DE102008054313A1 - Kartusche und Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen - Google Patents

Kartusche und Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen Download PDF

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Abstract

Die erfindungsgemäße Kartusche zur Untersuchung biologischer Proben umfasst: - eine Reaktionskammer und einen in der Reaktionskammer angeordneten Biochip, - einen Einfüllstutzen, der kommunizierend mit der Reaktionskammer verbunden ist, und - einen Ausgleichsraum, der kommunizierend mit der Reaktionskammer verbunden ist, wobei die Reaktionskammer, der Ausgleichsraum und alle hiermit verbundenen Leitungen einen, bis auf am Einfüllstutzen, abgeschlossenen Raum bilden, wobei der Einfüllstutzen einen freien Durchgang von außerhalb der Kartusche zur Reaktionskammer bildet und ein Stöpsel vorgesehen ist, der formschlüssig und dicht derart im Einfüllstutzen aufgenommen wird, dass er beim Eindrücken über einen bestimmten Weg Fluid aus dem Einfüllstutzen in Richtung zur Reaktionskammer verdrängt.

Description

  • Die Erfindung betrifft eine Kartusche und eine Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen.
  • Ein Biochip weist ein in der Regel ebenflächiges Substrat mit unterschiedlichen Fängermolekülen auf, die an auf der Oberfläche des Substrates vorbestimmten Punkten, den Spots, angeordnet sind. Eine mit einer Markierung versehene Probensubstanz reagiert mit bestimmten Fängermolekülen nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip. Meistens bestehen die Fängermoleküle aus DNA-Sequenzen (siehe z. B. EP 373 203 B1 ) oder Proteinen. Derartige Biochips werden auch Arrays bzw. DNA-Arrays genannt. Die Markierungen sind oftmals Fluoreszenz-Marker. Mit einem optischen Lesegerät wird die Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Spots erfasst. Diese Intensität korreliert mit der Anzahl der mit den Fängermolekülen immobilisierten markierten Probenmoleküle.
  • Aus der WO 2005/108604 A2 geht eine beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips hervor. Diese Reaktionskammer weist eine elastische Membran auf. Auf der Membran ist ein Silizium-Biochip angeordnet. Als Heizeinrichtung ist eine Nickel-Chrom-Dünnfilm-Leiterbahn vorgesehen. Derartige Nickel-Chrom-Dünnfilm-Leiterbahnen besitzen einen hohen elektrischen Widerstand und eine dementsprechend hohe Heizleistung. Neben der Leiterbahn für die Widerstandsheizung ist eine zusätzlich Leiterbahn zur Temperaturmessung vorgesehen.
  • Bei dieser bekannten Reaktionskammer ist eine Gehäusewandung als Membran ausgebildet, damit der Biochip mittels eines Stößels gegen ein der Membran gegenüberliegendes Deckglas gedrückt werden kann. Hierdurch wird eine in der Reaktionskammer befindliche Reaktionsflüssigkeit von der Oberfläche des Biochips verdrängt und stört nicht bei der optischen Detektion. Zwischen der Membran und dem Deckglas ist eine Dichtung angeordnet. Die Probenflüssigkeit wird mittels einer Einfüllkanüle, die durch die Dichtung gestoßen wird, eingefüllt. Beim Stößeln wird mittels einer Druckausgleichskanüle überschüssige Probenflüssigkeit aus der Reaktionskammer abgeleitet.
  • In der US 5,759,846 und US 6,130,056 ist jeweils eine Reaktionskammer zur Aufnahme von biologischen Geweben beschrieben. In der Reaktionskammer befindet sich eine flexible Leiterplatte mit Elektroden. Durch Zusammendrücken des biologischen Gewebes und der flexiblen Leiterplatte kann ein elektrischer Kontakt zwischen dem biologischen Gewebe und den Elektroden der flexiblen Leiterplatte hergestellt werden, so dass an dem biologischen Gewebe unmittelbar ein elektrischer Abgriff erfolgen kann.
  • In der DE 10 2005 09 295 A1 ist eine chemische Reaktionspatrone mit mehreren Kammern beschrieben. Durch Abrollen einer Walze an der Oberfläche der Patrone können Flüssigkeiten von einer Kammer in eine weitere Kammer befördert werden. Weiterhin ist eine Metallstange vorgesehen, mit welcher Druck, Schwingung, Hitze, Kühle oder ähnliches auf die Patrone ausgeübt werden kann, um die chemische Reaktion in der Patrone zu beschleunigen.
  • Aus K. Shen et al. Sensors and Actuators B 105 (2005), Seiten 251–258, „A Microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology” ist es bekannt eine flexible Leiterplatte zum Heizen einer Reaktionskammer zu verwenden, die für ein PCR Verfahren vorgesehen ist. Die Reaktionskammer besteht aus einer Glasplatte, einem Rahmen und einer Kunststoffabdeckung. Auf der Innenseite der Glasplatte ist die flexible Leiterplatte entweder unmittelbar mittels einer Klebeverbindung oder mittels eines dazwischen befindlichen Kupferchips angeordnet. Aufgrund der guten thermischen Eigenschaften der flexiblen Leiterplatte wurden Heizraten von 8°C/s erzielt. Auf der flexiblen Leiterplatte ist eine Leiterbahn ausgebildet, die sowohl zum Heizen als auch zum Messen der Temperatur verwendet wird. Das Heizen erfolgt während eines „Heating state” und das Messen während eines „Sensing state„, die zeitlich versetzt ausgeführt werden.
  • In der WO 2007/051863 A2 ist eine Reaktionskammer beschrieben, in welcher ein Biochip prozessiert werden kann. Die Reaktionskammer weist zwei gegenüberliegende Wandungen auf, zwischen welchen der Biochip angeordnet ist. Eine der beiden Wandungen ist transparent ausgebildet, so dass sie sowohl für Anregungsstrahlung als auch für vom Biochip emittierte Signale transparent ist. Zumindest eine der beiden Wandungen ist derart beweglich, dass der Raum zwischen dem Biochip und der transparenten Wandung zusammendrückbar ist, wodurch die dazwischen befindliche Probenlösung verdrängt werden kann.
  • Aus der US 2004/0047769 A1 bzw. JP 2002-365299 A geht eine Tasche aus einem Kunststoffmaterial hervor, die zur Aufnahme von Blut dient. Das Blut kann für eine Untersuchung mit einem DNA-Array aufbereitet werden. Das DNA-Array ist in die Tasche integriert. Mittels Walzen wird das Blut und eine Probenlösung in der Tasche in Richtung zum DNA-Array und in einen dahinter angeordneten Abfallbereich gedrängt. Das DNA-Array kann auf herkömmliche Weise ausgelesen werden.
  • In diesem Beutel sollen, nachdem das Blut einmal eingebracht ist, alle Reaktionen ablaufen und die Reaktionen ausgeführt werden können, ohne dass das Blut und die darin befindlichen Lösungen aus dem Beutel mit der Umwelt in Kontakt gelangen. Hierdurch kann eine Kontamination mit dem eventuell infizierten Blut vermieden werden.
  • In der US 6,569,674 B1 ist eine Vorrichtung zum Durchführen biologischer Reaktionen beschrieben. Ein Reaktionsraum weist ein Mikroskop-Glasplättchen auf, das von einer flexiblen Folie abgedeckt wird. In dem Glasplättchen ist ein erster und ein zweiter Durchgang ausgebildet, die in den Reaktionsraum zwischen dem Substrat und der flexiblen Folie führen. Die flexible Folie ist mittels eines Klebemittels auf dem Substrat befestigt. Weiterhin ist in diesem Patent ein Probenaufbereitungschip definiert, der in Kontakt mit dem Substrat steht und der wiederum eine Öffnung hat, die zur Öffnung des Substrates ausgebildet ist. Die Folie kann mittels einer Walze beaufschlagt werden.
  • In der noch nicht veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung PCT/EP2007/010298 ist eine Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen beschrieben. Diese umfasst eine Reaktionskammer zur Aufnahme eines Biochips. Die Reaktionskammer weist zumindest ein transparentes Fenster auf, damit Anregungslicht von außen auf den Biochip gestrahlt werden kann und Fluoressenzlicht vom Biochip nach außen zu einer Messeinrichtung abgestrahlt werden kann. Es ist eine Membran vorgesehen, die zumindest eine Wandung der Reaktionskammer bildet und elastisch ausgebildet ist, so dass das Fenster und der Biochip aneinander drückbar sind, um dazwischen befindliche Probenlösung zu verdrängen. In einer Befüllöffnung ist ein Rückschlagventil angeordnet, durch das das Probenmaterial der Reaktionskammer zugeführt werden kann.
  • Bei dieser Vorrichtung ist von Nachteil, dass beim Befüllen eine relativ genau bemessenes Probenvolumen in die Kartusche eingebracht werden muss, damit sich der gewünschte Druck einstellt. Es wird eine sogenannte „positve displacement Pipette” benötigt, die in der Lage ist den nötigen Überdruck für das Rückschlagventil aufzubauen. Nach dem Absetzen der Pipette bleibt prinzipbedingt immer ein Rest Probe vor dem Rückschlagventil stehen, was zu einer Kontamination führen kann. Der Aufbau dieser Vorrichtung ist relativ kompliziert.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Kartusche zur Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen zu schaffen, die einfach zu befüllen ist so dass keine Kontaminationsgefahr durch austretende Probenlösung verursacht wird und zudem möglichst optimale Reaktionsbedingungen in der Reaktionskammer eingestellt werden.
  • Die Aufgabe wird durch eine Kartusche mit dem Merkmal des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
  • Die erfindungsgemäße Kartusche und Untersuchung biologischer Proben umfasst:
    • – eine Reaktionskammer und einen in der Reaktionskammer angeordneten Biochip,
    • – einen Einfüllstutzen der kommunizierend mit der Reaktionskammer verbunden ist, und
    • – einen Ausgleichsraum, der kommunizierend mit der Reaktionskammer verbunden ist, wobei die Reaktionskammer, der Ausgleichsraum und alle hiermit verbundenen Leitungen einen bis auf am Einfüllstutzen abgeschlossenen Raum bilden, wobei der Einfüllstutzen einen freien Durchgang von außerhalb der Kartusche zur Reaktionskammer bildet, und ein Stöpsel vorgesehen ist, der formschlüssig und dicht derart im Einfüllstutzen aufgenommen wird, dass er beim Eindrücken über einen bestimmten Weg Fluid aus dem Einfüllstutzen in Richtung zur Reaktionskammer verdrängt.
  • Hierdurch werden folgende Vorteile erzielt:
    • 1. Da der Einfüllstutzen offen ist kann die Probenlösung z. B. mit einer Standardpipette einfach eingefüllt werden. Es ist keine Spritze nötig, um eine Membran zu durchstechen. Es muss kein Druck aufgebaut werden, um ein Ventil zu durchdringen. Es gibt beim Einfüllen keine Kraft bzw. keinen Gegendruck der überwunden werden muss, um die Probe in die Kartusche einzubringen. Das Einfüllen erfolgt somit ohne Druck. Es besteht keine Gefahr, dass ein Teil der Proben beim Einfüllen verschüttet wird.
    • 2. Die Probenlösung wird beim Eindrücken des Stöpsels unter Druck gesetzt. Hierdurch steigt der Siedepunkt. Dies hat zur Folge, dass selbst bei einer Erwärmung auf Temperaturen im Bereich von etwa 100°C in der Probenlösung keine Gasblasen entstehen, die die Messungen beeinträchtigen könnten.
    • 3. Die Luft im Ausgleichsraum wirkt auf die Probenlösung wie ein elastisches Federelement, das ein weiteres Verdrängen von Probenlösung erlaubt, wobei die durch die Luft auf die Probenlösung ausgeübte Rückstellkraft klein ist. Somit ist auch die Kraft, mit welcher eine transparente flexible Folie, die eine Seite der Reaktionskammer begrenzt, beaufschlagt werden muss, um die Probenlösung zu verdrängen, klein im Vergleich zu herkömmlichen Reaktionskammern mit Membranen.
    • 4. Diese Rückstellkraft macht den Vorgang des Verdrängens der fluoreszierenden Probenlösung reversibel, wenn die Kraft mit der die Folie beaufschlagt wird, variiert wird. Dies ermöglicht eine realtime PCR und die Messung einer Schmelzkurve.
    • 5. Durch das dichte Verschließen der Kartusche mit dem Stöpsel ist eine Kontaminationsgefahr für die Umwelt ausgeschlossen.
  • Der offene Einfüllstutzen ist über Leitungen kommunizierend mit der Reaktionskammer, einer Füllstandsanzeige und dem Ausgleichsraum verbunden, sodass vor dem Befüllen in allen Hohlräumen der Kartusche Umgebungsdruck respektive Normaldruck herrscht. Beim Einfüllen der Probenflüssigkeit füllt sich der Einfüllstutzen auf. Durch das Hineindrücken des Stöpsels wird die Luft in der Kartusche komprimiert. Da Probenraum, Ausgleichsraum und Einfüllstutzen kommunizierend sind, wird der Druck im gesamten Gefäßsystem simultan ausgeglichen. Die Volumina sind dabei so dimensioniert, dass die Reaktionskammer vollständig mit Probenflüssigkeit gefüllt und ein Innenüberdruck von 0,3–0,5 bar und vorzugsweise etwa 0,4 bar erzeugt wird.
  • Die Vorrichtung weist einen offenen Einfüllstutzen auf. Hierdurch ist es möglich, die Probenlösung mittels einer Pipette einzufüllen. Es ist nicht notwendig, eine Kanüle zu verwenden, mit welcher, wie es bei herkömmlichen derartigen Vorrichtungen der Fall ist, eine Dichtung durchstochen wird oder die Probenflüssigkeit unter Druck durch ein Ventil zu pressen.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der dem Biochip gegenüberliegende Bereich der Kartusche als transparente Folie ausgebildet. Die flexible transparente Folie dient als Fenster für die optischen Messungen der Proben lösung. Bei dieser Ausgestaltung ist vorteilhaft, dass der Biochip selbst nicht in der Reaktionskammer bewegt werden muss.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Seite der Reaktionskammer von einer Leiterplatte begrenzt. Der Biochip ist unmittelbar auf der Leiterplatte angeordnet. In dieser Leiterplatte können Heiz-/Messstrukturen integriert sein. Eine solche Leiterplatte dient zum Heizen und Messen der Probenlösung.
  • In der Kartusche ist ein Befüllleitungsabschnitt vorgesehen, der sich vom Einfüllstutzen um die Reaktionskammer herum erstreckt und in einen vom Einfüllstutzen entfernt angeordneten Randbereich der Reaktionskammer mündet.
  • Die Kartusche wird mit dem offnen Einfüllstutzen nach oben weisend angeordnet befällt. Der Stöpsel wird in den Einfüllstutzen eingedrückt, so dass die Probenflüssigkeit in die Reaktionskammer gedrängt wird und diese von unten nach oben befüllt. Luft wird dabei aus der Reaktionskammer in einen der Reaktionskammer nachgeschalteten Ausgleichsraum verdrängt. Dies hat den Vorteil, dass die Luft aus der Reaktionskammer vollständig in den Ausgleichsraum verdrängt wird.
  • Die erfindungsgemäße Kartusche wird beim Abtasten mit dem Einfüllstutzen nach unten weisend in einer Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben angeordnet. Beim Durchführen einer optischen Abtastung der Reaktionskammer wird in der Abtastkammer ein Druck von vorzugsweise 1 bar bis 4 bar derart erzeugt, dass sich die Folie an den Biochip anlegt und die Probenflüssigkeit aus der Reaktionskammer in Richtung zum Ausgleichraum verdrängt wird, wobei eine Luftblase über der Probenflüssigkeit im Ausgleichsraum verbleibt.
  • Bei der Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben wird, bei den Arbeitsschritten bei denen kein optisches Abtasten erfolgt und die Reaktionskammer (22) erhitzt wird, in einer Abtastkammer der Vorrichtung ein Druck erzeugt, der in etwa dem Innendruck in der Reaktionskammer entspricht.
  • Die Kartusche ist vorzugsweise aus Polypropylen (PP)ausgebildet. Dies ist ein inertes Kunststoffmaterial, das keine zusätzliche Passivierung von Oberflächen erfordert, um in der Reaktionskammer temperaturgesteuerte biologische Reaktionen (insbesondere das PCR-Verfahren) durchführen zu können. Die Kartusche kann aber auch aus einem anderen geeigneten Kunststoff wie z. B. Cycloolefincopolymer (COC) oder einem anderen geeigneten Material ausgebildet sein.
  • Die transparente Kunststofffolie kann an ihrer zum Biochip weisenden Seite mit einer Adhäsions- oder Klebeschicht versehen sein, die aktiviert werden kann, wenn sie mit der Probenlösung in Kontakt kommt. Beim Andrücken der Kunststofffolie an den Biochip haftet diese auf dem Biochip, wodurch ein Eintreten von Probenlösung zwischen dem Biochip und der Kunststofffolie verhindert wird. Diese Adhäsions- oder Klebeschicht ist vorzugsweise an dem Bereich der Folie vorgesehen, der nicht mit den die Spots des Biochips enthaltenden Bereich in Kontakt tritt. Die Adhäsions- oder Klebeschicht ist somit umlaufend um den aktiven Bereich des Biochips angeordnet.
  • Die Erfindung wird anhand einem in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispiel erläutert. Die Zeichnungen zeigen schematisch in:
  • 1 eine perspektivische Ansicht eines Gehäuses einer erfindungsgemäßen Kartusche,
  • 2 eine Ansicht des Gehäuses aus 1 in einer Seitenansicht im Teilschnitt zusammen mit einem Stöpsel,
  • 3 eine erfindungsgemäße Kartusche, die eine Schnittdarstellung entsprechend der am Gehäuse in 2 eingezeichneten Linie A-A zeigt,
  • 4 einen Schnitt durch die Kartusche und einer Abtastkammer,
  • 5 den Befüllvorgang der Kartusche mit nicht aufgesetztem Stöpsel,
  • 6 den Befüllvorgang der Kartusche eingedrücktem Stöpsel,
  • 7 eine Leiterplatte der erfindungsgemäßen Kartusche mit einer Heiz-/Messstruktur,
  • 8 schematisch einen Schnitt durch die Reaktionskammer und die Abtastkammer, wobei eine Folie auf einen Biochip anliegt,
  • 9 die Abtastkammer aus 4 und eine daran angeschlossen Druckluftversorgungsquelle in einer Schnittdarstellung, und
  • 10 einen Schnitt durch den Stöpsel und einen Einfüllstutzen der Kartusche.
  • Anhand der 1–4 wird eine Kartusche 1 mit einem Biochip 30 beschrieben.
  • Die Kartusche 1 weist ein, z. B. mittels Spritzguss aus Kunststoff hergestelltes längliches in etwa schalen- bzw. wannenartig ausgebildetes Gehäuse 2 auf. Das Gehäuse 2 umfasst eine Basiswandung 3 und eine umlaufende Seitenwandung 4 mit zwei Längsseiten 5 und zwei Stirnseiten 6. Die Seite des Gehäuses 2 an der die Seitenwandung 4 angeordnet ist, wird als Innenseite 7 bezeichnet.
  • An der von den Seitenwandungen 4 abgewandten Seite der Basiswandung 3 ist an dem Gehäuse 2 eine Leiterplatte 8 befestigt. Diese Seite des Gehäuses 2 wird als Außenseite 9 bezeichnet.
  • An einer der Stirnseiten 6 der Kartusche 1 ist ein rohrförmig ausgebildeter sich in Längsrichtung erstreckender Abschnitt als Einfüllstutzen 10 ausgebildet. Der Einfüllstutzen 10 ist einstückig an dem Gehäuse 2 angeformt.
  • Der Einfüllstutzen 10 weist einen Einfüllabschnitt 11 und einen Verdichtungsabschnitt 12 auf, wobei der Einfüllabschnitt 11 benachbart zum freien Rand des Einfüllstutzens 10 angeordnet ist und der Verdichtungsabschnitt 12 sich zwischen dem Einfüllabschnitt 11 und dem übrigen Körper der Kartusche 1 befindet (2).
  • Der Einfüllabschnitt 11 weist eine größere lichte Weite als der Verdichtungsabschnitt 12 auf. Als Übergang zwischen dem Einfüllabschnitt 11 und dem Verdichtungsabschnitt 12 ist eine Fase 13 vorgesehen. Dieser angefaste Abschnitt 12 weist in etwa mittig einen Dichtpunkt 14 auf, ab dem ein Stöpsel 15 den Einfüllstutzen 10 dicht verschließt (3).
  • Der Verdichtungsabschnitt 12 ist ein zylindrischer Abschnitt 16 mit kreisförmigem Querschnitt, der in einen trichterförmigen Abschnitt 17 übergeht, an dessen Ende eine Befüllöffnung 18 ausgebildet ist. Die Befüllöffnung 18 ist über einen Befüllleitungsabschnitt 20 mit einer Reaktionskammer 22 verbunden.
  • Im zylindrischen Abschnitt 16 des Verdichtungsabschnitts 12 kann eine Einfüllanzeige vorgesehen sein. Die Einfüllanzeige 19 kann als innenseitig oder außenseitig am Einfüllstutzen 10 angebrachte Markierung bzw. als Eichstrich ausgebildet sein. Es kann auch ein Sichtfenster oder ein anderes geeignetes Mittel im Einfüllstutzen 10 vorgesehen sein, um die in den Einfüllstutzen 10 eingebrachte Probenmenge zu kontrollieren.
  • Von der Befüllöffnung 18 aus erstreckt sich der Befüllleitungsabschnitt 20 in etwa senkrecht zur Basiswandung 3 und durch diese hindurch. An der Außenseite 9 der Basiswandung 3 ist der Befüllleitungsabschnitt 20 als halbseitig offene Aussparung ausgebildet, wobei die offene Seite durch die Leiterplatte 8 begrenzt ist.
  • In etwa mittig in der Basiswandung 3 ist eine rautenförmig ausgebildete Durchgangsöffnung 21 vorgesehen, die die Reaktionskammer 22 begrenzt.
  • Eine Spitze der rautenförmig ausgebildeten Durchgangsöffnung 21 weist in Richtung zum Einfüllstutzen 10 und eine gegenüberliegende Spitze der rautenförmigen Durchgangsöffnung 21 weist von dem Einfüllstutzen 10 weg.
  • Der Befüllleitungsabschnitt 20 erstreckt sich um die rautenförmige Durchgangsöffnung 21 herum und mündet in die vom Einfüllstutzen 10 weg weisende Spitze der rautenförmigen Durchgangsöffnung 21.
  • An der in Richtung Einfüllstutzen 10 orientierten Spitze der rautenförmigen Durchgangsöffnung 21 ist ein Ausgleichsleitungsabschnitt 23 angeschlossen. Der Ausgleichsleitungsabschnitt 23 ist in der Außenseite 9 der Basiswandung 3 als halbseitig offene Aussparung ausgebildet, die wiederum von der Leiterplatte 8 begrenzt ist. Der Ausgleichsleitungsabschnitt 23 erstreckt sich auf der dem Befüllleitungsabschnitt 20 gegenüberliegenden Seite der rautenförmigen Durchgangsöffnung 21 um die Durchgangsöffnung 21 herum und mündet in einer Spitze eines halbkegelförmig ausgebildeten Ausgleichsraums 24.
  • Der halbkegelförmige Ausgleichsraum 24 ist an der Unterseite 9 der Basiswandung 3 als einseitig offene Aussparung ausgebildet. Ein halbkegelförmiger Abschnitt der Basiswandung 3 wölbt sich über die Leiterplatte 8 und begrenzt den Ausgleichsraum 24, der sich bis in etwa auf die Höhe der Seitenwandungen 4 erstreckt.
  • Benachbart zur Spitze der rautenförmigen Durchgangsöffnung 21 ist im Ausgleichsleitungsabschnitt 23 eine kreisförmige Ausnehmung vorgesehen. Die Ausnehmung ist auf der Innenseite 7 der Basiswandung 3 von einer einstückig an der Basiswandung 3 angeformten transparenten Halbkugel 26 verschlossen. An die Halbkugel 26 schließt sich ein in den Ausgleichsleitungsabschnitt 23 hineinragender polierter Kegel 25 an. Die Spitze des Kegels 25 zeigt in Richtung zur Leiterplatte 8 und weist einen 90° Winkel auf. Das Kunststoffmaterial des Gehäuses 2 ist transparent und vorzugsweise durchsichtig. Die Halbkugel 26 bildet eine Linse und ist vorzugsweise an ihrer Oberfläche poliert. Die Halbkugel 26 und der Kegel 25 bilden eine Befüllanzeige 27 der Reaktionskammer 22 aus.
  • Ist die Befüllanzeige 27 nicht mit Probenlösung befüllt, weist die Halbkugel 26 aufgrund der Totalreflexion des einfallenden Lichtes im Kegel 25 eine helle Farbe auf. Ist die Befüllanzeige 27 mit Probenflüssigkeit befüllt, dann ist der Kegel 25 von Probenflüssigkeit umgeben, wodurch die Totalreflexion abgeschwächt wird. Dadurch wird die darunter angeordnete leiterplatte 8 sichtbar und die Befüllanzeige erscheint dunkel.
  • An der Innenseite 7 der Basiswandung 3 ist die Reaktionskammer 22 bzw. die Durchgangsöffnung 21 von einer flexiblen transparenten Folie 28 begrenzt. Die Folie 28 ist auf die Basiswandung 3 aufgeklebt. Die Folie 28 weist eine Dicke von in etwa 127 μm auf. Die Folie 28 ist vorzugsweise aus einem fluorierten Ethylen-Propylen-Copolymer (z. B. FEP) oder einem anderen geeigneten Kunststoff ausgebildet. Der Abstand zur Leiterplatte 8 beträgt in etwa 0,9 mm, was in etwa der Dicke der Basiswandung 3 entspricht. Die flexible transparente Folie 28 dient als Fenster für die optischen Messungen der Probenlösung.
  • Auf der Folie 28 ist im Bereich um die Durchgangsöffnung 21 eine umlaufende Dichtung 29 angeordnet.
  • Die Leiterplatte 8 bildet im Bereich der rautenförmigen Durchgangsöffnung 21 bzw. der Reaktionskammer 22 eine Begrenzungswand derselben. Im Bereich des Befüllleitungsabschnitts 20, des Ausgleichsleitungsabschnitts 23, der Befüllanzeige 27 und des Ausgleichsraums 24 schließt die Leiterplatte 8 derart dicht mit diesen Aussparungen ab, dass diese nach unten begrenzt werden und eine durchgängig kommunizierende, in sich abgeschlossene Kanalstruktur bilden.
  • Die Leiterplatte 8 enthält Kontaktflächen, ein digitales Speichermedium (z. B. ein EEPROM) und eine interne Heiz-/Messstruktur 32 die unten noch näher erläutert werden. Anstelle der Leiterplatte 8 kann zum Heizen und Kühlen auch eine Platte aus einem gut wärmeleitenden Material wie z. B. Aluminium oder Kupfer vorgesehen sein. Diese Platte kann dann von außen über eine Heiz-/Kühleinrichtung temperiert werden.
  • In etwa mittig in der Durchgangsausnehmung ist auf der Leiterplatte 8 ein Biochip 30 angeordnet. Die aktive Seite des Biochips weist in Richtung der Folie 28. Der Biochip 30 weist eine Höhe von in etwa 0,7 mm und eine Anzahl M × N Spots auf. Zur Vermeidung von optischen Rückreflexen und unerwünschter Fluoreszenzstrahlung von der Leiterplatte 8 ist der Biochip 30 auf der Rückseite optisch undurchlässig und nicht fluoreszierend, z. B. mit Schwarzchrom beschichtet.
  • Bei der Herstellung der Kartusche 1 wird zuerst der Biochip 30 auf der Leiterplatte 8 fixiert und anschließend die Leiterplatte 8 mit dem Gehäuse 2 verbunden. Die Verbindung zwischen der Leiterplatte 8 und dem Biochip 30 erfolgt mit einer Haftverbindungsschicht, wie z. B. einem geeigneten Klebeband (geeignet für biologische Reaktionen) oder mit einem Silikonkleber.
  • Anschließend wird die Leiterplatte 8 mit dem aufgebrachten Biochip 30 zum Gehäuse 2 justiert und an diesem fixiert. Eine dauerhafte, temperatur- und wasserbeständige Verbindung kann z. B. mittels biologisch-verträglichen Klebeband, mit Silikonkleber, durch Laserschweißen, durch Ultraschallschweißen oder biologisch verträgliche Klebstoffe realisiert werden.
  • Dabei gibt es die Möglichkeit, die Leiterplatte 8 großflächig mit dem Klebeband (oder Klebstoff) zu beschichten, den Biochip 30 über der Heiz-/Messstruktur aufzukleben, und dann das Gehäuse 2 zum Biochip 30 zu justieren und die Leiterplatte 8 über die gesamte Fläche des Gehäuses 2 zu fixieren.
  • Eine zweite Möglichkeit der Verbindung von Leiterplatte 8, Biochip 30 und Gehäuse 2 besteht in der gezielten flächigen Verklebung des Biochips 30 mit der Leiterplatte 8 (Kleber nur unter dem Biochip 30) und der anschließenden Fixierung des Gehäuses 2, wobei die Klebeschicht nur außerhalb der Reaktionskammer 22 vorgesehen wird. Mit dieser Art der Verklebung ist der Wärmeübergang von der Heiz-/Messstruktur in der Leiterplatte 8 in die Reaktionskammer 22 effizienter.
  • Zwischen der Leiterplatte 8 und der Folie 28 und durch den Rand der rautenförmigen Durchgangsöffnung 21 ist die Reaktionskammer 22 begrenzt. Die Leiterplatte 8 ist mit der Heiz-/Messstruktur versehen, um den Biochip 30 auf eine vorbestimmte Temperatur zu erwärmen und die Temperatur zu messen. Die Folie 28 dient als Sichtfenster für eine optische Detektionseinrichtung, die durch die Folie 28 hindurch auf dem Biochip 30 befindliche Spots optisch abtasten kann. Da die Folie 28 flexibel ausgebildet ist, kann sie zum Abtasten des Biochips 30 an dessen Oberfläche angelegt werden.
  • Zum Verschließen des Einfüllstutzens 10 und zum Erzeugen des Überdrucks in der Reaktionskammer 22 ist ein Stöpsel 15 vorgesehen. Der Stöpsel ist vorzugsweise aus einem thermoplastischen Elastomer (TPE) ausgebildet. Der Stöpsel 15 ist zylindrisch mit kreisförmigen Querschnitt ausgebildet. Der Außendurchmesser des Stöpsels 15 ist derart ausgebildet, dass er nahezu spielfrei im Verdichtungsabschnitt 12 des Einfüllstutzen 10 aufnehmbar ist. Der zylindrische Verdichtungsabschnitt 12 des Einfüllstutzen 10 und der Stöpsel 15 bilden eine Art Zylinder-Kolben-System aus. Der Stöpsel 15 ist mit einem einstückig angeformten Dichtungsring 31 aus demselben Material wie der Stöpsel versehen. Der Stöpsel 15 kann auch mit einer umlaufenden Nut versehen sein, in der ein Dichtungsring 31 angeordnet ist. Der Stöpsel 15 dichtet die Hohlräume der Kartusche 1 fluiddicht ab, nachdem er ca. ein Drittel seiner Länge in den Einfüllstutzen 10 eingeführt ist.
  • An der Innenseite 7 des Gehäuses 2 sind um die Reaktionskammer 22 drei Mittel zur Führung, Zentrierung und als Anschlag für eine Detektionseinrichtung 49 ausgebildet.
  • Im Bereich der in Richtung Einfüllstutzen 10 orientierten Spitze der rautenförmigen Reaktionskammer 22 sind zwei gegenüberliegende Abschnitte der Längsseiten 5 der Seitenwandung 4 gegenüber der restlichen die Seitenwandung 4 überhöht ausgebildet. Diese Beiden Abschnitte werden als Anschläge 45 bezeichnet. Sie sind zum Führen und als Anschlag für eine Abtastkammer ausgebildet.
  • Im Bereich der In Richtung Ausgleichsraum 24 orientierten Spitze der Reaktionskammer 22 ist senkrecht ein kreisförmiger Zentrierstift 44 angeformt. Der Zentrierstift 44 dient in Verbindung mit den Anschlägen 45 als Zentrierung beim Aufsetzen der Abtastkammer 40 und als Anschlag für die Abtastkammer 40.
  • Die Befüll- und Ausgleichsleitungsabschnitte 20, 23 sind möglichst kurz und mit einem möglichst kleinen Querschnitt ausgebildet, damit das Totvolumen klein und der notwendige Überschuss an Probenflüssigkeit gering gehalten wird. Die Leitungsabschnitte 20, 23 sind dennoch um die Reaktionskammer 22 herumgeführt, damit beim Befüllen, bei dem der Einfüllstutzen 10 oben angeordnet ist, sich die Reaktionskammer 22 von unten füllt. Hierdurch wird eine blasenfreie Befüllung der Reaktionskam mer 22 sichergestellt. Im Betrieb ist der Einfüllstutzen 10 unten und der Ausgleichsraum 24 oben angeordnet, so dass Probenflüssigkeit reversibel in den Ausgleichsraum 24 verdrängt werden kann, wobei die Luftblase beim Verdrängen sich im Ausgleichsraum 24 immer über der Probenflüssigkeit befindet.
  • Der Ablauf einer temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion erfordert die Einstellung genauer Temperaturen der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum. Dabei werden bei der Durchführung einer PCR z. B. Temperaturen zwischen 30°C und 98°C angesteuert. Die Temperaturverteilung der Probenflüssigkeit muss im Reaktionsraum homogen sein und Temperaturänderungen (Heizen, Kühlen) sollen schnell erfolgen.
  • Auf der Leiterplatte 8 (7) befindet sich eine Heiz-/Messstruktur 32, die bei Stromführung durch den ohmschen Widerstand als Heizer wirkt. Damit wird die Probenflüssigkeit in der Reaktionskammer 22 auf die erforderliche Temperatur T erwärmt. Die Heiz-/Messstruktur 32 kann gleichzeitig als Temperaturdetektor eingesetzt werden, indem die Widerstandskennlinie R(T) zur Bestimmung der Temperatur verwendet wird.
  • Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des Layouts der Leiterplatte 8 ist in 7 gezeigt. Die mäanderförmige Heiz-/Messstruktur 32 ist aus einer dünnen Leiterbahn mit einer Breite von 60 μm und einer Stärke von 16 μm ausgebildet. Sie ist etwa 480 mm lang. Bei Raumtemperatur weist sie einen elektrischen Widerstand von etwa 6 bis 8 Ohm auf. Die Leiterbahn ist aus Kupfer, vorzugsweise Kupfer mit einer Reinheit von 99,99% ausgebildet. Derart reines Kupfer weist einen Temperaturkoeffizienten auf, der im hier relevanten Temperaturbereich nahezu konstant ist. In ihrer Gesamtheit bildet die Heiz-/Messstruktur 32 eine Raute mit einer Kantenlänge von etwa 9 mm. Es gibt bereits Leiterplatten mit einer Kupferschicht, die eine Stärke von 5 μm aufweist und auf welchen Strukturen mit einer Breite von 30 μm ausgebildet sind. Mit derartigen Leiterbahnen würde eine Widerstand von etwa 100 Ohm bis 120 Ohm erzielt werden.
  • Der Biochip 30 weist lediglich eine Kantenlänge von 3 mm auf, womit die durch die Heiz-/Messstruktur 32 und eine Temperaturhomogenisierungsschicht gebildete Raute eine größere Fläche als der Biochip 30 abdeckt.
  • Die Leiterplatte 8 kann mit einer Temperaturhomogenisierungsschicht versehen sein, die eine Homogenisierung der Temperaturverteilung auf der Oberseite der Leiterplatte 8 bewirkt. Die Temperaturhomogenisierungsschicht ist eine Kupferschicht, die vernickelt und mit einer zusätzlichen Goldschicht versehen ist. Die Goldschicht hat den Vorteil, dass sie für biologische Materialen inert ist und somit in der Reaktionskammer biologische Materialen unmittelbar mit dieser Schicht in Berührung kommen können. Diese Reaktionskammer 22 kann deshalb auch für andere Experimente als solche mit Biochip verwendet werden. Diese Homogenisierungsschicht besitzt eine gute thermische Leitfähigkeit. Anstelle einer kombinierten Kupfer-Nickel-Gold-Beschichtung könnte auch eine relativ dicke Kupferschicht vorgesehen sein.
  • Eine in die Leiterplatte 8 integrierte Heizleiterbahn hat eine niedrige eigene Wärmekapazität. Damit sind hohe Heizraten der Probenflüssigkeit in der Reaktionskammer realisierbar.
  • Die Endpunkte der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur 32 gehen jeweils in eine sehr breite Leiterbahn 33 und 34 über, die zum Zuführen des Heizstromes dienen und selbst aufgrund ihrer großen Breite nur einen geringen Widerstand besitzen. Weiterhin sind an diesen beiden Leiterbahnen 33 und 34 jeweils eine weitere Leiterbahn 35 und 36 im Bereich der Anbindungsstelle der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur angebunden. Diese beiden weiteren Leiterbahnen 35 und 36 dienen zum Abgreifen des Spannungsabfalls an der Heiz-/Messstruktur 32. Die elektrische Ansteuerung der Heiz-/Messstruktur 32 ist ausführlich in der WO 2008/064865 A2 beschrieben. Auf dieses Dokument wird bzgl. der Ansteuerung der Heiz-/Messstruktur 32 Bezug genommen.
  • Die Leiterplatte 8 weist Leiterbahnen 37 und entsprechende Kontaktstellen 38, 39 zum Anschließen eines elektrischen Halbleiterspeichers auf. Dieser Halbleiterspeicher dient zum Speichern von Kalibrierdaten für die Heizeinrichtung und der Daten der biologischen Experimente, die mit dem Biochip der Kartusche durchzuführen sind. Diese Daten sind somit verwechslungssicher abgespeichert.
  • Im folgenden wird die Dimensionierung des Einfüllstutzens 10, des Befüllleitungsabschnitts 20, der Reaktionskammer 22, des Ausgleichsleitungsabschnitt 23, des Ausgleichsraums 24 und des Stöpsels 15 der erfindungsgemäßen Kartusche 1 anhand eines exemplarischen Ausführungsbeispiels beschrieben (5, 6, 10).
  • Das Volumen des Ausgleichsraums VA ergibt sich unter der Annahme, dass sich Luft wie ein ideales Gas verhält, der Druckaufbau isotherm erfolgt und die flüssige Probe nicht kompressibel ist, aus
    Figure 00170001
    wobei VKB das Volumen des Befüllleitungsabschnitts 20 (6,5 μl), VKA das Volumen des Ausgleichsleitungsabschnitts 23 (... μl), VR das Volumen der Reaktionskammer 22 (35,4 μl + 8 μl), p0 der Umgebungsdruck (1 bar) und p1 der erhöhte Druck (1,4 bar) ist.
  • Bei der Berechnung der Höhe des in den Verdichtungsabschnitt 12 eindringenden Stöpsels 15 wird zunächst ein erstes Eindringvolumen des Stöpsels VV berechnet das in den Verdichtungsabschnitt 12 des Einfüllstutzens 10 ohne mit dem Einfüllstutzen 10 abgedichtet zu sein eindringen soll. Dies ist somit das Volumen, das in den Verdichtungsabschnitt 12 eindringt, bis der Stöpsel 15 mit dem Verdichtungsabschnitt 12 abdichtet. Das erste Eindringvolumen des Stöpsels VV ergibt sich aus dem Gesamtvolumen Vt (150,2 μl) des Einfüllstutzens zwischen der Fase und der Befüllöffnung, abzüglich eines Überschussvolumens VP1 (10 μl) der Probenflüssigkeit, die in dem Einfüllstutzen verbleiben soll, damit bei Flüssigkeitsbewegungen keine Luft in den Befüllleitungsabschnitt 20 gelangen kann, eines Probenvolumens VP2 (49,9 μl), das sich aus den oben erwähnten 35,4 μl, 6,5 μl für den Befüllleitungsabschnitt 20 und 8 μl zum Ausgleich der Ausbeulung der Folie 28 zusammen setzt, und einer Luftreserve VL von 30 μl im Einfüllstutzen 10 für evt. zu viel pipettierte Probe: VV = Vt – VP1 – VP2 – VL
  • Die Luftreserve VL bleibt zwischen der Probenlösung und dem Stöpsel 15 eingeschlossen. Die erste Eindringtiefe hV des Stöpsels 15 in den Verdichtungsabschnitt 12 ergibt sich somit aus dem Eindringvolumen VV geteilt durch die Querschnittsfläche des Stöpsels AV:
    Figure 00180001
  • Eine zweite Eindringtiefe hS gibt an, wie weit der Stöpsel 15 in den Verdichtungsabschnitt 12 nach dem Abdichten eindringen muss, damit die Druckerhöhung auf 1,4 bar erfolgt. Da das Probenvolumens VP2 (49,9 μl) vollständig aus dem Einfüllstutzen 10 zu verdrängen ist, verbleibt nach dem vollständigen Eindrücken des Stöpsels im Einfüllstutzen 10 lediglich das Überschussvolumens VP1 (10 μl) der Probenflüssigkeit und die Luftreserve VL, die aufgrund des Druckaufbaus komprimiert ist. Das von dem Stöpsel 15 Vt' verdrängte Volumen nachdem er vollständig eingedrückt ist ergibt sich somit aus folgender Formel:
    Figure 00180002
  • Die zweite Eindringtiefe hS des Stöpsels 15 in den Verdichtungsabschnitt 12 ergibt sich somit aus dem zweiten Eindringvolumen Vt' geteilt durch die Querschnittsfläche des Stöpsels 15 AV:
    Figure 00180003
  • Im folgenden wird die Kopplung der Kartusche 1 an eine Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen beschrieben.
  • Diese erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst eine Abtastkammer 40, eine Detektionseinrichtung 49 und eine Druckluftversorgungsquelle 50.
  • Die Abtastkammer 40 ist als Tubus ausgebildet. Der Tubus 40 wird mit einer offenen Probenseite 41 auf die die Reaktionskammer 22 begrenzende Folie 28 bzw. auf die darauf angeordnete Dichtung 29 aufgesetzt.
  • Der Durchmesser des Tubus 40 auf der Probenseite 41 entspricht dem Durchmesser der auf der Folie 28 angeordneten Dichtung 29. Die Probenseite 41 ist stirnseitig von einer scharfkantigen umlaufenden Klinge 42 begrenzt. Die Klinge 42 ist derart ausgebildet, dass sie beim Aufsetzen der Abtastkammer 40 auf die Kartusche 1 in die Dichtung 29 der Kartusche 1 eindringt und eine druckdichte Verbindung bereitstellt.
  • An der Probenseite 41 des Tubus 40 sind Aussparungen 43 vorgesehen um den Zentrierstift 44 und die beiden Anschläge 45 der Kartusche 1 aufzunehmen. Durch die Anschläge 45 und den Zentrierstift 44 wird die Abtastkammer 40 exakt auf der Kartusche 1 bzw. deren Dichtung 29 und über der Reaktionskammer 22 positioniert. Durch die Anschläge 45 wird der exakte Anpressdruck eingestellt mit welchem die Abtastkammer 40 druckdicht auf der Kartusche 1 aufliegt.
  • Am dem der Probenseite 41 gegenüberliegenden Ende der Abtastkammer 40 ist ein Teil einer Optik angeordnet 46. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind z. B. zwei Linsen 47 vorgesehen.
  • In etwa mittig im Tubus 40 ist eine Druckluftleitung 48 angeschlossen, die mit einer Druckluftversorgungsquelle 50 verbunden ist. Die Druckluftversorgungsquelle 50 ist als Zylinder-/Kolbeneinheit mit einem elektrisch ansteuerbaren Linearantrieb derart ausgebildet, dass der Druck über den Linearantrieb am Kolben exakt einstellbar ist. Über die Druckluftversorgungsquelle 50 und die Druckluftleitung 48 ist die Abtastkammer 40 im Bereich zwischen den Linsen 47 und der Kartusche 1 mit Druckluft beaufschlagbar. Auf diese Weise wird die Folie 28 flächig an den Biochip 30 angelegt.
  • Hinter den beiden Linsen 47 ist eine Detektionseinrichtung 49 zum Abtasten des Biochips 30 angeordnet.
  • Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind in der Abtastkammer 40 drei Blenden 51 vorgesehen.
  • Die Detektionseinrichtung 49 zum Auslesen des Biochips 30 ist in der WO 2007/135 091 A2 ausführlich beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird. Die optische Detektionseinrichtung 49 umfasst eine LED mit angegossener Kunststoffoptik, eine LED-Optik, eine Beleuchtungsoptik, einen Anregungsfilter, einen dichroitischen Spiegel, eine NA-Blende, einen Emissionsfilter, eine Ausleseoptik und eine Kamera.
  • Als Lichtquelle wird vorzugsweise eine einzige Hochleistungs-LED mit hoher optischer Leistungsdichte und einer LED-Optik mit hoher numerischer Apertur (NA) verwendet. Hochleistungsleuchtdioden sind Leuchtdioden mit einem Lichtstrom von zumindest 35 Im. Vorzugsweise werden Leuchtdioden mit einer Lichtstrom von mindestens 40 Im, mindestens 50 Im oder mindestens 100 Im verwendet. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die Leuchtdiode Luxeon Star (Rot, 3 W elektrische Leistungsaufnahme, 90 Im Lichtstrom) verwendet.
  • Die verwendeten Leuchtdioden strahlen etwa punktförmig ab. Hierunter versteht man Leuchtdioden, deren Abstrahlfläche nicht größer als 1 mm × 1 mm ist. Vorzugsweise ist die Abstrahlfläche nicht größer als 0,5 mm × 0,5 mm. Je kleiner die Abstrahlfläche ist, desto besser lässt sich das Licht bündeln und die einzelnen Lichtstrahlen des Lichtstrahlbündels parallel zueinander ausrichten.
  • Ein Vorteil einer LED zur Ausleuchtung von Biochips liegt auch in der Variabilität der Wellenlänge. LEDs sind im gesamten sichtbaren Spektrum mit hoher Effizienz verfügbar. Ein weiterer Vorteil von LEDs z. B. gegenüber Lasern bei einer flächigen Ausleuchtung ist, dass keine kohärenzbedingten Intensitätsmodulationen in der Fläche auftreten.
  • Für die typischen nachzuweisenden Farbstoffe in den Spots auf dem Biochip kann eine spektral gut angepasste LED als Lichtquelle eingesetzt werden. Zum Beispiel:
    Farbstoff Cy5 Absorptionsmaximum bei 649 nm
    • – Anregen mit LED LUXEON LD3 (Farbe rot, max. bei 630 nm) Farbstoff Cy3 Absorptionsmaximum bei 514 nm
    • – Anregen mit LED LUXEON LM3 (Farbe grün, max. bei 530 nm) Farbstoff Alexa Fluor 532 Absorptionsmaximum bei 532
    • – Anregen mit LED LUXEON LM3 (Farbe grün, max. bei 530 nm)
  • Die Auswahl einer LED erfolgt für einen Wellenlängenbereich ΔλE der für Fluoreszenzmessungen (z. B. für Farbstoffe Cy5, Cy3, Alexa, ...) benötigt wird. LEDs sind klein, kompakt mit hohem Wirkungsgrad und haben eine hohe Lebensdauer.
  • Die Kamera weist ein flächiges CCD-Element als Detektor auf, so dass ein rechteckförmiges, insbesondere quadratisches Bild erfasst werden kann. Die Kamera ist derart ausgebildet, dass mit ihr Belichtungszeiten von mehr als 20 Sekunden ausgeführt werden können. Üblicherweise ist die maximale Belichtungszeit derartiger Kameras auf einige wenige Sekunden beschränkt. In der Regel wird die Kamera 5 bis 10 Sekunden zum Erfassen der Abbildung des Biochips belichtet. Je länger die Belichtungszeit ist, desto schwächere Fluoreszenzsignale können erfasst werden. Die Stärke der Fluoreszenzsignale hängt stark von der Anzahl der auf dem Biochip 30 ausgeführten PCR-Zyklen ab. Ein einzelner PCR-Zyklus dauert etwa eine halbe bis einige Minuten. Durch lange Belichtungszeiten, die um einige wenige Sekunden verlängert werden, kann somit eine Bearbeitungszeit von einigen Minuten im Bereich der PCR-Zyklen eingespart und die gesamte Bearbeitungszeit kurz gehalten werden. Diese relativ langen Belichtungszeiten stellen auch einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Scannern dar, die die einzelnen Spots der Reihe nach abtasten, da bei diesem Verfahren die Belichtungszeit nicht frei variierbar ist.
  • Durch den dichroitischen Spiegel ist die Beleuchtungsoptik von der Ausleseoptik getrennt. Die Beleuchtungsoptik ist mit einer großen numerischen Apertur ausgebildet. Im Strahlengang der Ausleseoptik ist die Ausleseblende angeordnet. Diese Blende verringert die numerische Apertur der Ausleseoptik, wodurch eine kontrastreiche Abbildung mit minimalen Abbildungsfehlern der Spots des Biochips auf der Kamera erzielt wird. Die numerische Apertur des Auslesekanals sollte nicht größer als 0,25 und vorzugsweise nicht größer als 0,15 sein.
  • Die beiden Linsen 47 im Tubus 40 sind sowohl Bestandteil des Beleuchtungskanals als auch des Auslesekanals.
  • Im folgenden wird die Anwendung der Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen beschrieben (8, 9).
  • Die Abtastkammer 40 wird mit Ihrer Probenseite 41 auf die Folie der Kartusche 1 aufgesetzt. Dabei greifen die Ausnehmungen 43 der Abtastkammer 40 in den Zentrierstift 44 und die beiden Anschläge 45 ein, wodurch die Abtastkammer 40 positioniert und der Anpressdruck auf die Dichtung 29 begrenzt wird. Die Klinge 42 dringt dabei in die Dichtung 29 ein und stellt eine druckdichte Verbindung sicher.
  • Über die Druckluftleitung wir die Abtastkammer mit Luft gefüllt. Auf diese Weise wird in dem zwischen Optik und transparenter Folie 28 abgedichteten Raum ein Überdruck zwischen 2 bar und 4 bar erzeugt. Die transparente Folie 28 legt sich durch den Überdruck an den Biochip 30 an und verdrängt den Fluoreszenzüberstand der Probenflüssigkeit über dem Biochip 30.
  • Die Fluoreszenz im übrigen Probenraum wird abgeblendet. Somit kann ein Fluoreszenzbild des Biochips 30 aufgenommen werden.
  • Eine Durchmischung (Zwangskonvektion) der Probe wirkt sich positiv auf die Reaktionsgeschwindigkeit der Hybridisierung/Inkubation aus, deshalb verkürzt sich die Hybridisierungs-/Inkubationszeit bzw. sind höhere Signalintensitäten möglich. Eine solche Zwangskonvektion kann durch Variieren des außen an der Folie anliegenden Überdrucks erzielt werden.
  • Durch den Innenüberdruck der Kartusche 1 von 0,4 bar wird die „Fenster”-Folie 28 insbesondere beim Aufheizen mechanisch belastet und würde sich plastisch verformen. Durch einen Außenüberdruck von ebenfalls 0,4 bar kann diese Belastung neutralisiert werden. Dies ist z. B. während des Amplifizierens von Vorteil, bei dem die Folie erheblich thermisch belastet wird.
  • Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist von Vorteil, dass großflächige Oberflächenunebenheiten auf dem Biochip 30, anders als bei starren aus dem Stand der Technik bekannten Deckgläschen, ohne Einfluss auf das Fluoreszenzsignal bleiben.
  • Die optische Qualität der Folie 28 hat aufgrund ihrer geringen Dicke und der Nähe der Folie 28 zum Biochip 30 nur geringen Einfluss auf die Auswertbarkeit der Fluoreszenzsignale Das Anlegen der Folie 28 an den Biochip 30 ist reversibel, somit ist eine realtime-PCR möglich In der Kartusche oder in der Vorrichtung kann auch eine Kühleinrichtung zum Kühlen der Reaktionskammer 22 vorgesehen sein.
  • Grundsätzlich ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, dass der Einfüllstutzen und der Stöpsel auch in Verbindung mit einer Kartusche verwendet werden, bei welcher eine flexible elektrische Leiterplatte vorgesehen ist, wobei das Sichtfenster starr, z. B. aus einer Glasscheibe, ausgebildet sein kann.
    • 1
    Kartusche
    2
    Gehäuse
    3
    Basiswandung
    4
    Seitenwandung
    5
    Längsseite
    6
    Stirnseite
    7
    Innenseite
    8
    Leiterplatte
    9
    Außenseite
    10
    Einfüllstutzen
    11
    Einfüllabschnitt
    12
    Verdichtungsabschnitt
    13
    Fase
    14
    Dichtpunkt
    15
    Stöpsel
    16
    zylindrischer Abschnitt
    17
    trichterförmiger Abschnitt
    18
    Befüllöffnung
    19
    Einfüllanzeige
    20
    Befüllleitungsabschnitt
    21
    Durchgangsöffnung
    22
    Reaktionskammer
    23
    Ausgleichsleitungsabschnitt
    24
    Ausgleichsraum
    25
    Kegel
    26
    Halbkugel
    27
    Befüllanzeige
    28
    Folie
    29
    Dichtung
    30
    Biochip
    31
    Dichtungsring
    32
    Heiz-/Messstruktur
    33
    Leiterbahn (Heizstrom)
    34
    Leiterbahn (Heizstrom)
    35
    Leiterbahn (Messstrom)
    36
    Leiterbahn (Messstrom)
    37
    Leiterbahn
    38
    Kontaktstelle
    39
    Kontaktstelle
    40
    Abtastkammer
    41
    Probenseite
    42
    Klinge
    43
    Aussparung
    44
    Zentrierstift
    45
    Anschlag
    46
    Optik
    47
    Linse
    48
    Druckluftleitung
    49
    Detektionseinrichtung
    50
    Druckluftversorgungsquelle
    51
    Blende
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Claims (15)

  1. Kartusche zur Untersuchung biologischer Proben mit – einer Reaktionskammer (22) und einem in der Reaktionskammer (22) angeordneten Biochip (30), – einem Einfüllstutzen (10) der kommunizierend mit der Reaktionskammer (22) verbunden ist, und – einem Ausgleichsraum (24), der kommunizierend mit der Reaktionskammer (22) verbunden ist, wobei die Reaktionskammer (22), der Ausgleichsraum (24) und alle hiermit verbundenen Leitungen einen bis auf am Einfüllstutzen (10) abgeschlossenen Raum bilden, dadurch gekennzeichnet, dass der Einfüllstutzen (10) einen freien Durchgang von außerhalb der Kartusche (1) zur Reaktionskammer (22) bildet, und ein Stöpsel (15) vorgesehen ist, der formschlüssig und dicht derart im Einfüllstutzen (10) aufgenommen wird, dass er beim Eindrücken über einen bestimmten Weg Fluid aus dem Einfüllstutzen (10) in Richtung zur Reaktionskammer (22) verdrängt.
  2. Kartusche nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen des Ausgleichsraums (24), der Reaktionskammer (22) und aller hiermit kommunizierenden Leitungen einschließlich des Einfüllstutzens (10) und des vom Einfüllstutzen (10) verdrängten Volumens derart ausgebildet ist, dass bei einer Probe mit vorbestimmtem Volumen in der Reaktionskammer (22) eine Druckerhöhung von zumindest 0,2 bar und vorzugsweise von zumindest 0,3 bar erzeugt wird.
  3. Kartusche nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Einfüllstutzen (10) über eine Befüllöffnung (18) mit der Reaktionskammer (22) verbunden ist, die einen Durchmesser aufweist, der derart ausgebildet ist, dass beim Einfüllen ohne Druckerhöhung keine Probenflüssigkeit aufgrund ihrer Oberflächenspannung durch die Befüllöffnung (18) gelangt.
  4. Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Einfüllstutzen (10) einen Einfüllabschnitt (11) aufweist, der ein Einfüllen der biologischen Probe von außen ermöglicht, der in einen zylindrisch ausgebildeten Verdichtungsabschnitt (12) mündet, wobei der Einfüllabschnitt (11) einen größeren Querschnitt aufweist als der Verdichtungsabschnitt (12) und der Verdichtungsabschnitt (12) über den freien Durchgang mit der Reaktionskammer (22) verbunden ist, und der Stöpsel (15) derart ausgebildet ist, dass er dicht im Verdichtungsabschnitt (12) aufnehmbar ist.
  5. Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Stöpsel (15) mit einem umlaufenden Dichtungsring (31) versehen ist, der derart ausgebildet ist, dass er fluiddicht mit dem Verdichtungsabschnitt (12) abschließt.
  6. Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer (22) an einer ersten Seite durch eine transparente, flexible Folie (28) begrenzt ist, die ein Sichtfenster bildet.
  7. Kartusche nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Kartusche (1) eine Dichtung zum druckdichten Aufsetzen einer Abtastkammer (40) einer Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben vorgesehen ist, die das Sichtfenster umgibt.
  8. Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kartusche (1) ein Gehäuse (2) mit einer Durchgangsöffnung (21) zur Ausbildung der Reaktionskammer (22) aufweist, wobei das Gehäuse (2) mit einer Leiterplatte (8) derart verbunden ist, dass die Leiterplatte (8) die Durchgangsöffnung (21) zur Begrenzung der Reaktionskammer (22) abdeckt, wobei ein Sichtfenster in der der Leiterplatte (8) gegenüberliegenden Seite der Reaktionskammer ausgebildet ist und in die Leiterplatte (8) Heiz-/Messstruktur integriert ist.
  9. Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Befüllleitungsabschnitt (20) vorgesehen ist, der sich vom Einfüllstutzen (10) um die Reaktionskammer (22) herum erstreckt und in einen vom Einfüllstutzen (10) entfernt angeordneten Randbereich der Reaktionskammer (22) mündet.
  10. Kartusche nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer (22) mit einer Befüllanzeige (27) an ihrem Randbereich verbunden ist, der dem Randbereich diametral gegenüber liegt, der mit dem Befüllleitungsabschnitt (20) verbunden ist.
  11. Vorrichtung zur Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen umfassend eine Kartusche (1) mit einer Reaktionskammer (22) in der ein Biochip (30) angeordnet ist und der einer aktiven Seite des Biochips (30) gegenüberliegende Bereich der Kartusche (1) als transparente Folie (28) ausgebildet und mit Abstand zum Biochip (30) angeordnet ist, eine Detektionseinrichtung, und eine druckdichte im Bereich der Folie (28) an die Kartusche (1) koppelbare Abtastkammer, wobei die Detektionseinrichtung derart mit der Kammer verbunden ist, dass durch die Folie (28) hindurch der Biochip (30) abtastbar ist und eine Druckluftleitung in die Abtastkammer mündet, so dass die Folie (28) mit einem Luftdruck derart beaufschlagbar ist, dass die Folie (28) flächig auf den Biochip (30) gedrückt wird.
  12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kolben-/Zylinderpumpe als Druckluftversorgungsquelle (50) vorgesehen ist, um die Abtastkammer (40) mit Druck zu beaufschlagen.
  13. Verfahren zum Befüllen einer Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kartusche (1) mit dem offenen Einfüllstutzen (10) nach oben weisend angeordnet befüllt wird und dann in den Einfüllstutzen (10) ein Stöpsel eingedrückt wird, so dass die Probenflüssigkeit in die Reaktionskammer (22) gedrängt wird und diese von unten nach oben befüllt und eine Luftblase in einem der Reaktionskammer (22) nachgeschalteten Ausgleichsraum (24) verbleibt.
  14. Verfahren zum Untersuchen einer biologischen Probe mit einer Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12 und einer Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kartusche (1) mit dem Einfüllstutzen nach unten weisend in der Vorrichtung angeordnet wird, wobei zum Durchführen einer optischen Abtastung der Reaktionskammer in der Abtastkammer (40) ein Überdruck von vorzugsweise 1 bar bis 4 bar derart erzeugt wird, dass sich die Folie an den Biochip anlegt und die Probenflüssigkeit aus der Reaktionskammer (22) in Richtung zum Ausgleichraum (24) verdrängt wird, wobei eine Luftblase über der Probenflüssigkeit im Ausgleichsraum verbleibt.
  15. Verfahren zum Untersuchen einer biologischen Probe mit einer Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12 und einer Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei der bei den Arbeitsschritten bei denen kein optisches Abtasten erfolgt und die Reaktionskammer (22) erhitzt wird in der Abtastkammer (40) ein Druck erzeugt wird, der in etwa dem Innendruck in der Reaktionskammer (22) entspricht.
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