden. Die Intensität der Fluoreszenz auf einer Position des Netzes korreliert positiv mit der Menge des dort von den Zellen abgeschiedenen Zytokins. Auf diese Weise kann über die Fluoreszenzmikroskopie des Netzes auf den Effekt der Testsubstanzen auf die Zytokinexpression rückgeschlossen werden.
Referenziert von
Zitiert von PatentEingetragen Veröffentlichungsdatum Antragsteller Titel
CN103317505A *14. Juli 201325. Sept. 2013林佳杰一种可变形软体机器人
CN103317505B *14. Juli 201323. März 2016林佳杰一种可变形软体机器人
CN103434582A *11. Aug. 201311. Dez. 2013林佳杰一种可变形多用途软体机器人
CN103434582B *11. Aug. 201318. Nov. 2015林佳杰一种可变形多用途软体机器人
Klassifizierungen
Internationale KlassifikationB01L3/00, B01J19/00, C12Q1/00, C12Q1/02, G01N33/48, B81B1/00
UnternehmensklassifikationB01L2400/0472, G01N33/5008, B01L2300/0867, G01N33/5047, B01L3/5027, B01F13/0059, B01F13/0093
Europäische KlassifikationB01F13/00M6I, B01L3/5027, G01N33/50D2, G01N33/50D2F2
Juristische Ereignisse
DatumCodeEreignisBeschreibung
27. Dez. 20078181Inventor (new situation)
Inventor name: ROTH, GUENTER, 72072 TUEBINGEN, DE
Inventor name: WIESMUELLER, KARL-HEINZ, 72070 TUEBINGEN, DE
28. Juni 2012R005Application deemed withdrawn due to failure to request examination
Effective date: 20120327