DE10316159A1 - 5`-3`-Exonuklease Assay zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt den überraschenden Befund, dass in einer temperierbaren TIRF-Kammer eine enzymatische Verlängerung von Nukleinsäuresonden in Echtzeit messbar ist. Dazu werden an immobilisierte Nukleinsäuresonden längere, komplementäre Nukleinsäuremoleküle gebunden, diese dienen dann als Vorlage für eine enzymatische Verlängerung der immobilisierten Nukleinsäuresonden. Dabei wird gleichzeitig ein Lumineszenzsignal generiert. Durch Entfernen der Nukleinsäurevorlage und erneute Anlagerung an eine immobilisierte Nukleinsäuresonde kann dann Signal verstärkt werden. Das Signal kann erfindungsgemäß durch den Einbau von lumineszenzmarkierten Nukleotidtriphosphaten (z. B. Cy5-dUTP) erzeugt werden. Liegt die Nukleinsäurevorlage in unzureichender Menge vor, so kann diese durch enzymatische Amplifikation vermehrt werden. Diese Reaktion kann parallel durchgeführt werden, wobei die Amplifikation der Vorlage und die Extension der Nukleinsäuresonde erfindungsgemäß gleichzeitig im gleichen Kompartiment einer TIRF-Apparatur stattfindet. Zudem kann gleichzeitig die Zunahme der Fluoreszenz auf dem TIRF-Chip gemessen werden. Diese Methode erlaubt auch eine Quantifizierung der Nukleinsäurevorlage, wie die z. B. auch für den 5'-3'-Exonuklease-Assay beschrieben ist.

Description

• Heutzutage werden viele Nukleinsäureanalysen auf sogenannten DNA-Microarrays durchgeführt. Diese erlauben es bis zu mehreren 100000 Hybridisierungen gleichzeitig zu messen (De Vijver et al, 2002, New England Journal of Medicine Volume 347, No 25, Seite 1999–2009). Allerdings benötigen diese Messverfahren eine aufwendige Probenvorbereitung und ein sehr komplexes Sondendesign, da alle Sonden auf diesen Chips bei einer konstanten Temperatur die Bindung mit dem Analyt in spezifischer Weise eingehen müssen, d.h nur Nukleinsäureanalyte mit einer Homologie von > 95% binden. Deshalb ist es nicht verwunderlich, dass viele dieser DNA-Microarrays falsche Ergebnisse liefern, da es fast unmöglich ist eine so große Anzahl von Sondenmolekülen auch nur halbwegs geeignet zu berechnen. Eine Methode um die Abhängigkeit der Analysen vom Schmelzpunkt (Tm) der Nukleinsäuresonden unabhängig zu machen ist die Analyse von DNA-Microarrays in temperierbaren TIRF-Messgeräten ( EP 0001248948 ) wie z.B. der ATR-Reader der von der Fraunhofer Gesellschaft (FHG-IPM) entwickelt worden ist. Dieses Gerät arbeitet mit Prismenchips, in die das Anregungslicht für die Fluoreszenzdetektion mittels Totalreflektion in dem Chip geführt wird (optischer Wellenleiterchip). Die Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen mittels solcher optischen Wellenleiter wird TIRF genannt (Total Internal Reflection Fluorescence). Allerdings zeigt sich die Methode der ATR-Readeranalyse als relativ aufwendig, da hierbei die Schmelzkurven der Nukleinsäuren analysiert werden um dabei die sogenannten Schmelzpunkte (Tm) der Nukleinsäurehybride zu ermitteln ( DE 10309526.8 ). Dazu müssen die Schmelzpunkte von DNA-Sonden berechnet werden und anschließend experimentell nachbestimmt werden. Nachteilig auch bei dieser Methode ist, dass zur Generierung von Signalen relativ grosse Mengen an Analyt benötigt werden. Dieser Analyt wird normalerweise aus DNA-Proben per PCR vervielfältigt, ist der Analyt RNA werden entsprechende Amplifikationsmechanismen verwendet (z.B. RT-PCR). Bei diesen Amplifikationen wird meistens gleichzeitig eine Markierung des Analyten durchgeführt, in den z.B. Cy5-dUTP eingebaut wird. Eine Quantifizierung der ursprünglichen Ausgangskonzentration des Nukleinsäureanalyten einzelner Nukleinsäuren ist nach einer solchen Amplifikation nicht mehr möglich. Ein konkurrierndes Verfahren ist die Analyse von Nukleinsäuren mittels 5'-3'-Exonuklease-Assay. Dabei steht statt der Parallelisierung vielmehr die Quantifizierung der Konzentration spezifischer Nukleinsäuren im Vordergrund. Für die Real Time PCR werden für die Quantifizierung Sonden verwendet die am 5'-Ende mit einer Fluorophore und am 3'-Ende mit einem Quencher markiert sind. Die Sonde lagert sich während des „annealing" an den Analyten an. Während der Extension wird durch die Taq-Polymerase das Fluorophor tragende Nukleotid durch die 5'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase abgespalten. Die in die Flüssigkeit freigesetzten Fluorophoren-Menge wird dabei gleichzeitig quantitativ gemessen (Entsprechende Verfahrensschritte der PCR und der Real-Time PCR sind im Stand der Technik hinreichend beschrieben und z.B. folgenden Patentschriften zu entnehmen.: US 4,683,202 ; US 4,683,195 ; US 4,9665,188 ; US 5,210,015 ; US 5,487,972 ; US 5,538,848 ). Die Kombination von Enzym-vermittelten Verfahren der Molekularbiologie und DNA-Microarrays führt zu Anwendungen wie z.B. der Festphasen-PCR (Shoffner et al., 1996, Nucleic Acids Research 24(2): 380–385), Primer-Extension und der sogennanten NOC-PCR ( EP 1186669 ). Alle diese Verfahren sind zwar zum Analysieren von Nukleinsäuren geeignet, erlauben es jedoch nicht, den Gehalt einer spezifischen Nukleinsäure im Analyten auch nur annähernd zu bestimmen.
• Ein Hauptproblem der existierenden Verfahren ist der hohe Aufwand bei der Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen, da diese Analysen bisher nicht parallelisierbar sind, zudem ist der Automatisierungsaufwand sehr hoch, da keines der vorhandenen Systeme über normierte Fluidikschnittstellen verfügt. Ein bedeutender Nachteil von chipbasierenden Systemen ist die fehlende Quantifizierbarkeit kleiner Mengen von Nukleinsäureanalyten, insbesondere single copy RNA Molekülen.
• Die Lösung der angeführten Probleme stellt sich in der gleichzeitigen enzymatischen Vervielfältigung und Markierung der Analytnukleinsäure und dem Nachweis der synthetisierten neuen Nukleinsäuren an einer Festphase dar.
• Die Erfindung beschreibt den überraschenden Befund, dass in einer temperierbaren und biomolekülkompatibel beschichteten Flusszelle, die sich auf einem TIRF-Chip befindet, eine enzymatische Verlängerung von Nukleinsäuresonden in Echtzeit messbar ist. Das System besteht aus drei grundlegenden Modulen:
• a) Dem TIRF-Chip, in dem das Anregungslicht durch totale interne Reflektion geführt wird,
• b) der Flusszelle, die für Enzymreaktionen mit einer kompatiblen Polymerbeschichtung versehen ist und die in kurzen Taktzyklen geheizt und gekühlt werden kann und
• c) einer Detektionseinheit, vorzugsweise einer CCD-Kamera.
• Dabei ist es vor allem wichtig, dass die Flusszelle durch eine geeignete Beschichtung, wie z.B. Polyethylen, Polypropylen oder Polyethylenglycol, enzymatische Reaktionen nicht inhibiert, wie dies z.B. in metallischen Flusszellen stattfindet. An immobilisierte Nukleinsäuresonden werden mindestens eine Nukleinsäure längere, komplementäre Nukleinsäureanalyte gebunden, diese dienen als Vorlage für eine enzymatische Verlängerung der immobilisierten Nukleinsäuresonden verwendet und generieren dabei ein Lumineszenzsignal. Durch Entfernen der Nukleinsäurevorlage und erneute Anlagerung an eine immobilisierte Nukleinsäuresonde kann das Signal verstärkt werden. Das Signal kann erfindungsgemäß z.B. durch den Einbau von lumineszenzmarkierten Nukleotidtriphosphaten (z.B. Cy5-dUTP) erzeugt werden. Erfindungsgemässe Luminophore sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich: Cy-3, Cy-5, Fluorescein, Rhodamin, ROX, HEX, FAM, TAMRA, Amca. Luminenzenz umfasst auch aber nicht ausschließlich die Effekte der Phosphoreszenz und Fluoreszenz. Aber auch andere Verfahren der Lumineszenzmarkierung sind geeignet, wie z.B. die Färbung von Nukleinsäuredoppelsträngen mit interkalierenden Farbstoffen wie z.B. SyBr Green. Enzyme die für diese Methode geeignet sind sind beispielsweise, aber nicht auschließlich: thermostabile DNA-Polymerasen, DNA-Polymerasen im allgemeinen, RNA-abhängige DNA Polymerasen („reverse Transkriptasen"). Liegt der Nukleinsäureanalyt in unzureichender Menge vor, so kann diese durch enzymatische Amplifikation vermehrt werden. Diese Reaktion kann parallel durchgeführt werden, wobei die Amplifikation der Vorlage und die Extension der Nukleinsäuresonde erfindungsgemäß gleichzeitig im gleichen Kompartiment einer TIRF-Apparatur stattfindet. Methoden für eine solche Amplifikation sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Beispielsweise kann eine DNA-Probe durch PCR exponentiell vermehrt werden. RNA Proben können beispielsweise durch RT-PCR oder durch wiederholte reverse Transkription mit z.B. thermostabilen Enzymen vermehrt werden. Zudem kann gleichzeitig die Zunahme der Fluoreszenz auf dem Sensor-Chip gemessen werden. Diese Methode erlaubt auch eine Quantifizierung der Nukleinsäurevorlage, wie die z.B. auch für den 5'-3'-Exonuklease-Assay beschrieben ist. Ein Strang des gesuchten Analyten lagert sich während der annealing Phase der PCR an die immobilisierte Sonde an und kann somit als Vorlage für eine enzymatische Verlängerung dienen. Bei der anschließenden Verlängerung kommt es nicht nur zur Vervielfältigung des Analyten im Überstand, sondern auch zur Verlängerung der immobilisierte Sonde über die die erfindungsgemässe Detektion erfolgt. Werden nun nicht nur „normale" Nukleotidtriphosphate verwendet sondern auch zusätzlich lumineszenzmarkierte Nukleosidtriphosphate genutzt, so werden auch die lumineszenzmarkierten Nukleosidtriphosphate zur Extension der immobilisierten Sonde verwendet. Dadurch findet eine Anreicherung von Lumineszenzfarbstoffen im evaneszenten Feld des Wellenleiterchips (Sensorchip) statt. Durch die Wiederholung der Amplifikation findet eine weitere Anreicherung von Lumineszenzfarbstoffen an den immobilisierten Sondenmolekülen statt. Die Zunahme des Signals pro Amplifikationszyklus ist ein Maß für die Konzentration des Analyten.
• Das Heizen und Kühlen des Analyten auf dem Chip kann z.B. in einer temperierbaren Flusszelle stattfinden, wie in der EP 0001248948 beschrieben. Andere Verfahren wie z.B. induktive Heizung oder Widerstandsheizungen stellen ebenfalls erfindungsgemäße Ausführungen dar. Wichtig ist vor allem, daß das System in der Lage ist zu Heizen und zu Kühlen. Eine Kühlung kann nicht nur durch Peletierelemente, sondern auch durch andere, dem Fachmann hinreichend bekannten Methoden, wie z.B. Wärmeaustauscher und Kühlelemente durchgeführt werden.
• In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung befinden sich die Oligonukleotidsonden dabei an einer festen oder halbfesten Oberfläche an die diese mittels eines Spacers kovalent gebunden sind. Besonders bevorzugt sind dabei Spacermoleküle einer Länge von mindestens 7 nm, wobei der Spacer bevorzugt aus einem negativ geladenen oder ungeladenen Polymer besteht. Erfindungsgemäße Polymere sind beispielweise, aber nicht ausschließlich: Polyethylenglycol, Polythymidin, Polyuracil, Polyinosin Polysaccharide und Polyethylenoxid. Es können aber auch Mischpolymere und Blockcopolymere verwendet werden. Besonders bevorzugt sind dabei Polymere mit einer Länge von mindestens 10 Monomeren und/oder mindestens 7 nm Kettenlänge. Solche Polymere können beispielsweise durch Eintauchen von epoxyreaktiven Oberflächen in Polyethylenglycol und Erhitzen der eingetauchten Träger auf 60°C für 6 Stunden hergestellt werden. Andere Verfahren sind dem Fachmann hinreichend bekannt, wie z.B. „grafting-from" (WO 00/43539 A2) und „grafting-to" Polymerisationen ( EP 1132739 ).
• Erfindungsgemäße Farbstoffe stellen beispielsweise, aber nicht ausschließlich lumineszenzfarbstoffkonjugierte Desoxyribonukleinsäuretriphosphate, Di-Desoxyribonukleinsäuretriphosphate, Ribonukleinsäuretriphosphate sowie deren Analoge dar, sofern diese Analoge in der Lage sind von Enzymen zur Kettenverlängerung von Nukleinsäuresträngen eingesetzt zu werden. Weiterhin können statt Lumineszenzfarbstoffen auch sog. phosphoreszierende Farbstoffe verwendet werden. Solche Farbstoffe können als Moleküle, komplex gebundene Farbstoffe oder Nanopartikel, an die Nukleotidtriphosphate gebunden sein. Weiterhin können interkalierende Farbstoffe wie z.B. SyBr Green, Ethidiumbromid verwendet werden.
• Außer einer einfachen Flusszelle mit einem Zu- und Abfluss, wie bereits in der DE 10002566 beschrieben, kann die erfindungsgemäße Flusszelle sowohl kompartimentiert sein, als auch Strukturen im Lumen der Flusszelle aufweisen. Kompartimente können z.B. dazu dienen molekularbiologische Reaktionen unmittelbar vor der Analyse auf dem Chip durchzuführen, wie z.B. Polyerasereaktionen (PCR, Reverse Transkription) als auch andere Reaktionen wie z.B. Exonukleaseverdau (z.B. T7 Gen 6 Exonuklease) insbesondere aber auch nichtenzymatische Reaktionen (z.B. chemische Markierung). Kompartimente können aber auch rein physikalische Funktionen wie z.B. das Mischen von Flüssigkeiten oder das Temperieren von Flüssigkeiten aufweisen. Insbesondere kann die Analysefläche des Chips durch das Aufbringen einer kompartimentierten Flusszelle dazu benutzt werden, mehrere Analysen parallel durchzuführen. In einer besonderes bevorzugten Ausführung kann dabei jede Flusszelle durch einen eigenen Zufluss und Abfluss unabhängig angesteuert werden. Eine solche Flusszelle kann z.B. aus 8 Kompartimenten bestehen, von denen zwei nebeneinander und vier jeweils hintereinander angeordnet sind.
• Bei der Multiplex-PCR werden unterschiedliche Primerpaare zur Amplifikation der Analyten DNA verwendet. Hier können gleichzeitig unterschiedliche Targets analysiert werden. Bei der Multiplex-PCR wird die Amplifikation der Nukleinsäuren, wie dem Fachmann hinreichend bekannt, entsprechend in PCR Applications Manual, Boehringer veröffentlicht, durchgeführt. Dabei kann es sein, dass die individuellen Primerkonzentrationen der Effizienz des jeweiligen PCR-Systems angepasst werden müssen. Dabei wird die Konzentration der Primer von sehr effizienten Systemen relativ zu den Primerkonzentrationen weniger effizienter Systeme erniedrigt. Wird die PCR on Chip oder in einem dem Chip vorgeschalteten System durchgeführt, so ist die Verwendung des Uracil-DNA-Glycosylase Protokolls (PCR Applications Manual, Boehringer) vorteilhaft. Dabei wird bei der PCR anstatt dTTP dUTP in die Nukleinsäurekette eingebaut. Solche Moleküle können mittels des Enzyms Uracil-DNA-Glycosylase abgebaut werden. Auf diese Weise können Kontaminationen generell vermieden werden. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführung wird die PCR on Chip oder in einem vorgelagerten Kompartiment durchgeführt. Nach der Dekontamination der Kompartimente und des Chips, kann das System wiederverwendet werden, ohne dass Teile ausgetauscht werden müssen.
• Bei Hybridisierung an Festphasen, insbesondere bei der Verwendung einzelsträngiger Sonden, ist es vorteilhaft wenn der Analyt mindestens teilweise in Form einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle vorliegt. Erfindungsgemäß liegt dabei mindestens der den Sonden komplementäre Nukleinsäurestrang einzelsträngig vor. Normalerweise werden durch Aufschmelzen der doppelsträngigen DNA Einzelstränge hergestellt, hier konkurriert die Renaturierungsreaktion mit der Hybridisierung an der Festphasensonde. Dies kann durch eine bevorzugte Amplikation des komplementären Einzelstrangs durch eine asymmetrische PCR umgangen werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die komplementären Einzelstränge unterschiedlicher Ziel-DNAs in einer asymmetrische Multiplex-PCR durchgeführt. Selbstverständlich ist diese Methode für gängige PCR-Methoden, auch wenn diese hier nicht explizit aufgeführt sind, geeignet. Solche, dem Fachmann hinreichend bekannten Methoden sind zum Beispiel RT-PCR oder DOP-PCR (PCR Applications Manual, Boehringer).
• Nach einer emzymatischen Verlängerung eines Festphasenprimers kann es notwendig sein, die Primersequenzen zu regenerieren. Dazu gibt es verschiedene Möglichkeiten. Primer selbst können nukleaseresistent sein, z.B. durch die Verwendung von Phosphorothioatprimern oder anderer Modifikationen des Zuckerrestes. Die durch die Polymerisation hinzugekommenen Nukleotide können dann durch eine Exonuklease wieder entfernt werden. Eine andere Methode ist die Herstellung von apyrimidinischen Stellen durch die Verwendung von Uracil statt Thymidin und Entfernen des Uracils aus den DNA-Strang durch Uracil-DNA-Glycosylase. Die apyrimidinschen Stellen werden anschließend durch geeignete Enzyme (z.B. AP-Endonukleasen) gespalten um wieder 5'-OH-Reste für eine erneute Polymerisation zu generieren (Lindahl, T. 1982. "DNA-Repair Enzymes" Ann. Rev. Biochem. 51:61–87).
• In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Oligonukleotidsonden verwendet, bei denen Paare oder n-Tupel von Sonden vorliegen, die sich nur in der letzten, 5'-Base unterscheiden. Nur im Falle einer Übereinstimmung in diesem terminalen Bereich mit dem Analyten kann es zu einer Polymerisation kommen. Dieses Verfahren ist besonders zum Nachweis von sog. "Single Nucleotide Polymorphismen" (SNPs) geeignet. Die Untersuchung solcher SNPs ist z. B. für die Transplantationsmedizin (HLA-Analytik) und die Xenobiotikaelimination (P450-Isoenzymanalyse) von Bedeutung.
• Beispiel 1
• Die reverse Transkription der mRNA wird mit Hilfe einer thermostabilen reversen Transkriptase (Tth-Polymerase) durchgeführt. 2–4μg RNA werden in einer Flusszelle des ATR-Readers auf einem TIRF-Sensorchip in einem 40μl Probenansatz aufgeschmolzen (70°C, 10min). Zugefügt sind Standardreagenzien: 4μl 5-fach Erststrangpuffer, 2μl 0,1M DTT, 1μl dNTP-Mix (je 10mM dATP, dCTP, dGTP, und dTTP in TE-Puffer gelöst, 10mM Cy5-dUTP) und 200 Units reverse Transkriptase zugegeben. Die spezifischen Primer sind als Oligonukleotidsonden auf dem Chip immobilisiert. Die Nukleinsäuren werden mit der reversen Transkriptase an den immobilisierten Sonden elongiert und dabei der Lumineszenzfarbstoff eingebaut. Zur Amplifikation des Signals wird die Template DNA wieder abgeschmolzen und der Schritt der Elongation an der Festphase wiederholt. Bei jedem Schritt wird das Lumineszenzsignal gemessen und abgespeichert.
• Beispiel 2
• Die Amplifikation des Analyten wird mit spezifischen Primer und einer Taq-Polymerase (Qiagen) durchgeführt. In 40μl Probenansatz sind Standard-Reagenzien zugefügt: 1μl der genomischen Proben-DNA (500ng/μl), 4μl Standard-PCR-Puffer, 1μl dNTP-Mix (je 10mM dATP, dCTP, dGTP, und dTTP in TE-Puffer gelöst, 10mM Cy5-dUTP), je 5μl spezifische Primer (200nm), 0,3μl Taq-Polymerase, der gesamte Ansatz wurde mit Aq. dest auf 40μl aufgefüllt. Das komplette Probengemisch wird bei Raumtemperatur in die Flusszelle injiziert. Anschließend wird durch Erhitzen auf 94°C für 10min der Inhibitor von der Taq-Polymerase abgespalten und die Proben-DNA denaturiert. Die spezifischen Primer sind als Oligonukleotidsonden auf dem Chip immobilisiert. Die Nukleinsäuren werden mit der Taq-Polymerase an den immobilisierten Sonden elongiert und dabei der Fluoreszenzfarbstoff eingebaut. Zur Amplifikation des Signals wird die Template DNA wieder abgeschmolzen und der Schritt der Elongation sowohl an der Festphase wie auch im Überstand wiederholt. Bei jedem Schritt wird das Lumineszenzsignal gemessen und abgespeichert. Die Heiz-Kühlschritte werden 40 mal wiederholt.
• Beispiel 3
• Die Quantifizierung von Daten die mittels des 5'-3'-Polymerase Assays aus Beispiel 2 gewonnen werden findet folgendermaßen statt. Die Fluoreszenzaufnahmen aus dem Messgerät werden analysiert und die Fluoreszenzsignale der Oligonukleotide werden durch aufintegrieren quantifiziert. Über den Abgleich mit einem Datenfile wird den gemessenen Punkten eine Zuordnung zu einer Sequenz zugeteilt. Diese Daten werden nach jedem Temperaturschritt erhoben. Im Falle einer Signalgenerierung nimmt das Signal nach jedem Schritt zu. Unspezifische Signale weisen diese Eigenschaft nicht auf. Aus den jeweiligen Signalen wird ein Graph erstellt der die Signalhöhe gegen die Zyklenzahl der Amplifikation aufträgt. Aus den Daten dieser Kurven lässt sich die ursprüngliche DNA-Menge exakt bestimmen. Entsprechende Verfahren sind als Real-Time-PCR Technik dem Fachmann hinreichend bekannt und stellen keine mathematischen Probleme dar.
• Beispiel 4
• Zur Abarbeitung großer Probemengen wird an den TIRF-Apparat ein Pipettierroboter angeschlossen, der in der Lage ist, die Proben aus Mikrotiterplatten zu entnehmen und mit den Polymerasereagenzien zu vermischen. Zum geeigneten Zeitpunkt werden die Proben bei Raumtemperatur aus der Mikrotiterplatte entnommen und mit den vorgekühlten Reagenzien, kurz vor der Injektion in die Flusszelle, vermischt. Die vorgekühlten Reagenzien werden aus einem Kühlkompartiment der Apparatur automatisch zugeführt. Die Durchmischung erfolgt in einer Mischkammer durch Injektion der Flüssigkeiten und Hin- und Herbewegen entlang eines Möbiusmischers. Nach erfolgter Mischung wird das Reaktionsgemisch in die Flusszelle injiziert. Es erfolgt die Analyse wie in Beispiel 2 beschrieben. Anschließend wird die Apparatur mit einem tensidhaltigen Puffer, tensidfreiem Puffer und Puffer mit Uracil-DNA-Glycosylase gespült. Dabei wird die Apparatur auf 37°C geheizt. Die resultierenden abasischen Stellen der DNA-Stranges werden dann durch Zugabe einer AP Endonuklease gespalten, so dass die Oligonukleotidstränge wieder durch DNA-Polymerasen verlängert werden können. Bei Bedarf wird anschließend wird der TIRF-Chip, ausgewechselt. Im Normallfalle ist dies aber nicht nötig. Die Apparatur ist nun zur nächsten Messung bereit.

Claims (18)

1. Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuren umfassend: (a) Inkubation von einer zu analysierenden Nukleinsäure oder eines Nukleinsäuregemisches mit einem Enzym, das in der Lage ist Nukleinsäuren zu polymerisieren in Anwesenheit benötigter Kofaktoren in einer Flusszelle (b) Polymerisieren von Nukleinsäuren in Anwesenheit mindestens eine Lumineszenzfarbstoffes, der bei der Polymerisation in den Nukleinsäurestrang eingebaut oder angelagert wird. (c) Nachweis der Polymerisation auf einem optischen Wellenleiterchip, wobei auf dem Wellenleiterchip Nukleinsäuremoleküle aufgebracht sind, die durch die Polymerisationsreaktion verlängert werden, wobei in diese Nukleinsäuremoleküle Lumineszenzfarbstoffe eingebaut oder angelagert werden und das Lumineszenzsignal dieser Farbstoffe gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass durch Wiederholung des Polymeraseschrittes die Signalgenerierung erhöht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach jedem Polymeraseschritt das Signal gemessen und quantifiziert wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine RNA abhängige DNA-Polymerase ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Poymerasereaktion durch Heiz-Kühlschritte mehrfach hintereinander durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse eine Quantifizierung der Menge/Konzentration der zu untersuchenden Nukleinsäuremoleküle darstellt, bei der nach jedem Polymerisationsschritt die Zunahme der Lumineszenz an der Festphasensonde gemessen wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerasereaktion parallel durch die Verwendung mehrerer Primersequenzen in einem Kompartiment stattfindet.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Polymerasereaktion bevorzugt einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle liefert.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Poylerasereaktion in Anwesenheit von dUTP anstatt dTTP durchgeführt wird und nach erfolgter Reaktion die Reaktionsprodukte mittels Uracil-DNA-Glycosylase abgebaut werden.
11. Vorrichtung zum Analysieren von Nukleinsäuren umfassend: (a) Einrichtung zur Inkubation von einer zu analysierenden Nukleinsäure oder eines Nukleinsäuregemisches mit einem Enzym, das in der Lage ist Nukleinsäuren zu polymerisieren in Anwesenheit benötigter Kofaktoren in einer Flusszelle (b) Einrichtung zum Polymerisieren von Nukleinsäuren in Anwesenheit mindestens eine Lumineszenzfarbstoffes, der bei der Polymerisation in den Nukleinsäurestrang eingebaut oder angelagert wird. (c) Optisches System zum Nachweis der Polymerisation auf einem optischen Wellenleiterchip, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Wellenleiterchip Nukleinsäuremoleküle aufgebracht sind, die durch die Polymerisationsreaktion ebenfalls verlängert werden, wobei in diese Nukleinsäuremoleküle Lumineszenzfarbstoffe eingebaut oder angelagert werden und das Lumineszenzsignal dieser Farbstoffe durch TIRF-Anregung gemessen wird.
12. Vorrichtung zum Analysieren von Nukleinsäuren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichne, dass es zusätzlich ein System zum Auswerten und Quantifizieren der gemessenen Lumineszenzsignale aufweist
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12 bei der die Flusszelle aus mindestens zwei identischen Kompartimenten zur Durchführung parallele Analysen besteht.
14. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12 bei der die Flusszelle aus mindestens zwei verschiedenen Kompartimenten mit unterschiedlichen Funktionen besteht.
15. Vorrichtung nach Anspruch 11 bis 14, bei der die Flusszelle mit einem inerten Polymer beschichtet ist.
16. Vorrichtung nach Anspruch 11 bis 15, bei dem der TIRF-Wellenleiter mit einem Polymerspacer von mindestens 7 nm Länge versehen ist
17. Verfahren zum Regenerieren von festphasengebundenen Primersequenzen umfassend: (a) Verlängern der Primer in Anwesenheit von dUTP (b) Behandeln der verlängerten Primersequenzen mit Uracil-DNA-Glycosylase (c) Spaltung der abasischen Stellen des DNA-Stranges zur Regenerierung der Primersequenz
18. Verfahren zum Analysieren von Punktmutationen dadurch gekennzeichnet dass (a) Auf einem Wellenleiterchip Oligonukleotidsonden, welche die zu untersuchenden Basen komplementären Basen in ihren 5'-terminalen Positionen aufweisen immobilisiert sind und (b) Diese zu der Sequenz der zu untersuchenden Nukleinsäuren ansonsten homolog sind und (c) Diese Sequenzen auf den TIRF Wellenleiterchips mit einem Nukleinsäureanalyten hybridisiert werden und (d) An diesen Hybriden dann mittels einer DNA-Polymerase die Sondensequenz verlängert wird und (e) Die gebildeten Nukleinsäuresequenzen mittels Lumineszenzfarbstoffen durch TIRF nachgewiesen wird