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Die
vorliegende Erfindung befasst sich mit Vorrichtungen und Verfahren
zur Handhabung von Biomolekülen und insbesondere mit Vorrichtungen und
Verfahren zur Handhabung von Biomolekülen mittels magnetischer
Partikel, die eine Affinität zu den Biomolekülen
aufweisen.
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Bei
molekularbiologischen Untersuchungen ist eine Handhabung und Prozessierung
von Biomolekülen unverzichtbar. Viele bekannte Systeme
setzen hierbei auf die sogenannte Magnetophorese, bei der die langreichweitigen
und großen Kräfte von Magnetkraftelementen verwendet
werden, um Biomoleküle zu handhaben, siehe M. A.
M. Gijs, „Magnetic bead handling on-chip: new opportunities
for analytical applications", Microfluidics Nanofluidics,
Oct. 2004, S. 22–40.
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Mittels
Magnetophorese lassen sich in einen kontinuierlichen Fluss suspendierte,
magnetische Partikel nach der magnetischen Suszeptibilität
sortieren, Pamme N. et al., „Onchip free-flow magnetophoresis:
Continuous flow separation of magnetic particles and agglomerates",
Anal. Chem., Bd. 76, Nr. 24, S. 7250–7256, Dec. 2004.
Hierzu werden konstante Magnetfelder angelegt, die mindestens eine
Komponente senkrecht zur Flussrichtung und große Magnetfeldgradienten
aufweisen.
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Werden
kleine Mengen einer Suspension bestehend aus einer Pufferlösung
und magnetischen Partikeln auf einer Oberfläche als kleine
Tropfen platziert, so können die Partikel anhand entsprechender Magnetkraftelemente
manipuliert und von Tropfen zu Tropfen transferiert werden. Um ein
Verdampfen der Pufferlösung zu verhindern, wird der Tropfen
dabei mit einer hydrophoben Phase eingeschlossen, siehe J.
Pieper et al., „Clockwork PCR including sample preparation",
Angewandte Chemie-International Edition, Bd. 47, Nr. 21, S. 3900–3904,
2008; und U. Lehmann et al., „Droplet-based
DNA purification in a magnetic lab-on-a-chip", Angewandte
Chemie-International Edition, Bd. 45, Nr. 19, S. 3062–3067,
2006.
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Innerhalb
mikrofluidischer Kanäle werden magnetische Partikel häufig
durch Magnetkraftelemente immobilisiert, um sie mit entsprechenden
Pufferlösungen zu überströmen. Aus
E.
P. Furiani et al., „A model for predicting magnetic particle
capture in a microfluidic bioseparator", Biomedical Microdevices, Bd.
9, Nr. 4, S. 450–463, Aug. 2007, der
US-A1-2007/0207548 ,
der
US-A1-2007/0190653 und
der
US-B2-7138269 sind
Umsetzungen bekannt, bei denen Partikel direkt an einer Kanalwand
immobilisiert werden. Bei
F. Lacherme et al., „Full
on-chip nanoliter immunoassay by geometrical magnetic trapping of
nanoparticle chains", Anal. Chem., Bd. 80, Nr. 8, S. 2905–2910,
Apr. 2008 und in der
US-B1-6632655 sind Umsetzungen beschrieben,
bei denen die Partikel in der Kanalmitte immobilisiert werden. Hierbei
erfolgt eine diskontinuierliche Arbeitsweise aus Anlagern der magnetischen
Partikel an die Oberfläche, gefolgt von einem Überströmen mit
einer Lösung und einem nachfolgenden Ablösen der
magnetischen Partikel.
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Aus
der
US-A1-2007/0207548 ist
es ferner bekannt, magnetische Partikel unter Verwendung eines Magneten
aus einer Probenlösung in eine Pufferlösung zu
ziehen.
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Die
US-B1-7364921 beschreibt
ein System, bei dem Gele eingesetzt werden, um die Diffusion der magnetischen
Partikel zu verlangsamen. Ferner wird hier ein wiederholtes Erhöhen
und Verringern des magnetischen Feldes auf eine gepulste Art und
Weise verwendet, um eine räumliche Trennung magnetischer
Komponenten zu bewirken. Eine Kombination einer Magnetophorese mit
einer Elektrophorese ist aus der
US-A1-2006/0286596 bekannt, während eine
Kombination aus einer Magnetophorese und einer Dielektrophorese
aus der
US-B2-7033473 bekannt
ist. Solche Kombinationen sind jedoch aufwendig.
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Ferner
ist beispielsweise aus der
US-A1-2004/0009614 ein System bekannt, bei
dem eine Mehrzahl von Magnetkraftelementen zur Manipulation magnetischer
Partikel verwendet wird.
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Auch
kontinuierlich arbeitende Systeme zur Prozessierung von Biomolekülen
sind aus dem Stand der Technik bekannt, siehe beispielsweise die
US-B2-7384561 und
die
US-A1-2008/0124779 ,
wobei entweder nur die Puffer-Lösungen kontinuierlich durch
die Mikrokanäle fließen können oder kleine magnetische
Streifen in die Mikrokanäle eingesetzt sind, was Produktion
und Flexibilität dieser Systeme deutlich erschwert.
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Andere
bekannte Systeme, siehe beispielsweise die
US-A1-2007/0231888 sind
auf den Einsatz von Blut beschränkt oder nutzen mehrere
veränderliche elektrische Potenziale, siehe
US-B1-6467630 , was eine
komplexe Anordnung von Elektroden erfordert. Aus der
US-B1-6383397 ist ein System
mit vielen parallelen Rohren bekannt, wobei jedes Rohr mit Drähten
umwickelt ist, um Magnetfelder zu erzeugen. Aus der
US-6132607 ist ein System mit einer
Vielzahl an Magnetkraftelementen bekannt, um unter Verwendung eines
mehrdimensionalen Gradienten Komponenten eines Gemisches chemischer
Entitäten magnetisch zu trennen und zu behandeln. Aus der
US-5705064 ist die Verwendung
einer Vielzahl von Magnetkraftelementen bekannt, die zusammen ein
magnetisches Rohr bilden.
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Bei
bekannten Systemen werden zur Magnetophorese meist superparamagnetische
Partikel eingesetzt, die eine hohe Suszeptibilität aufweisen. Dadurch
lassen sich durch extern angelegte magnetische Felder leicht und
schnell magnetische Dipole in den Partikeln induzieren. Andererseits
verschwinden diese induzierten Bipole in den Partikeln und die mag netische
Anziehung ebenso schnell, wenn das externe Magnetfeld wegfällt,
so dass keine Magnetisierung in den Partikeln verbleibt. Neben ihren
magnetischen Eigenschaften absorbieren diese Partikel Laserstrahlung,
was weitere Anwendungsmöglichkeiten, wie das Entfernen
einer Pufferlösung, siehe J. G. Lee et al. „Microchip-based
one step DNA extraction and real-time PCR in one chamber for rapid
pathogen identification", Lab Chip, Bd. 6, Nr. 7, S. 886–895,
2006, oder die Realisierung von Ventilen durch Schmelzen
von Wachs, siehe J. M. Park et al., „Multifunctional
microvalves control by optical illumination on nanoheaters and its
application in centrifugal microfluidic devices", Lab Chip,
Bd. 7, Nr. 5, S. 557–564, 2007, bietet. Die Oberflächen
der superparamagnetischen Partikel lassen sich auf vielfältige Weise
modifizieren. Beispiele solcher Oberflächenmodifikationen
sind funktionelle Gruppen, wie Amine und Epoxide, oder Biomoleküle,
wie Streptavidin oder Antikörper.
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Superparamagnetische
Partikel sind in handelsüblichen DNA-Extraktions-Kits erhältlich.
Die mit solchen Kits mitgelieferten Pufferlösungen ermöglichen
optimale Bedingungen für einzelne Schritte eines kompletten
DNA-Extraktionsprozesses. Nach dem Binden der DNA-Moleküle
an die Partikel werden Verunreinigungen durch Waschschritte entfernt, und
die aufgereinigte DNA von den Partikeln eluiert. Kommerzielle DNA-Extraktions-Kits
ermöglichen jedoch keinen kontinuierlichen Betrieb und
erfordern eine Vielzahl einzelner Arbeitsschritte. Bei jedem Arbeitsschritt
ist die Gefahr von Kontanimationen gegeben.
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Ferner
sind Pipettier-Roboter bekannt, die das Kontaminationsrisiko verringern
können, indem sie DNA-Extraktions-Kits automatisieren.
Auch hier ist jedoch eine kontinuierliche Arbeitsweise nicht möglich.
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Ein
System, das quasi-kontinuierlich arbeitet, ist in der
WO-A2-2006/056579 beschrieben.
Dabei werden die Partikel durch periodisches Umpolen von Elektromagneten
in Lösung gehalten und mit einer Pufferlösung
durchströmt. Dadurch, dass die Partikel örtlich
auf eine bestimmte Region begrenzt gehalten werden, müssen
die benötigten Puffer nacheinander durch die Partikel geströmt
werden. Dies erlaubt zwar eine Aufreinigung der Partikel, ist jedoch diskontinuierlich.
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Aus
dem Stand der Technik sind ferner Lab-on-a-Chip-Systeme zur Aufreinigung
von Biomolekülen bekannt, siehe
M. Matsunaga et
al., „Microfabricated devices for DNA extraction toward
realization of deep-sea in situ gene analysis", Oceans,
Bd. 1, S. 89–94, 2004, und die
US-5834303 . Allerdings arbeiten derartige
Systeme nicht kontinuierlich und sind auf eine Klasse von Biomolekülen
beschränkt. Des Weiteren führt eine einzelne Kartusche
meist nur eine Operation aus, beispielsweise Zell-Lyse, DNA-Aufreinigung,
DNA-Amplifikation, oder DNA-Detektion. Somit sind für eine
erfolgreiche Extraktion von DNA auf Zellen mindestens zwei Kartuschen
erforderlich, eine für die Zell-Lyse und eine für die
DNA-Aufreinigung.
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Des
Weiteren sind Lab-on-a-Chip-Systeme bekannt, bei denen biologische
Essays im kontinuierlichen Fluss und mit Einsatz mehrerer Pufferlösungen
durchgeführt werden können. Derartige Systeme setzen
auf magnetische Partikel für den Transport einer Zielsubstanz
in die unterschiedlichen Pufferlösungen in einer Laminarströmung
mittels Magnetophorese mit einem Permanentmagneten, siehe S.
A. Peyman et al., „Rapid, multi-step bioassays on the surface
of mobile magnetic particles in continuous flow", μTas
2008, S. 1114–1116, oder mehreren Permanentmagneten, L.
R. Sasso et al., „Continuous microfluidic immunosensing
with antibody conjugated paramagnetic beads", μTas
2008, S. 77–79. Bei diesen Systemen sind die Permanentmagnete
an festen Positionen auf der Kartusche angebracht, wobei diese Position
exakt kalibriert werden muss, damit die magnetischen Partikel zwar
einerseits angezogen und über die Phasengrenze in die einzelnen Pufferlösungen
bewegt werden, aber andererseits nicht an der Kanalwand immobilisiert
werden.
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Aus
der
DE-A1-10355460 ist
ein Mikrofluidsystem mit einem Basiskörper bekannt, in
welchem mindestens ein Mikrokanal gebildet ist, der von einem mit
Partikeln, insbesondere Biopartikeln, beladenen Fluidstrom durchströmbar
ist. Benachbart zu dem mindestens einen Mikrokanal sind Magnetkraftelemente
angeordnet, wobei die Magnetkraftelemente wenigstens ein Magnetkraftelement
umfassen, welches außerhalb einer von anderen der Magnetkraftelemente
längs des mindestens einen Mikrokanals aufgespannten Ebene
in dem Basiskörper angeordnet ist.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Vorrichtungen
und Verfahren zur Handhabung von Biomolekülen zu schaffen,
die einen einfachen Aufbau und einen kontinuierlichen Betrieb ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch
1 und ein Verfahren gemäß Anspruch 13 gelöst.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung schaffen eine Vorrichtung zur Handhabung von Biomolekülen
mittels magnetischer Partikel, die eine Affinität zu den
Biomolekülen aufweisen, mit folgenden Merkmalen:
einer
Kanalstruktur, die zur Erzeugung einer Mehrphasenströmung
ausgelegt ist;
zumindest einem Magnetkraftelement, das relativ
zu der Kanalstruktur bewegbar ist; und
einer Einrichtung zum
Erzeugen einer Relativbewegung zwischen dem zumindest einen Magnetkraftelement
und der Kanalstruktur, zum Beaufschlagen der Kanalstruktur mit einem
zeitlich variierenden Magnetfeld, um eine Position der magnetischen
Partikel in zumindest einem Kanalstrukturab schnitt der Kanalstruktur
zu steuern und um die magnetischen Partikel über eine Phasengrenze
der Mehrphasenströmung zu bewegen.
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Bei
Ausführungsbeispielen der Erfindung weist das relativ zu
der Kanalstruktur bewegbare Magnetkraftelement zumindest ein rotierbares
Magnetkraftelement auf, das ausgelegt ist, um ein rotierendes Magnetfeld
zu erzeugen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können
ein oder mehrere Magnetkraftelemente an einer Fördereinrichtung,
wie z. B. einem Förderband, angebracht sein, um eine translatorische
Bewegung des oder der Magnetkraftelemente zu bewirken, um die Kanalstruktur
mit einem zeitlich variierenden Magnetfeld zu beaufschlagen. Bei
Ausführungsbeispielen der Erfindung können das
oder die Magnetkraftelemente Permanentmagneten oder Elektromagneten
aufweisen.
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Bei
Ausführungsbeispielen kann die Einrichtung zum Erzeugen
einer Relativbewegung ausgebildet sein, um das zumindest eine Magnetkraftelement zu
bewegen, während die Kanalstruktur stationär bleibt.
Bei alternativen Ausführungsbeispielen kann die Einrichtung
zum Erzeugen einer Relativbewegung ausgebildet sein, um die Kanalstruktur
zu bewegen, während das zumindest eine Magnetkraftelement
stationär bleibt. Wiederum alternativ kann die Einrichtung
ausgebildet sein, um das zumindest eine Magnetkraftelement und die
Kanalstruktur zu bewegen.
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Bei
Ausführungsbeispielen der Erfindung weist die Kanalstruktur
eine Mehrzahl von separaten Einlässen zur Erzeugung der
Mehrphasenströmung auf. Die Mehrphasenströmung
kann im wesentlichen laminare Ströme verschiedener Flüssigkeiten
aufweisen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung weist eine
Einrichtung zum Erzeugen der Mehrphasenströmung Injektionsmittel,
beispielsweise Pumpen, zum Injizieren unterschiedlicher Flüssigkeiten
in die Einlässe auf. Die Mehrphasenströmung kann
in einem Kanal vorliegen oder in einer Mehrzahl von Kanälen, die
fluidisch verbunden sind.
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Erfindungsgemäß kann
eine Relativbewegung zwischen einem Magnetkraftelement und einer Kanalstruktur,
wie z. B. eine Rotation eines Magnetkraftelements, wie z. B. eines
Permanentmagneten oder eines Elektromagneten, ein zeitlich variierendes Magnetfeld
erzeugen, durch das magnetische Partikel in einer Kanalstruktur,
die Teil eines Mikrofluidiksystems sein kann, gesteuert werden.
Durch das erzeugte, zeitliche variierende Magnetfeld können
magnetische Partikel in Phasen starker Magnetfelder immer effektiv
angezogen werden, während sie jedoch in Phasen schwacher
Felder losgelassen werden können, so dass sie nicht an
einer Kanalwand der Kanalstruktur festgehalten werden. Ausführungsbeispiele
der Erfindung ermöglichen somit ohne eine aufwändige
Justierung einfach durch einen kontinuierlichen Wechsel der Magnetfeldstärke
aufgrund der Relativbewegung des oder der Magnetkraftelemente zu
der Kanalstruktur einen Transfer von magnetischen Partikeln über
Phasengrenzen von Flüssigkeiten hinweg, ein Lenken von
magnetischen Partikeln in bestimmte Ausgangszweige von Kanalverzweigungen
und/oder einen Transport entlang einer, in einem Winkel zu einer
oder gegen eine Strömrichtung von Pufferlösungen,
in denen sich die magnetischen Partikel befinden. Dies ist bei festsitzenden
Magneten nicht möglich und im Falle von stationären
Elektromagneten nur durch eine gezielte Steuerung erreichbar.
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Bei
Ausführungsbeispielen der Erfindung ist die Kanalstruktur
in einem Kanalstrukturkörper, beispielsweise einem Chip,
gebildet und weist Mikrokanäle auf, durch die verschiedene
Flüssigkeiten fließen können. Bei Ausführungsbeispielen
erlaubt die Erfindung eine kontinuierliche Prozessierung von Biomolekülen,
wobei für einen jeweiligen Assay benötigte Pufferlösungen
kontinuierlich durch die Mikrokanäle der Kanalstruktur
fließen können. Die Biomoleküle sind
an eine mobile Festphase, die aus magnetischen Partikeln besteht,
konvalent oder nicht-konvalent gekoppelt und können dann
sequenziell verschiedenen Pufferlösungen ausgesetzt werden. Dazu
können die magnetischen Partikel in den Mikrokanälen
durch die Relativbewegung abgelenkt und in eine gewünschte
Pufferlösung transportiert werden. In einem letzten Schritt
können die Biomoleküle von den magnetischen Partikeln
gelöst werden, die abschließend aus der Pufferlösung
entfernt werden können.
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Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung ermöglichen eine kontinuierliche
und automatisierte Prozessierung von Biomolekülen unter Verwendung
einer Mehrzahl von verschiedenen Puffer-Lösungen, wie sie
bei einer umfassenden Prozessierung von Biomolekülen erforderlich
ist. Durch die zeitlich variierenden Magnetfelder, die durch die
Relativbewegung erzeugt werden, können Partikel einerseits
in einem Mikrokanal aus einer Pufferlösung separiert werden,
während sie andererseits nicht an der Kanalwand immobilisieren,
was eine kontinuierliche Arbeitsweise ermöglicht. Das sich
relativ zu der Kanalstruktur bewegende Magnetkraftelement ermöglicht
ferner eine Steuerung der Position von magnetischen Partikeln an
einer Mehrzahl von Positionen, die beispielsweise radial entlang
eines Rotationsweges eines rotierenden Magnetkraftelements verteilt
sind. Somit ist es möglich, eine Steuerung an einer Mehrzahl
unterschiedlicher Positionen unter Verwendung lediglich eines Magnetkraftelements, wie
z. B. eines Permanentmagneten, zu erhalten, was eine deutlich verringerte
Komplexität ermöglicht. Ausführungsbeispiele
der Erfindung ermöglichen es somit bei einem sehr einfachen
Aufbau mit nur einem externen Magnetkraftelement magnetische Partikel einer
Mehrzahl unterschiedlicher chemischer Lösungen auszusetzen.
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Bei
Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Mikrokanalstruktur
abgeschlossene Kanäle aufweisen, wobei für die
erforderlichen Flüssigkeiten, wie z. B. die Probenlösung
und erforderliche Pufferlösungen, jeweils separate Einlässe
vorgesehen sein können. Somit kann eine Kontamination weitgehend ausgeschlossen
werden, was zu einer hohen Reproduzierbarkeit von Extraktionsergebnissen
führen kann.
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Bei
Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Vorrichtung
mehrere Einlässe in die Kanalstruktur bieten, durch die
unterschiedliche Puffer parallel injiziert werden können,
so dass magnetische Partikel im kontinuierlichen Betrieb durch ein
geeignetes Kanaldesign unter Verwendung eines oder mehrerer sich
relativ zu der Kanalstruktur bewegender Magnetkraftelemente, wie
z. B. einem einzigen rotierenden Permanentmagneten, von einem Puffer in
den nächsten überführt werden kann. Somit
kann bei Ausführungsbeispielen der Erfindung eine echte kontinuierliche
Arbeitsweise erreicht werden, da sowohl die Magnetpartikel als auch
die Flüssigkeiten bzw. Lösungen kontinuierlich
transferiert werden können.
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Bei
Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Vorrichtung
zur Prozessierung unterschiedlicher Biomoleküle eingesetzt
werden. Die Kanalstruktur kann ausgelegt sein, um alle benötigten Schritte
zur erfolgreichen Aufreinigung von Biomolekülen auf einer
Kartusche, d. h. in einem Kanalkörper oder Chip, zu integrieren.
Ausführungsbeispiele der Erfindung können ausgelegt
sein, um ein Immunoassay, eine Nukleinsäureextraktion oder
eine kontinuierliche DNA-Amplifikation durchzuführen.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung werden nachfolgend Bezug nehmend auf die beiliegenden Zeichnungen
näher erläutert.
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Es
zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung;
-
2 eine
schematische Darstellung eines alternativen Ausführungsbeispiels
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
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3a und 3b vergrößerte
Abschnitte von 2;
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4a und 4b eine
schematische Draufsicht und eine schematische Seitenansicht eines
Ausführungsbeispiels der Erfindung;
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5a und 5b eine
schematische Draufsicht und eine schematische Seitenansicht eines
weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung;
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6a und 6b eine
schematische Draufsicht und eine schematische Seitenansicht eines
weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung;
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7 eine
schematische Darstellung zur Erläuterung eines weiteren
Ausführungsbeispiels der Erfindung;
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8a bis 8c schematische
Darstellungen zur Erläuterung, wie bei Ausführungsbeispielen der
Erfindung die Position magnetischer Partikel gesteuert werden kann;
und
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9a und 9b schematische
Darstellungen zur Erläuterung, wie bei Ausführungsbeispielen
der Erfindung die Position magnetischer Partikel gesteuert werden
kann.
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Anhand
der 1 wird nachfolgend ein Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung in Form eines Mikrofluidiksystems für
eine Aufreinigung von DNS näher erläutert.
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Ein
Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung weist zu diesem Zweck ein Magnetkraftelement in Form
eines rotierbaren Permanentmagneten 10 und eine Kanalstruktur 20 auf.
Ein Drehgeber 12, wie z. B. ein Schrittmotor, ist vorgesehen,
um den Permanentmagneten 10 mit einer Rotation zu beaufschlagen.
Die Kanalstruktur 20 kann in einem geeigneten Kanalstrukturkörper
bzw. Chip (nicht gezeigt) gebildet sein. Die Kanalstruktur 20 umfasst
einen ersten Einlass 22, einen zweiten Einlass 24,
einen dritten Einlass 26 und ei nen vierten Einlass 28.
Die Kanalstruktur umfasst eine erste Reaktionsstufe 30,
eine zweite Reaktionsstufe 40 und eine dritte Reaktionsstufe 50.
Der Einlass 22 mündet in einen Eingang 31 der
ersten Reaktionsstufe 30, die einen ersten und einen zweiten
Ausgang 32 und 33 aufweist. Der zweite Ausgang 33 ist über
einen Mikrokanal fluidisch mit einem ersten Eingang 41 der zweiten
Reaktionsstufe 40 verbunden. Der zweite Einlass 24 ist über
einen Mikrokanal mit einem zweiten Eingang 42 der zweiten
Reaktionsstufe verbunden. Die zweite Reaktionsstufe 40 weist
ferner einen ersten Ausgang 43 und einen zweiten Ausgang 44 auf,
der mit einem ersten Eingang 51 der dritten Reaktionsstufe 50 verbunden
ist. Die dritte Reaktionsstufe 50 weist ferner einen zweiten
Eingang 52 auf, der mit dem dritten Einlass 28 fluidisch
gekoppelt ist, und einen dritten Eingang 53, der mit dem
vierten Einlass 28 fluidisch gekoppelt ist. Die dritte
Reaktionsstufe 50 umfasst ferner einen ersten Ausgang 54 und
einen zweiten Ausgang 55.
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Bei
dem dargestellten Ausführungsbeispiel sind drei Reaktionsstufen
in ein Mikrofluidiksystem integriert, wobei die Reaktionsstufen
jeweils aus einer Kavität mit mindestens einem Einlass
und mindestens zwei Auslässen besteht. Wie in 1 zu
erkennen ist, weisen die Kavitäten der Reaktionsstufen einen
größeren Kanaldurchmesser als die Eingänge und
Ausgänge derselben auf, so dass dort die Flussgeschwindigkeit
einer Strömung verringert sein kann, wodurch magnetische
Partikel einfacher zu einer Seite der Kavität gezogen werden
können. Dadurch kann eine Aufkonzentrierung magnetischer
Partikel erreicht werden, die dann die Reaktionsstufe durch einen
der Ausgänge, der näher bei dem rotierbaren Permanentmagneten
angeordnet ist, nämlich den zweiten Ausgang, verlassen,
während der Großteil einer jeweiligen Pufferlösung
mit eventuellen Verunreinigungen durch den anderen Auslass, der
von dem rotierbaren Permanentmagneten weiter entfernt ist, nämlich
jeweils den ersten Ausgang, die Reaktionsstufen verlässt.
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Im
Betrieb wird eine Probenlösung in den Einlass 22 eingespült.
Die Probenlösung weist an den magnetischen Partikeln angekoppelte
Biomoleküle in einer ersten Pufferlösung auf.
Durch das Einspülen wird eine Strömung der Probenlösung
in die erste Reaktionsstufe 30 bewirkt, wo die magnetischen
Partikel 60 durch den rotierenden Permanentmagneten 10 radial
nach innen und somit in den zweiten Ausgang 33 abgelenkt
werden. Von dort wird die partikelgebundene Probe zum Eingang 41 der zweiten
Reaktionsstufe 40 geleitet, wie durch einen Pfeil 62 angedeutet
ist. Der Rest der ersten Pufferlösung sowie Verunreinigungen
verlassen die erste Reaktionsstufe 30 über den
ersten Ausgang 32, siehe Pfeil 64, der mit einem
Abfallbehälter (nicht gezeigt) verbunden sein kann.
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Eine
zweite Pufferlösung 24 wird in den zweiten Einlass 24 eingespült,
siehe Pfeil 66, so dass sich in der zweiten Reaktionsstufe 40 eine
Laminarströmung der über den ersten Eingang 41 einströmenden Suspension
mit der partikelgebundenen Probe und der über den zweiten
Eingang 42 einströmenden zweiten Pufferlösung
ausbildet, wie durch die gestrichelte Linie 68 angedeutet
ist. Durch den rotierenden zentralen Permanentmagneten 10 werden
die magnetischen Partikel 60 über die Phasengrenze
in die zweite Pufferlösung gezogen und in den zweiten Ausgang 44 gelenkt.
Die partikelgebundene Probe verlässt somit die zweite Reaktionsstufe 40 in
der zweiten Pufferlösung über den zweiten Ausgang 44. Die
erste Pufferlösung sowie mögliche Verunreinigungen
verlassen die zweite Reaktionsstufe über den ersten Ausgang 43,
wie durch einen Pfeil 70 in 1 angedeutet
ist.
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An
dieser Stelle sei angemerkt, dass an der Phasengrenze zwischen den
zwei Pufferlösungen ein geringfügiges Mischen
durch Diffusion stattfinden kann.
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Die
partikelgebundene Probe in der zweiten Pufferlösung strömt
entlang des Mikrokanals, der den zweiten Ausgang 44 der
zweiten Reaktionsstufe mit dem ersten Eingang 51 der dritten
Reaktionsstufe verbindet. In den dritten Einlass 26 wird
eine dritte Pufferlösung eingespült, und in den
vierten Einlass 28 wird eine vierte Pufferlösung
eingespült, so dass die Strömung der partikelgebundenen
Probe in der zweiten Pufferlösung zwischen der Strömung
der dritten Pufferlösung und der vierten Pufferlösung
ist. Die zweite Pufferlösung kann Ethanol aufweisen, das sich
aufgrund der hygroskopischen Eigenschaften des Ethanol, schnell
mit der dritten und vierten Pufferlösung vermischen kann
und es kann sich wieder eine Laminarströmung ausbilden,
wie durch eine gestrichelte Linie 82 angedeutet ist. Die
vierte Pufferlösung, die von der bezüglich der
dritten Pufferlösung gegenüberliegenden Seite
eingespült wird, dient dazu, Ethanol aus der zweiten Pufferlösung
aufzunehmen und somit die Ethanolkonzentration im Eluat, das die
dritte Reaktionsstufe 50 über den zweiten Ausgang 55 desselben
verlässt, zu verringern. In der dritten Reaktionsstufe 50 bewirkt
wiederum die Rotation des Permanentmagneten 10, dass die
magnetischen Partikel aus der zweiten Pufferlösung in ein Pufferlösungsgemisch,
das die dritte Pufferlösung aufweist, gebracht und in den
zweiten Ausgang 55 der dritten Reaktionsstufe 50 gelenkt
wird. Der Ausgang 55 ist mit einem Mikrokanal 80 fluidisch
gekoppelt, über den die gereinigte Probe an den magnetischen
Partikeln einer weiterführenden Echtzeitanalyse zugeführt
werden kann.
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Die
zweite Pufferlösung und die vierte Pufferlösung
können die dritte Reaktionsstufe 50 über
den zweiten Ausgang 54 verlassen, wie durch einen Pfeil 84 angedeutet
ist.
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Bei
dem gezeigten Ausführungsbeispiel wird somit eine Steuerung
der Position der magnetischen Partikel an einer Mehrzahl von Abschnitten
der Kanalstruktur 20, die radial entlang eines Rotationsweges
des rotierenden Magneten 10 verteilt sind, erreicht. Mit
anderen Worten wird die Position der magnetischen Partikel in jeder
der ersten, zweiten und dritten Reaktionsstufe durch den einzelnen
rotierenden Permanentmagneten 10 gesteuert.
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Die
ersten Ausgänge 32, 43 und 54 der
ersten, zweiten und dritten Reaktionsstufe können über jeweilige
Kanäle bzw. Mikrokanäle, die in 1 angedeutet
sind, mit einem Abfallbehälter oder mehreren Abfallbehältern
fluidisch gekoppelt sein.
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Bei
dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ist für
jede benötigte Pufferlösung ein separater Einlass
vorgesehen, wobei die Reaktionsstufen so ausgebildet sein können,
dass sich Laminarströmungen ausbilden, damit sich die einzelnen
Pufferlösungen nicht bzw. nur in einem definierten und
sehr geringen Umfang mischen. Über die Phasengrenze dieser
Laminarströmung können dann die magnetischen Partikel
mittels Magnetophorese durch das zeitlich variierende Magnetfeld,
das durch den rotierenden Permanentmagneten 10 erzeugt
wird, gezogen werden. Auf diese Weise können die magnetischen
Partikel jeweils in die optimale Umgebung für die jeweils
auszuführenden Schritte gebracht werden, nämlich
beispielsweise Binden der Biomoleküle, Entfernen von Verunreinigungen
und/oder Lösen der Biomoleküle von den magnetischen
Partikeln.
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Der
rotierende Permanentmagnet erzeugt einen regelmäßigen
Wechsel von starkem und schwachen Magnetfeld an den Orten der magnetischen Partikel,
so dass diese einerseits durch die starken Felder effektiv über
die Phasengrenze bewegt werden können und andererseits
aufgrund der schwachen Felder nicht im Kanal immobilisiert werden.
Somit ist eine exakte Abstimmung des Magnetfeldes auf ein solches,
bei dem die magnetischen Partikel nicht an der Wand des Mikrokanals
immobilisiert werden, jedoch noch ausreichend abgelenkt werden,
um über die Phasengrenze in die nächste Puffer-Lösung überführt
zu werden, nicht erforderlich, da durch den rotierenden Permanentmagneten
ein zeitlich veränderliches Magnetfeld angelegt wird.
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Zur
Erzeugung des periodisch variierenden Magnetfeldes kann beispielsweise
ein rotierender NdFeB-Permanentmagnet eingesetzt werden, der mittels
eines Schrittmotors in eine gleichmäßige Rotation
versetzt wird. Dadurch kann sich das Magnetfeld in den Mikrokanälen
periodisch verändern, was die eingespülten magnetischen
Partikel einerseits während der Phasen starker Felder zur
Kanalwand zieht und andererseits die magnetischen Partikel während
phasenschwacher Felder nicht an der Wand immobilisiert. Die Strömung
der verschiedenen Flüssigkeiten, beispielsweise Pufferlösungen,
durch die Mikrokanäle kann durch entsprechendes Pumpen der
Flüssigkeiten in die jeweiligen Einlässe erreicht werden.
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Bei
Ausführungsbeispielen der Erfindung kann ein Rotationskörper
gesamt als Permanentmagnet ausgebildet sein. Bei alternativen Ausführungsbeispielen
kann ein Rotationskörper magnetische Abschnitte und nicht
magnetische Abschnitte aufweisen. Beispielsweise kann ein länglicher
Rotationskörper an einem Ende oder beiden Enden desselben Permanentmagneten
aufweisen. Wiederum alternativ könnte ein rotationssymmetrischer
Rotationskörper vorgesehen sein, beispielsweise in Form
einer Scheibe, der sektionsweise magnetische Abschnitte aufweist,
um ein zeitlich variierendes Magnetfeld in Fluidikstrukturen, in
denen magnetische Partikel gesteuert werden sollen, zu erzeugen.
Bei alternativen Ausführungsbeispielen könnte
das Magnetkraftelement einen oder mehrere rotierende Elektromagneten
aufweisen.
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Ein
Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung kann ein Mikrofluidiksystem sein, bei dem ein DNA-Extraktions-Assay
auf einem Polymerchip als ein Lab-on-a-Chip-System umgesetzt ist. Als
Pufferlösungen können dabei solche eines handelsüblichen
DNA-Extraktions-Kits verwendet werden, wobei zur Durchführung
dieses Assays drei Reaktionsstufen sowie zumindest drei unterschiedliche Puffer-Lösungen
erforderlich sind, wie dies beispielsweise Bezug nehmend auf 1 beschrieben
wurde.
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Eine
beispielhafte Implementierung, bei der entsprechende Kanalstrukturen
durch eine Mikrofräse in Polycarbonat gefräst
wurden, ist in 2 gezeigt. Die in 2 gezeigten
Strukturen liefern im Wesentlichen die gleiche Funktionalität,
wie sie oben Bezug nehmend auf 1 beschrieben
wurde. Wie in 2 gezeigt sind, sind Mikrokanäle
der Kanalstruktur des gezeigten Mikrofluidiksystems kreisförmig
um ein zentrales Magnetkraftelement, bei dem es sich wiederum um
einen rotierenden Permanentmagneten 10 handelt, angeordnet.
Der rotierende Permanentmagnet 10 lenkt die magnetischen
Partikel jeweils zum Zentrum hin ab, um die Position derselben in
der Kanalstruktur zu steuern.
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Über
einen Mikrokanal 102 werden die Probe, magnetische Partikel,
Lyse und ein Bindepuffer, der eine erste Pufferlösung darstellt,
zugeführt, wie durch einen Pfeil 100 angedeutet
ist. In einer ersten Reaktionsstufe werden die magnetischen Partikel durch
die Wirkung des Permanentmagneten 10 aufkonzentriert und
in einen Kanal 108 abgelenkt, während der Rest
des Bindepuffers sowie Verunreinigungen in einen Abfallkanal 110 fließen.
Die magnetischen Partikel sind in den 3a und 3b,
die Vergrößerungen der Abschnitte X und Y in 2 darstellen,
schematisch schraffiert dargestellt und mit dem Bezugszeichen 60 bezeichnet.
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Ein
Waschpuffer, der eine zweite Pufferlösung darstellt, wird über
einen Mikrokanal 106 zugeführt, wie durch einen
Pfeil 104 angedeutet ist. An einer Mündungsstelle 112 münden
die Kanäle 108 und 106 in einen Kanal 114,
wobei die über die Kanäle 106 und 108 zugeführten
Puffer eine Laminarströmung in dem Kanal 114 bilden.
Durch die Wirkung des zeitlich variierenden Magnetfelds, das durch
die rotierenden Permanentmagneten erzeugt wird, werden die magnetischen
Partikel zusammen mit der an denselben haftenden Probe über
die Phasengrenze zwischen dem Bindepuffer und dem Waschpuffer in den
Waschpuffer gezogen. Der Kanal 114 verzweigt sich dann
wiederum in einen Abfallkanal 116 und einen Probenkanal 118,
in den die magnetischen Partikel aufgrund des zeitlich variierenden
Magnetfelds abgelenkt werden. Die Überführung
der magnetischen Partikel und somit auch der Probe zu der zweiten
Reaktionsstufe erfolgt somit mit einer minimalen Menge der ersten
Pufferlösung, die mit der zweiten Pufferlösung
noch vor der zweiten Reaktionsstufe eine Laminarströmung
ausbildet.
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Wie
beschrieben wurde, werden in der zweiten Reaktionsstufe die magnetischen
Partikel wieder in den Kanal 118 abgelenkt und aufkonzentriert.
In dem Kanal 118 gelangen die magnetischen Partikel in
die dritte Reaktionsstufe, wie durch einen Pfeil 120 in 3b angedeutet
ist. In der dritten Reaktionsstufe werden wiederum sowohl eine dritte
Pufferlösung über einen Mikrokanal 122 als
auch eine vierte Pufferlösung über einen Mikrokanal 124 zugeführt,
die durch Pfeile 123 und 125 in den 2 und 3b angedeutet
ist. Die dritten und vierten Pufferlösungen werden wiederum
von entgegengesetzten Seiten zugegeben. Das im Waschpuffer enthaltene
Ethanol mischt sich schnell mit diesen beiden Puffern und es bildet
sich eine Laminarströmung aus. Durch das Mischen des Ethanol
mit der vierten Pufferlösung verringert sich die Ethanolkonzentration
auf der Seite der dritten Pufferlösung, so dass nachfolgend
eine Echtzeit-PCR-Analyse des Eluats, das die dritte Reaktionsstufe über
einen Mikrokanal 130 verlässt, erfolgen kann.
Der dritte Puffer stellt dabei einen Elutionspuffer dar, während
der vierte Puffer einen Verdünnungspuffer darstellt. Die
magnetischen Partikel werden durch das zeitlich variierende Magnetfeld, das
durch den rotierenden Permanentmagneten 10 erzeugt wird,
in der dritten Reaktionsstufe aus der zweiten Pufferlösung über
die Phasengrenze in die vierte Pufferlösung gezogen und
in den Mikrokanal 130 gelenkt. Die restlichen Pufferlösungen
verlassen die dritte Reaktionsstufe über einen Mikrokanal 132 beispielsweise
in ein Abfallbehältnis.
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Unter
Verwendung eines Mikrofluidiksystems, wie es Bezug nehmend auf die 2, 3a und 3b beschrieben
wurde, wurde erfolgreich eine Extraktion genomischer E. coli DNA durchgeführt.
Hierzu wurde die DNA mit einem handelsüblichen DNA-Extraktions-Kit
aus E. coli DH5αZ1 unter Verwendung des dargestellten Mikrofluidiksystems aufgereinigt.
Die Pufferlösungen des Kits wurden der Reihenfolge des
Protokolls nach durch die einzelnen Einlässe in das Mikrofluidiksystem
kontinuierlich mit einer Flussrate von 2 μl/s injiziert.
Als Magnetkraftelement wurde ein NdFeB-Permanentmagnet unterhalb
des Mikrofluidiksystems positioniert und mit einem Schrittmotor
in Rotation mit einer Frequenz von einem Hertz versetzt. Das Eluat
wurde gesammelt und anschließend außerhalb des
Mikrofluidiksystems erfolgreich mittels einer Echtzeit-PCR analysiert.
Die Analyse zeigte, dass PCR-Inhibitoren ausreichend verdünnt
bzw. komplett aus dem Eluat entfernt wurden.
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Zur
Herstellung der Kanalstruktur eignen sich alle Verfahren, die es
erlauben, Kanäle bzw. Mikrokanäle zu formen, wie
z. B. Fräsen, Prägen, Spritzguss, Tiefziehen und/oder Ätzen.
Geeignete Materialien können zur Herstellung verwendet
werden, wie z. B. Polycarbonate, Polymere, Kunststoffe, Keramiken,
Halbleitermaterialien, Gläser, Metalle und dergleichen.
Die in dem Trägerkörper geformten Mikrokanäle
können anschließend verschlossen, d. h. gedeckelt,
werden. Auch hier stehen unterschiedlichste Möglichkeiten
zur Verfügung, wie z. B. Lösungsmittelbonden,
thermisches Bonden, Klebeverbindungen oder das Aufkleben einer selbstklebenden Klebefolie.
Der Vorteil derartiger Methoden liegt in dem Potential, Mikrofluidiksysteme,
beispielsweise in der Form von Chips, als kostengünstige
Einmalartikel in hohen Stückzahlen fertigen zu können.
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Ein
alternatives Ausführungsbeispiel der Erfindung, bei dem
die Position magnetischer Partikel in Pufferlösungsströmungen
zwischen zwei Platten gesteuert wird, ist in den 4a und 4b gezeigt. Bei
diesem Ausführungsbeispiel ist eine Kanalstruktur 201 durch
zwei Platten 201 und 202 definiert, die mit einem
Abstand zwischen denselben aneinander befestigt sind, wie in 4b zu
erkennen ist. Zwischen den beiden Platten 201 und 202 existiert
somit ein Fluidbereich, der nach innen geschlossen sein kann und äußere
Auslässe aufweisen kann. In der oberen Platte 201 sind
vier Einlässe für vier verschiedene Flüssigkeiten
vorgesehen, von denen zwei in 4b mit
den Bezugszeichen 206 und 208 versehen sind. Flüssigkeiten,
wie z. B. Pufferlösungen, können in die Einlässe
injiziert werden, so dass sich laminare Flüsse nach außen
zu den äußeren Auslässen, von den zwei
in 4b mit den Bezugszeichen 207 und 209 bezeichnet
sind, ergeben, wie durch Pfeile 210 angedeutet ist. Vier
unterschiedliche Flüssigkeiten bzw. Pufferlösungen
P1, P2, P3, P4 sind in 4a dargestellt.
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Beispielsweise
kann eine der Flüssigkeiten eine Suspension mit einer Pufferlösung
und magnetischen Partikeln 60 sein, die in einen der Einlässe
eingebracht wird. Ein rotierbares Magnetkraftelement 212 ist
vorgesehen, beispielsweise in Form einer Scheibe 214, an
deren äußeren Enden ein oder mehrere Permanentmagneten 216 angeordnet
sind. Das Magnetkraftelement rotiert unterhalb der Kanalstruktur,
so dass die Kanalstruktur mit einem zeitlich variierenden Magnetfeld
beaufschlagt wird, um die Position der magnetischen Partikel 60 in
der Kanalstruktur 200 zu steuern. Dadurch können
die magnetischen Partikel beispielsweise nacheinander durch die
vier Pufferlösungen bewegt werden, wie durch einen Pfeil 218 in 4a angedeutet
ist.
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Gemäß den 4a und 4b fließen
somit Strömungen zwischen zwei parallelen Platten, wobei
die magnetischen Partikel durch ein Magnetfeld senkrecht zu den
Strömungen geführt werden.
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Alternativ
können die Ströme auch zwischen zwei Zylindermänteln
fließen, wie in den 5a und 5b dargestellt
ist. Eine Kanalstruktur 250 ist durch einen inneren Zylindermantel 251 und
einen äußeren Zylindermantel 252 gebildet.
Vier Einlässe, von denen zwei in 5b mit
den Bezugszeichen 254 und 256 bezeichnet sind,
sind vorgesehen, durch die vier Pufferlösungen P1 bis P4
in die Kanalstruktur 250 eingebracht werden können,
so dass sich in der Kanalstruktur vier laminare Ströme
(angedeutet durch Pfeile 262) von den Einlässen 254, 256 zu
Auslässen, von denen zwei mit den Bezugszeichen 258 und 260 bezeichnet
sind, ergeben. Mit einer der Pufferlösungen können
magnetische Partikel 60 in die Kanalstruktur eingebracht
werden, die sich mit den laminaren Strömen durch die Kanalstruktur
bewegen können. Die Position der magnetischen Partikel
kann durch zumindest ein rotierbares Magnetkraftelement, das innerhalb
des inneren Zylindermantels 251 angeordnet ist, gesteuert
werden, so dass die magnetischen Partikel wiederum durch mehrere
der Pufferlösungen bewegt werden können. Alternativ
oder zusätzlich können ein oder mehrere äußere
Magnetkraftelemente 272, 274 vorgesehen sein,
die um den äußeren Zylindermantel 252 bewegt
werden können, wie durch Pfeile 276 angedeutet
ist. Auch bei diesem Ausführungsbeispiel können
die magnetischen Partikel senkrecht zu den Strömungen geführt
werden, wie durch einen Pfeil 278 angedeutet ist.
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Bei
den Bezug nehmend auf die 4a, 4b, 5a und 5b beschriebenen
Ausführungsbeispielen werden die magnetischen Partikel durch
das zeitlich variierende Magnetfeld radial geführt.
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Die 6a und 6b zeigen
ein Ausführungsbeispiel, bei dem eine Mehrzahl von Magnetkraftelementen 300,
die auf einem Förderband 302 angeordnet ist, translatorisch
relativ zu einer Kanalstruktur 302 bewegbar ist, um ein
zeitlich variierendes Magnetfeld in der Kanalstruktur zu bewirken.
Zu diesem Zweck ist die Mehrzahl von Magnetkraftelementen auf einem
Förderband 304 angeordnet, das über zwei
Achsen 304 und 306 läuft, von denen zumindest
eine antreibbar sein kann, um das Förderband 304 mit
die Magnetkraftelementen 300 entlang einer Kanalstruktur 310 zu
bewegen, wie durch einen Pfeil 312 angedeutet ist. Eine
identische Struktur mit Magnetkraftelementen 300', einem
Förderband 304' und Achsen 306' und 308' ist
bei dem gezeigten Ausführungsbei spiel unterhalb der Kanalstruktur 302 vorgesehen.
Alternativ könnte nur eine der Strukturen vorgesehen sein.
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Die
Kanalstruktur 302 weist einen Einlass 320 und
einen Auslass 322 auf. Unterschiedliche Pufferlösungen
können in verschiedene Bereiche der Kanalstruktur 302 eingebracht
werden. Zu diesem Zweck sind vier Einlasskanäle 324, 326, 328 und 330 vorgesehen,
die sich in jeweilige Einlassteilkanäle mit geringeren
Flussquerschnitten verzweigen. Die Einlassteilkanäle münden
dann in verschiedene Bereiche der Kanalstruktur. Gegenüber
den Einlassteilkanälen münden Auslassteilkanäle
in die Kanalstruktur 302. Die Auslassteilkanäle
vereinigen sich, wie in 6a gezeigt
ist, zu Auslasskanälen 332, 334, 336 und 338.
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Über
die Einlasskanäle werden unterschiedliche Pufferlösungen
eingebracht, wie durch Pfeile 340 angedeutet ist. Über
die Auslasskanäle werden die Pufferlösungen ausgebracht,
wie durch Pfeile 342 angedeutet ist. Durch diese Einlass-
und Auslass-Kanalstrukturen bilden sich Laminarströme der
jeweiligen Pufferlösungen in den verschiedenen Bereichen der
Kanalstruktur 302 von den Einlassteilkanälen zu den
Auslassteilkanälen.
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Über
den Einlass 320 kann eine Suspension, die eine Pufferlösung
und magnetische Partikel 60 aufweist, in die Kanalstruktur
eingebracht werden, wie durch einen Pfeil 344 angedeutet
ist. Durch die Bewegung der Magnetkraftelemente 300 und 300' relativ
zu der Kanalstruktur 302 können bei diesem Ausführungsbeispiel
die magnetischen Partikel 60 definiert von links nach rechts
bewegt werden und somit nacheinander den verschiedenen Pufferlösungen
ausgesetzt werden.
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In 7 zeigt
eine schematische Darstellung zur Erläuterung eines weiteren
Ausführungsbeispiels. Eine Kanalstruktur 400 weist
Einlässe 402, 404, 406, 408, 410, 412 und 414 und
Auslässe 416, 418, 420 und 422 auf.
Die Kanalstruktur 400 weist ferner einen ersten Kanal 424,
einen zweiten Kanal 426, einen dritten Kanal 428 und
einen vierten Kanal 430 auf. Der erste Kanal 424 und
der zweite Kanal 426 sind über einen ersten Verbindungskanal 432 verbunden,
der zweite Kanal 426 und der dritte Kanal 428 sind über
einen zweiten Verbindungskanal 434 verbunden, und der dritte
Kanal 428 und der vierte Kanal 430 sind über
einen vierten Verbindungskanal 436 verbunden. Die Verbindungskanäle 432, 434 und 436 sind,
wie dargestellt ist, versetzt zueinander angeordnet. Ein Magnetkraftelement
und eine Einrichtung zum Erzeugen einer Relativbewegung zwischen dem
Magnetkraftelement und der Kanalstruktur 400 sind vorgesehen,
um eine Relativbewegung, wie sie durch eine Pfeil 440 in 7 dargestellt
ist, zu erzeugen. Das Magnetkraftelement und die Einrichtung zum
Erzeugen einer Relativbewegung sind in 7 der Einfachheit
halber nicht dargestellt.
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Im
Betrieb wird über den Einlass 402 eine Probe 450 zugeführt,
um eine Strömung 451. in dem Kanal 424 zu
bewirken. Über den Einlass 404 wird ein Lyse-Puffer 452 zugeführt.
Die Probe strömt entlang des Kanals 424, wobei
durch den Lyse-Puffer eine Lyse der Probe erfolgt, die durch eine
Heizung 454 unterstützt werden kann. Durch den
Einlass 406, der optional ist, kann ein Reinigungspuffer 456 zugeführt
werden. Durch den Einlass 408 werden magnetische Partikel 60 und
ein Bindepuffer zugeführt, so dass in der lysierten Probe
enthaltene Biomoleküle an den magnetischen Partikeln gebunden
werden. Die magnetischen Partikel strömen durch den Kanal 424 und
werden durch das Magnetfeld, das durch die Relativbewegung 440 erzeugt
wird, in den Verbindungskanal 432 abgelenkt. Eluat 490 verlässt
den Kanal 424 über den Auslass 416.
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In
den Einlass 410 wird ein Waschpuffer 460 eingebracht,
um eine Strömung 462 in dem Kanal 426 zu
bewirken. Durch das erzeugte Magnetfeld gelangen die magnetischen
Partikel in den Waschpuffer und werden entgegen der Strömungsrichtung
des Waschpuffers entlang des Kanals 426 und in den Verbin dungskanal 434 abgelenkt.
Abfall verlässt den Kanal 426 über den
Auslass 418. Über den Einlass 412 wird
ein Trockenpuffer 470 zugeführt, um eine Strömung 472 in
dem Kanal 428 zu bewirken. Durch das erzeugte Magnetfeld
gelangen die magnetischen Partikel in den Trockenpuffer 470 und
werden gegen die Strömungsrichtung des Trockenpuffers entlang des
Kanals 428 und in den Verbindungskanal 436 abgelenkt.
Abfall 459 verlässt den Kanal 428 über
den Auslass 420.
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Über
den Einlass 414 wird ein Eluierungspuffer 480 zugeführt,
um eine Strömung 482 in dem Kanal 430 zu
bewirken. Durch das erzeugte Magnetfeld gelangen die magnetischen
Partikel in den Eluierungspuffer und werden mit der Strömungsrichtung des
Eluierungspuffers und in einen Auslasskanal 484 abgelenkt.
Abfall 459 verlässt den Kanal 430 über den
Auslass 422.
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Die 8a bis 8c zeigen
schematisch, wie bei Ausführungsbeispielen der Erfindung
durch eine Relativbewegung zwischen Magnetkraftelement 500 und
Kanalstruktur 502 die Position von magnetischen Partikeln 60 in
der Kanalstruktur 502 gesteuert werden kann. Das Magnetkraftelement
nach einer Drehung ist jeweils mit dem Bezugszeichen 500' bezeichnet,
während die Partikel an der dadurch bewirkten Position
mit dem Bezugszeichen 60' bezeichnet sind. Die magnetischen
Partikel 60 ordnen sich entlang der Magnetfeldlinien, die
durch das Magnetkraftelement bewirkt werden, an, wodurch Partikelketten
bzw. Partikelstäbchen gebildet werden. Durch eine Rotation
des Magnetkraftelements 500 bewegen sich auch die Partikelkette
bzw. Partikelstäbchen, wie in den 8a bis 8c gezeigt
ist.
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Wie
in 8a gezeigt ist, wandern ohne äußere
Strömung in der Kanalstruktur 502 die magnetischen
Partikel an der Wand entlang nach links, siehe Pfeil 506,
bei einer Rotation des Magnetkraftelements im Uhrzeigersinn. Aufgrund
des Verlaufs der Magnetfeldlinien findet ein Kippen der Partikelkette statt,
Pfeil 507.
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Wie
in 8b gezeigt ist, wandern ohne äußere
Strömung in der Kanalstruktur 502 die magnetischen
Partikel an der Wand entlang nach rechts, siehe Pfeile 508,
bei einer Rotation des Magnetkraftelements gegen den Uhrzeigersinn.
Wiederum findet ein Kippen 509 statt.
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Wie
in 8c gezeigt ist, verbleiben bei einer äußeren
Strömung nach rechts, Pfeil 510, die magnetischen
Partikel an ihrer Position im Kanal bei einer Rotation des Magnetkraftelements 500 im
Uhrzeigersinn, wobei lediglich ein Verkippen 511 auftritt. Bei
einer äußeren Strömung von links nach
rechts würden die magnetischen Partikel bei einer Rotation des
Magnetkraftelements gegen den Uhrzeigersinn schnell nach rechts
wandern, da sie zusätzlich von der Strömung mitgetragen
würden.
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Die 9a und 9b zeigen
ein alternatives Ausführungsbeispiel, bei dem die Position
kleinerer sekundärer superparamagnetischer Partikel 600, die
eine Affinität zu Biomolekülen aufweisen, unter Mitwirkung
größerer primärer superparamagnetischer
Partikel 602, die nicht unbedingt eine Affinität zu
Biomolekülen haben müssen, gesteuert wird. Dabei
wird durch eine Relativbewegung zwischen einem Magnetkraftelement
und einer Kanalstruktur (die beide in 9a und 9b nicht
gezeigt sind) eine Bewegung und Magnetisierung des großen
superparamagnetischen Partikels bewirkt, durch die wiederum die
Position der sekundären Partikel 600, die durch
die primären Partikel angezogen werden, gesteuert werden
kann.
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Gemäß 9a bewirkt
das Magnetkraftelement eine langsame Bewegung des primären
Partikels 602, so dass die sekundären Partikel 600 angezogen
werden und keine Suspension der sekundären Partikel vorliegt.
Gemäß 9b wird
eine schnelle Bewegung, z. B. Drehung 604, des primären
Partikels durch das Magnetkraftelement bewirkt, so das eine Suspendierung
der sekundären Partikel stattfindet.
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Eine
Vorgehensweise, wie bezüglich der 9a und 9b beschrieben
wurde, kann vorteilhaft sein, da die kleineren sekundären
Partikel eine größere spezifische Oberfläche
für die Biomoleküle bieten. Ferner kann ein Vorteil
dann erreicht werden, wenn sich kleinere Partikel nicht so gut senkrecht
zu einer Strömung führen lassen. Größere
Partikel lassen sich leichter senkrecht zu einer Strömung
oder sogar gegen eine Strömung führen. Somit können kleinere
Partikel unter Mitwirkung größerer Partikel entsprechend
transportiert werden, wobei durch eine starke Bewegung der primären
Partikel die kleinen Partikel in Suspension gebracht werden können,
beispielsweise um besser in Kontakt mit Biomolekülen zu
kommen.
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Neben
rotierenden Magnetkraftelementen, wie z. B. Permanentmagneten oder
Elektromagneten, können somit Ausführungsbeispiele
der Erfindung eine Bewegung eines oder mehrerer Magnetkraftelemente
unter Verwendung eines Magnetförderbands bewirken. Dies
ermöglicht die Realisierung beliebig geformter Trennstrecken.
Bei alternativen Ausführungsbeispielen der Erfindung können
beliebige Einrichtungen vorgesehen sein, die eine Relativbewegung
zwischen einem oder mehreren Magnetkraftelementen und einer Kanalstruktur,
entlang oder senkrecht zu der Kanalstruktur, ermöglichen,
um diese mit einem zeitlich variierenden Magnetfeld zu beaufschlagen.
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Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung wurden oben anhand einer DNA-Extraktion beschrieben.
Es ist jedoch offensichtlich, dass die vorliegende Anmeldung auch
zur Handhabung bzw. Prozessierung von Biomelekülen in anderen
Anwendungsbereichen geeignet ist, wobei eine größere oder
geringere Anzahl von Reaktionsstufen, in denen die Position von
magnetischen Partikeln in einer Kanalstruktur gesteuert wird, vorgesehen
sein können.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung ermöglichen vorteilhaft einen kontinuierlichen
und automatisierten Betrieb eines Mikrofluidiksystems. Bisher gibt es
noch kein System, das kontinuierlich Biomoleküle mittels
Magnetophorese aufreinigen kann. Weiterhin ermöglichen
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung eine Vielseitigkeit,
da im Gegensatz zu bekannten Systemen Ausführungsbeispiele
der Erfindung nicht auf eine spezielle Anwendung beschränkt sein
müssen. Durch unterschiedliche Funktionalisierung der magnetischen
Partikel lassen sich unterschiedliche Biomoleküle aufreinigen,
ohne dass die Struktur verändert werden muss. Ebenso lassen
sich unterschiedliche Puffer durch die einzelnen Einlässe injizieren,
was mit der entsprechenden Funktionalisierung der magnetischen Partikel
die Umsetzung unterschiedlicher Assays ermöglicht.
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Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung können zur kontinuierlichen
Aufreinigung von DNA, RNA oder Proteinen verwendet werden. Weiterhin
können Immuno- und Zellbasierte Assays und Nachweise durchgeführt
werden. Im Grunde lassen sich unter Verwendung der vorliegenden
Erfindung alle biologischen Assays verwirklichen, bei denen die Zielsubstanz
an magnetische Partikel gebunden oder transferiert werden kann.
Hieraus ergeben sich vielfältige Anwendungsmöglichkeiten,
wie z. B. das Überwachen von Wachstum von Zellkulturen
in Bioreaktoren, der biologischen Sicherheit von Trinkwasser sowie
generell kontinuierliche Kontrollen auf molekularer Ebene.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 2007/0207548
A1 [0005, 0006]
- - US 2007/0190653 A1 [0005]
- - US 7138269 B2 [0005]
- - US 6632655 B1 [0005]
- - US 7364921 B1 [0007]
- - US 2006/0286596 A1 [0007]
- - US 7033473 B2 [0007]
- - US 2004/0009614 A1 [0008]
- - US 7384561 B2 [0009]
- - US 2008/0124779 A1 [0009]
- - US 2007/0231888 A1 [0010]
- - US 6467630 B1 [0010]
- - US 6383397 B1 [0010]
- - US 6132607 [0010]
- - US 5705064 [0010]
- - WO 2006/056579 A2 [0014]
- - US 5834303 [0015]
- - DE 10355460 A1 [0017]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - M. A. M. Gijs, „Magnetic
bead handling on-chip: new opportunities for analytical applications”,
Microfluidics Nanofluidics, Oct. 2004, S. 22–40 [0002]
- - Pamme N. et al., „Onchip free-flow magnetophoresis:
Continuous flow separation of magnetic particles and agglomerates”,
Anal. Chem., Bd. 76, Nr. 24, S. 7250–7256, Dec. 2004 [0003]
- - J. Pieper et al., „Clockwork PCR including sample
preparation”, Angewandte Chemie-International Edition,
Bd. 47, Nr. 21, S. 3900–3904, 2008 [0004]
- - U. Lehmann et al., „Droplet-based DNA purification
in a magnetic lab-on-a-chip”, Angewandte Chemie-International
Edition, Bd. 45, Nr. 19, S. 3062–3067, 2006 [0004]
- - E. P. Furiani et al., „A model for predicting magnetic
particle capture in a microfluidic bioseparator”, Biomedical
Microdevices, Bd. 9, Nr. 4, S. 450–463, Aug. 2007 [0005]
- - F. Lacherme et al., „Full on-chip nanoliter immunoassay
by geometrical magnetic trapping of nanoparticle chains”,
Anal. Chem., Bd. 80, Nr. 8, S. 2905–2910, Apr. 2008 [0005]
- - J. G. Lee et al. „Microchip-based one step DNA extraction
and real-time PCR in one chamber for rapid pathogen identification”,
Lab Chip, Bd. 6, Nr. 7, S. 886–895, 2006 [0011]
- - J. M. Park et al., „Multifunctional microvalves control
by optical illumination on nanoheaters and its application in centrifugal
microfluidic devices”, Lab Chip, Bd. 7, Nr. 5, S. 557–564,
2007 [0011]
- - M. Matsunaga et al., „Microfabricated devices for DNA
extraction toward realization of deep-sea in situ gene analysis”,
Oceans, Bd. 1, S. 89–94, 2004 [0015]
- - S. A. Peyman et al., „Rapid, multi-step bioassays on
the surface of mobile magnetic particles in continuous flow”, μTas
2008, S. 1114–1116 [0016]
- - L. R. Sasso et al., „Continuous microfluidic immunosensing
with antibody conjugated paramagnetic beads”, μTas
2008, S. 77–79 [0016]