WO2004044240A2 - Verfahren zum parallelen nachweis unterschiedlicher nukleinsäuren - Google Patents

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WO2004044240A2
WO2004044240A2 PCT/EP2003/012694 EP0312694W WO2004044240A2 WO 2004044240 A2 WO2004044240 A2 WO 2004044240A2 EP 0312694 W EP0312694 W EP 0312694W WO 2004044240 A2 WO2004044240 A2 WO 2004044240A2
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primer
nucleic acid
complementary
primers
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Dirk Kuhlmeier
Anja Weiland
Hans Kosak
Jörg HASSMANN
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November Aktiengesellschaft
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    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/107—Probe or oligonucleotide ligation

Definitions

  • the invention relates to a method for the parallel detection of different nucleic acids and a kit suitable for carrying out the method.
  • a diagnostic primer essentially complementary to a diagnostic part of a nucleotide sequence to be detected is only extended in a primer extension reaction if the terminal nucleotide of the diagnostic primer is complementary to the corresponding nucleotide in the diagnostic part.
  • the product of the extension serves as a template in an amplification reaction carried out with a pair of primers.
  • the presence or absence of the nucleotide sequence to be detected is demonstrated by the presence or absence of an amplification product.
  • the amplification products can be detected by gel electrophoresis. For this it is necessary that the amplification products can be identified specifically by their length or a specific marking. Therefore, the method only allows the detection of a very limited number of different amplification products in the case of several detection reactions to be carried out in parallel. Another disadvantage of this method is that it is relatively complex, especially when there is a large number of documents.
  • the precipitation, for example radioactive, labeled amplification products is indicated as a further detection method. Only as many amplification products can be detected in parallel as can be distinguished from one another based on their specific labeling.
  • a method for the parallel detection of nucleic acids is known from WO 00/58516.
  • a solution that contains potentially detectable nucleic acids is brought into contact with a plurality of primers.
  • the primers each have a 3 '-oriented first section specific for a nucleic acid to be detected and a 5' -oriented second section which can be clearly identified by hybridization.
  • the primers are brought into contact with the nucleic acids to be detected under conditions under which a specific hybridization can take place.
  • hybridized primers are each extended by a specifically labeled nucleotide. This makes it possible to differentiate between nucleic acids to be detected, which differ in the complementary nucleotide.
  • the primer extension products are brought into contact with a matrix, on the surface of which complementary oligonucleotides are immobilized at defined positions to the second sections.
  • the extended primers are specifically detected by their location on the matrix and their specific labeling.
  • the method can be used for the detection of nucleic acids which differ only in one nucleotide.
  • the disadvantage is that the process is not very sensitive. It is also disadvantageous that specifically labeled nucleotides are required.
  • the sequence of the appendix leads to complementary sequences of a single amplification product, derived from the sequence of the appendix, hybridizing with one another and thereby forming a kind of "pan handle” structure.
  • the hybridization prevents the annealing of further primers to the attachment and thereby avoids the production of undesired PCR products.
  • the PCR products are detected by gel electrophoresis. This is complex and only allows the detection of a very limited number of PCR products in reactions carried out in parallel in a PCR.
  • a method for the detection of a nucleic acid is known from US Pat. No. 5,849,544.
  • a catcher probe is immobilized on a vessel wall.
  • the nucleic acid to be detected is amplified, for example by a PCR.
  • a label to be detected for example a biotin group, is also incorporated into the amplification product.
  • the capture probe has a nucleic acid sequence which can hybridize with at least part of the amplified target nucleotide sequence.
  • the amplified target nucleotide sequence is brought into contact with the capture probe under conditions that allow the capture probe to bind to the amplified target nucleotide sequence.
  • the bound amplified target nucleotide sequence can be detected using the labeling substance.
  • a chip which contains capture probes on a surface which are specific for certain virus sequences.
  • the chip enables the detection of specific products of a multiplex PCR.
  • Multiplex-PCR uses a mixture of different primers, each of which is specific for a sequence to be amplified. Detection of trapped probes PCR products are made optically by a change in the color of a light reflecting from the surface caused by the binding and an enzyme-catalyzed reaction.
  • a disadvantage of this method is that the use of specific primers for each of the sequences to be detected enables these sequences to be reproduced with different efficiency.
  • Catcher probe known. After hybridization of the nucleic acid to be detected with the capture probe, the hybridized DNA is brought into contact with a transition metal complex which is able to oxidize a predetermined base in the capture probe. The redox reaction is electrochemically detected and compared with a redox reaction of the single-stranded probe. If the determined reaction rates differ from each other, this indicates a hybridization.
  • DE 199 34 084 AI discloses a method for labeling and characterizing DNA fragments.
  • a PCR is carried out.
  • Three primers are used in the PCR, two of which are sequence-specific oligonucleotide primers.
  • One of these oligonucleotide primers is equipped with an adapter provided sequence that is homologous to the oligonucleotide sequence of the third primer.
  • the third primer has a labeling substance and serves to generate amplification products with a label.
  • the disadvantage of this method is that when it is carried out simultaneously with several DNA fragments to be characterized under uniform conditions, different amplifications of the different DNA fragments can occur due to different binding kinetics of the primers.
  • the object of the present invention is to provide a method and a kit for the detection of a nucleic acid which avoids the disadvantages of the prior art.
  • the method should be able to be carried out with simple means and be highly sensitive.
  • the method should enable the parallel detection of a large number of different nucleotide sequences under uniform conditions and in particular in a common reaction mixture.
  • a method for the parallel detection of different nucleic acids S is provided with the following steps:
  • the first primer (Pl) having a 5 '-end first section (tl) and a 3' -end second section (t2) and the second primer (P2) a 5 '-endstand has a third section (t3) and a 3 '-terminal fourth section (t4),
  • sequences of the second (t2) and fourth section (t4) are selected such that the second section (t2) with a predetermined first section of the one nucleic acid S under defined first conditions and the fourth section (t4) with one predetermined second section of a nucleic acid S 'complementary to a nucleic acid S can be hybridized under defined second conditions and can be extended enzymatically and
  • each of the second (t2) or fourth section (t4 ) is specific for exactly one of the nucleic acids S,
  • first primer extension products each serve as a template and the respective second (P2) or first primer (P1) under the first or second conditions required for their specific hybridization with the respective first primer extension products to form a second one Primer extension product are extended,
  • the sequences of the third (P3) and fourth primer (P4) are each selected such that the third primer (P3) each has a sequence complementary to the first section (tl) and the fourth primer (P4) each has a sequence to the third section (t3) specifically hybridize complementary sequence under defined third conditions and can be extended enzymatically,
  • the first, second, third and fourth conditions include e.g. B. certain temperatures or concentrations, for example.
  • a primer The first and second conditions are preferably identical. Performing the first primer extension reaction according to step lit. b and the second primer extension reaction according to step lit. c can be done simultaneously.
  • the first and the third subsection are chosen such that under the first or second conditions they essentially do not hybridize with the nucleic acid S or the nucleic acid S 'complementary thereto. Furthermore, the first and the third subsection are preferably selected such that they do not have any secondary structures which interfere with the method, such as, for. B.
  • hairpin grinding form and have a similar melting temperature, a length of 16 to 28 nucleotides, no complementary to each other, especially at the 3 'ends, a balanced GC ratio and at the 3' end no GC rich regions , Selection criteria for the choice of sequences are in the prior art, for. B. from Michael A. Innis, David H. Gelfand and John J. Sninsky, PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, San Diego, CA, USA (1999).
  • the first and third subsections have the same length or differ in their length by at most 20%. This enables the specific annealing temperatures to be achieved of the third primer hybridizing with the sequence complementary to the first section and the fourth primer hybridizing with the sequence complementary to the third section are relatively close to one another. The closer the annealing temperatures are to each other, the more efficient the PCR can be according to step lit. e be carried out.
  • the probe can in each case be a nucleic acid or an analogue of a nucleic acid such as PNA.
  • An analogue of a nucleic acid is understood here to mean any structure which can hybridize specifically with the intermediate section z or the intermediate section z 'which is complementary thereto.
  • the probes can e.g. B. be immobilized on a membrane.
  • the third primer extension products binding or bound to the probes can be identified by knowing the position in which a probe is immobilized and the location of the hybridization being detected.
  • the probes can also be part of a chip.
  • a chip is understood to mean a solid, rigid surface on which one of the probes is immobilized at a defined position. Additional probes can each be immobilized on the surface at other defined positions.
  • the third primer extension product hybridized with the respective probe can be identified by determining the location of the hybridization.
  • the method extends first or second primers which have the intermediate section z.
  • the fact that the intermediate section z is specific for the second or fourth partial section means that a specific intermediate section z can be uniquely assigned to a specific second or fourth partial section.
  • the intermediate section z or the complementary intermediate section z ' is by means of third and fourth primers amplified specifically. By hybridizing the intermediate section z or the complementary intermediate section z 'with one of the probes in step lit. g Extension products of the third or fourth primer are specifically bound to one probe and can be detected there during or after the binding.
  • each intermediate section z can be assigned to exactly a second or fourth section and each second or fourth section is specific for exactly one of the nucleic acids S, an assignment of each intermediate section z or each complementary section z 'to one of the nucleic acids S is possible , The specific detection of primer extension products containing the intermediate section z or the intermediate section z 'makes it possible to determine whether nucleic acids S which hybridize specifically are present in the solution with the second or fourth partial sections.
  • the particular advantage of the method according to the invention is that the intermediate section z can provide an almost unlimited number of specific identifiers for primers. This enables parallel, specific detection of a large number of nucleic acids.
  • the PCR in step lit. e achieved exponential amplification of the intermediate section z or the complementary intermediate section z ', a high sensitivity is achieved.
  • a parallel detection of a plurality of nucleic acids has hitherto been possible by means of a parallel amplification of these nucleic acids in a PCR approach, a so-called multiplex PCR. Because of the high total concentration of primers required, this can lead to the formation of primer dimers and thereby to an inhibition of the desired PCR Reactions come.
  • a parallel detection of a plurality of nucleic acids by means of multiplex PCR has therefore been limited to the detection of fewer nucleic acids with a few primer pairs.
  • the nucleic acids In the case of parallel detection of a plurality of nucleic acids by means of multiplex PCR, the nucleic acids have hitherto usually been multiplied unevenly. In the case of non-uniform duplication, the amounts of the amplification products generated can differ so much from one another that the minimum amount required for detection has not yet been generated for individual nucleotide sequences, while other nucleotide sequences are already clearly detectable.
  • the reason for the uneven replication can be that, due to the exponential increase in PCR, even small differences in the efficiency of the different primers have a strong impact on the amount of products formed.
  • the efficiency of the primers is determined in particular by the length of the primers and the binding kinetics with which the primers bind to the nucleic acid to be detected.
  • first and second primer extension reactions only have to be carried out once or a few times. Because there is no need for exponential amplification, detection reactions carried out a different efficiency between different first primer pairs in the first and second primer extension reaction only slightly on the amount of the third primer extension products.
  • the second pair of primers can be designed independently of the sequence of the nucleic acid S to be detected. This allows second pairs of primers to be provided with uniform efficiency in the PCR.
  • all first primer pairs can have a first primer with a uniform first partial section and a second primer with a uniform third partial section.
  • step lit. d to provide a common second pair of primers for all nucleic acids S to be detected and thus in step lit.
  • step lit. e perform a PCR.
  • the primers can be designed in such a way that the detection can be carried out under uniform conditions. Furthermore, it is advantageous that once determined conditions for hybridizing the intermediate section z or the complementary intermediate section z 1 with the probe can be used for various detection reactions.
  • the intermediate section z can be combined in different first or second primers with different second or fourth sections. This can, for. B. a different immobilized probes having chip are provided. With the sequences of the probes and the intermediate sections z, the chip can be optimized for the inventive method and used to detect different nucleic acids S.
  • the first and second primer extension reactions are preferably carried out as PCR. As a result, these primer extension reactions can be carried out with enzymes and nucleotides which are required for carrying out the PCR in step lit. e are required. This simplifies the process, because only once enzymes and nucleotides have to be added.
  • first and / or second primer extension reaction and / or PCR is carried out under so-called hot start conditions.
  • the temperature of the reaction mixture is increased and it is ensured that a DNA polymerase used only extends the first, second, third and / or fourth primers when the temperature in the reaction mixture has reached at least the temperature required for specific annealing of these primers. That can e.g. This ensures, for example, that for the first and / or second primer extension reaction and / or PCR the DNA polymerase is only added to the respective reaction mixture after this temperature has been reached or by using a polymerase which is only activated by heating. This prevents the non-specifically binding first, second, third or fourth primer from being extended.
  • the first primer extension reaction under the first conditions and / or second primer extension reaction under the second conditions is carried out at most 10 times, preferably at most 5 times, in particular at most 2 times. This does not mean that the first and / or second primer extension reaction does not take place more than 10, 5 or 2 times in total, but that it is only at most 10, 5 or 2 times below that for a specific and efficient first and / or second primer extension reaction cheap first and / or second condition is carried out.
  • the third conditions can be selected by appropriately designing the sequences of the first (tl) and third sections (t3) such that they are suitable for the first and / or second primer extension reaction are unfavorable, so that overall a low number of first and / or second primer extension reactions takes place.
  • a low number of first and / or second primer extension reactions has the effect that, in the case of a plurality of detection reactions carried out in parallel in one reaction batch, there is hardly any effect on the amount of third primer extension products formed if the first and / or second primer extension reactions proceed with different efficiency.
  • the sequences of the first and third sections are selected such that the third conditions can be so stringent that the second section with the first section of the one nucleic acid S and the fourth section with the second section of the to the one nucleic acid S complementary nucleic acid S 'essentially not hybridized under the third conditions.
  • This makes it possible to carry out the reaction in an approach which contains the first, second, third and fourth primers from the outset.
  • the first and second primer extension reaction can then be ended and there is only an extension of the third and fourth primers in the PCR, although the first and second primers are still included in the batch.
  • the step lit. e can be carried out in the solution. It is not necessary to remove the first primer extension products from the solution and to transfer them to another solution. At least the steps lit. a to lit. e, in particular the steps lit. a to lit. h carried out in a closed vessel, which is between the
  • Steps is not opened. This avoids contaminations that falsify the result. Furthermore, the use of a closed vessel simplifies the handling and automation of the process.
  • the concentration of the first or second primer containing the intermediate section z in the solution is chosen to be so low that this primer hybridizes the probe with the respective intermediate section z or the complementary one
  • Intermediate section z 'of the third primer extension products in step lit. g is not significantly inhibited. Not significantly inhibited means that the hybridization in step lit. g in a for the proof in step lit. h sufficient extent takes place.
  • le can be largely prevented that such a primer in step lit. g competes with the extension products of the third or fourth primers for binding to the probe.
  • the hybridization of the probe with the intermediate section z 'complementary to the intermediate section z' is inhibited by hybridizing the intermediate section z 'with this primer. This significantly simplifies the process. Removal of an excess from the first or second primers containing the intermediate section z is not necessary.
  • the low concentration can also essentially prevent a signal that is actually used for detection from being triggered by hybridization of one of the primers mentioned with the probe.
  • a low concentration of the first pair of primers can also prevent the formation of dimers from first and second primers.
  • the concentration of the first pair of primers in the solution is preferably set to 0.001 to 0.1 ⁇ mol / 1. It is advantageous if the ratio of the concentrations of the first pair of primers to the second pair of primers is less than 1:10, preferably less than 1: 100, particularly preferably less than 1: 1000. The smaller the ratio, the less the intermediate section z of the first or second primer competes with the extension products of the third or fourth primer for binding to the probe or with the probe for binding to the intermediate section z 'complementary to intermediate section z.
  • the second pair of primers can be added to the solution prior to the first primer extension reaction. This simplifies the procedure. As a result, no pipetting steps are required between the first and the second primer extension reaction.
  • the performance of the first or second primer extension reaction can only be controlled via temperature.
  • the third or fourth primer is extended more often than the other primer of the second pair of primers. That can e.g. B. can be achieved by in the step lit. d provided second primer pair, the third or fourth primer is present in a, preferably 2- to 5-fold, excess over the respective other primer contained therein. Under these asymmetrical conditions, the extension product binding to the probe can be formed in excess over the other extension product of the third or fourth primer. As a result, hybridization of the extension products of the third and fourth primers with one another, which competes with the hybridization with the probe, can be significantly reduced, so that a larger proportion of the third primer extension products binds to the probe. This can improve the sensitivity of the detection or enable a stronger signal during detection.
  • the method is more efficient and economical because only one of the two third primer extension products formed is required for detection.
  • Another advantage is that the PCR products formed are not processed before step lit. g must be denatured to enable hybridization with the probes, because only a part of the intermediate sections z binding to the probe or complementary intermediate sections z 'hybridize with their in the PCR according to lit. e formed counter strand is present. If denaturing is dispensed with, it often becomes accidental existing refolded sequences not denatured. As a result, these sequences cannot compete with the intermediate sections z or the complementary intermediate sections z 'for a specific hybridization on the probes. This increases the sensitivity and specificity of the detection. If denaturing, which is usually carried out by heating, does not take place, electrodes used, for example, for electrochemical detection are also less stressed and therefore have a greater durability.
  • a plurality of first primer pairs can be added to the solution, the first primers of which each have an identical or almost identical first section and / or whose second primers have an identical or nearly identical third section and whose second or fourth section is specific for exactly one of the nucleic acids S. is. Sections are almost identical if the same primers can hybridize with them. This makes it possible to use every third and every fourth
  • the sequences of the first, second, third and fourth primers can be chosen such that they do not form primer dimers in the method and / or do not hybridize with themselves or with one another.
  • the formation of primer dimers leads to a reduced production of the desired product, eg. B. the third primer extension products. Ways to suppress the formation of primer dimers are from Brownie, J. et al. , Nucleic Acids Research, Volume 25, No. 16 (1997), pages 3235 to 3241.
  • neither first with second or third with fourth primers nor first with first, second with second, third with third or fourth can hybridize with fourth primers or other primers under the conditions of the method. This increases the efficiency of the process.
  • it is also advantageous if the sequences of the intermediate sections z are selected such that they do not hybridize themselves or the complementary intermediate sections z 'in the process with themselves or with the first, second, third or fourth partial sections or their complementary sequences ,
  • the sequences of the intermediate sections z are preferably selected such that hybrids of the intermediate sections z with nucleic acid strands which are completely complementary thereto would have an essentially identical melting temperature, in particular in a temperature range of 5 ° C.
  • Step lit. g simplified because the fourth conditions are essentially identical for all third primer extension products. This means that in step lit. g simultaneously bind all third primer extension products to the probes specific for them.
  • the method is also suitable for specifically detecting the nucleic acid S in the presence of a further nucleic acid which differs from the one nucleic acid S only in a first base contained in the one nucleic acid S.
  • the nucleic acid S and the further nucleic acid can be, for example, polymorphic nucleic acids. It is advantageous if the sequences of the first or second primers are selected such that the respective base of the second or fourth section, which is complementary to the first base or a complementary second base of a complementary nucleic acid S ', on 3' -End or near the 3 'end of the first or second primer. Nearby means in particular that there is a maximum of 3 nucleotides between the respective base and the end are located.
  • the first or second conditions of the first or second primer extension reaction can be chosen so that a primer that has a base that is not complementary is not extended in the first or second primer extension reaction.
  • the specificity of the method can be further increased if the second or fourth sections contain a base which does not form a third base corresponding to the position in the first section of the one nucleic acid S or in the second section of the nucleic acid S complementary to the one nucleic acid S. 'is complementary.
  • a base in the second or fourth section corresponds to the position of the third base if the third base would be positioned opposite it when the second or fourth section hybridized with the first or second section.
  • the non-complementary base in the second or fourth subsections means that when polymorphic nucleic acids are detected, there are two mismatches in the case of hybridization with a non-specific further nucleic acid, whereas there is only one mismatch in hybridization with the specific nucleic acid S.
  • a mismatch is a pairing of non-complementary bases. Frequently, a hybridized primer that is only mismatched is still extended, while a double mismatched primer is not extended, particularly because a hybrid that has two mismatches is relatively unstable.
  • the respective sequences of the first, second, third and fourth primers and the probe can be selected such that the first, the second, the respective third and / or the fourth conditions for the detection of the different nucleic acids S are identical. If every first, every second, every third and in each case all fourth conditions are identical, parallel detection of the different nucleic acids S is made possible in one reaction mixture.
  • the sequences should be selected so that specific hybridizations without cross-hybridizations take place under the conditions mentioned.
  • the method can be designed particularly efficiently if the probes are immobilized on an electrode or in its immediate vicinity.
  • the proof according to step lit. h can then take place by detecting a change in an electrical property at the electrode caused by the hybridization. In the immediate vicinity, this means that the respective probe is immobilized so close to the electrode that hybridizations with the probe on the electrode can still be detected electrically and assigned to the probe.
  • the electrodes can also be used, independently of evidence based on a change in an electrical property, to enrich the third primer extension products by electrostatic attraction to the probe. In the immediate vicinity then means that the probe is arranged in relation to the electrode in such a way that such enrichment is possible. Furthermore, the electrode can also be used to remove non-specifically bound third primer extension products from the probe by electrostatic repulsion.
  • the proof in step lit. h can also be done by detecting a change in a fluorescence-optical property caused by the hybridization.
  • the change in the electrical property can be a change in a redox property, in particular in the oxidation of guanine or adenine residues of the third primer extension products, an impedance or a conductivity, which is measured via the respective electrode becomes.
  • the redox property can be a redox potential, the change of which by electrochemical conversion of the third primer extension product bound to the probe, e.g. B. by differential pulse voltammetry or chronopotentiometric stripping analysis.
  • the binding of the third primer extension product to the probe can be detected electrochemically by oxidation of its guanine and / or adenine residues.
  • An electrode containing carbon or a metal electrode, in particular a gold electrode, can be used as the electrode.
  • the third and / or fourth primer can be a fluorescence-optically detectable, preferably redox-active, at the electrode optically or electrically or by means of the electrode
  • the marker can be directly or indirectly detectable. Indirectly is e.g. B. detectable a marker which is or has a specific affinity molecule.
  • a specific affinity molecule is a molecule to which a counter molecule binds with high specificity and affinity.
  • the affinity molecule can e.g. B. biotin or a hapten and the corresponding counter molecule streptavidin or an antibody.
  • the counter molecule can e.g. B. be conjugated with a fluorescent dye, a redox-active molecule or an enzyme.
  • the enzyme can be an enzyme which can convert a substrate in such a way that the reaction product can be specifically detected electrochemically or optically.
  • the enzyme can e.g. B.
  • the marker can be a phosphatase, which can be detected electrochemically by the enzymatic reaction of naphthyl phosphate. If the marker can be detected directly, it can contain an osmium complex, a nano-gold particle, a cysteine, ferrocenyl, daunomycin, benzoquinone, naphthoquinone, anthraquinone or p-aminophenol group, a dye, in particular indophenol, thiazine or phenazine, or a fluorescent dye, in particular 6-FAM, HEX, TET, Cy3, Cy5, IRDye TM 700, IRDye TM 800, Biodipy, Flourescein, Joe, Rox, TAMRA or Texas Red. Oligonucleotides labeled with the fluorescent dyes mentioned can be obtained from Thermo Hybaid, Sedanstrasse 18, D-89077 Ulm, Germany.
  • a plurality of different probes complementary to the intermediate sections z or the complementary intermediate sections z ′ are preferably used, each of which is bound to or in the immediate vicinity of a separate electrode, so that a signal at a specific electrode indicates the presence of a specific nucleic acid S can be closed.
  • a multiplicity of individually contacted or contactable electrodes arranged on a surface, in particular an electrode chip, can be used.
  • An electrode chip is understood here to mean a small plate with electronic microstructures that does not necessarily consist of semiconductor material. The smaller the surface, the smaller the volume of the solution required for the detection.
  • RNA can be detected indirectly by transcribing it into DNA and then detecting the DNA as nucleic acid S.
  • the transcription can be done using the enzyme "reverse transcriptase”.
  • the invention further relates to a kit for carrying out a method according to one of the preceding claims for the parallel detection of a plurality of different nucleic acids S containing:
  • a first pair of primers suitable for carrying out a PCR together with the nucleic acid S with a first and a second primer, wherein the first primer has a 5 'end first section and a 3' end second section and the second primer has a 5 'end third section and a 3' end fourth section,
  • sequences of the second and fourth sections being selected such that the second section with a predetermined first section of the nucleic acid S to be detected in each case under defined first conditions and the fourth section with a predetermined second
  • Section of a nucleic acid S 'complementary to the nucleic acid S to be detected in each case can specifically hybridize under defined second conditions and
  • a second pair of primers with a third and a fourth primer which, together with a primer extension product which can be generated by means of the first and second primers in the presence of the nucleic acid S to be detected, is suitable for carrying out a PCR and
  • the kit can contain a probe for each nucleic acid S to be detected, which can hybridize specifically with the intermediate section z or the complementary intermediate section z 'under defined fourth conditions.
  • the probes can be immobilized, in particular in a specific arrangement, for example on a chip.
  • the first partial sections of the first primers contained in the kit and / or the third partial sections of the second primers contained in the kit are preferably the same. This makes it possible to use uniform third and / or fourth primers for all nucleic acids S to be detected.
  • the sequences of the intermediate sections z are preferably selected such that the fourth conditions are identical for all intermediate sections z or the complementary intermediate sections z '. This enables all intermediate sections z or complementary intermediate sections z 'of the third primer extension products to bind to the respective probe at the same time. The selection of the sequences enables the procedure to be carried out in a simplified and accelerated manner.
  • the kit can furthermore contain an arrangement of electrodes, one probe being immobilized on or in the immediate vicinity of each electrode of the arrangement.
  • the probes are immobilized so that each electrode can be clearly assigned to a probe.
  • the arrangement of electrodes can consist of electrodes which are on a
  • the arrangement of electrodes can be an electrode chip.
  • the kit can specify the sequences of the first section, the third section. Section and the intermediate section z or the sequences complementary thereto. Using this information, the user of the kit can produce the first pair of primers for any nucleic acids S to be detected or have them produced.
  • FIG. 1 is a schematic representation of a first (P1) and a second primer (P2),
  • Fig. 3 is a schematic representation of a PCR
  • Fig. 4 is a schematic representation of a primer extension product hybridized with an immobilized probe.
  • the first primer P1 shown in FIG. 1 consists of a 5 '-end first section t1 and a 3' -end second section t2.
  • the second primer P2 consists of a 5 'terminal third section t3 and a 3' terminal fourth section t4. Between the third t3 and the fourth section t4 is the intermediate section z.
  • the second section t2 is complementary to a predetermined first section in a nucleic acid S to be detected.
  • the fourth section t4 is complementary to a predetermined second section of the nucleic acid S 'complementary to the nucleic acid S to be detected.
  • the first tl and the third subsection t3 are preferably complementary neither to a section of the nucleic acid S nor to the nucleic acid S 'complementary thereto.
  • the first two primer extension reactions are shown in the top two figures in FIG. 2.
  • the nucleic acid S which is double-stranded with the nucleic acid S 1 , z. B. denatured by an increase in temperature, ie made single-stranded.
  • the second section t2 hybridizes with the first section of the nucleic acid S to be detected and the fourth section t4 with the second section of the nucleic acid S 'complementary to the nucleic acid S.
  • the first P1 and the second primer P2 are each extended at least to such an extent that the other primer P2 or P1 can bind to a first primer extension product formed in the process.
  • the first primer extension product in each case serves as a template.
  • Second primer extension products are formed, each of which has a sequence complementary to the first P1 and second primer P2.
  • the method can also be carried out with a nucleic acid S to be detected, which is initially present without the complementary nucleic acid S '.
  • the second primer P2 could then only hybridize with the first primer extension product instead of with the complementary nucleic acid S '.
  • FIG. 3 shows second primer extension products resulting from the extension of the first P1 and the second primer P2.
  • a large number of third primer extension products of the third P3 and fourth primer P4 is generated by a PCR. This is shown schematically in the lower figure in FIG. 3.
  • the intermediate section z or a complementary intermediate section z ' is reproduced.
  • FIG. 4 shows the hybridization of an intermediate section z ′ complementary to the intermediate section z with a sequence complementary thereto of a probe So immobilized on an electrode E.
  • the hybridization brings the marker M close to the electrode E in such a way that it can be detected there by a change in an electrical property.
  • the marker M can be a redox-active substance, such as osmium tetroxide, which can be reduced or oxidized at the electrode.
  • the redox signal of the marker M which can be measured via the electrode E thus indicates the original presence of the nucleic acid S.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum parallelen Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren S. Beim Vorhandensein der Nukleinsäuren S werden Primer verlängert, welche jeweils einen Zwischenabschnitt z aufweisen. Der Zwischenabschnitt z wird jeweils mittels eines zweiten Primerpaars spezifisch amplifiziert und durch Hybridisierung mit je einer Sonde So spezifisch nachgewiesen.

Description

Verfahren zum parallelen Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum parallelen Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren und einen zur Durchführung des Verfahrens geeigneten Kit.
Ein solches Verfahren ist aus der EP 0 332 435 B2 bekannt. Dabei wird ein im Wesentlichen zu einem diagnostischen Teil einer nachzuweisenden Nukleotidsequenz komplementärer diagnostischer Primer in einer Primerverlängerungsreaktion nur verlängert, wenn das terminale Nukleotid des diagnostischen Primers komplementär zu dem korrespondierenden Nukleotid in dem diagnostischen Teil ist. Das Produkt der Verlängerung dient in einer mit einem Primerpaar durchgeführten Amplifikations- reaktion als Matrize. Das Vorhandensein oder Fehlen der nachzuweisenden Nukleotidsequenz wird durch das Vorhandensein oder das Fehlen eines Amplifikationsprodukts nachgewiesen.
Der Nachweis der Amplifikationsprodukte kann mittels Gelelektrophorese erfolgen. Dazu ist es erforderlich, dass die Am- plifikationsprodukte spezifisch durch ihre Länge oder eine spezifische Markierung identifizierbar sind. Deshalb erlaubt das Verfahren bei mehreren parallel durchzuführenden Nachweisreaktionen nur den Nachweis einer sehr begrenzten Zahl unterschiedlicher Amplifikationsprodukte . Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es, insbesondere bei einer großen Anzahl von Nachweisen, verhältnismäßig auf- wändig ist. Als weiteres Nachweisverfahren wird die Präzipi- tation, beispielsweise radioaktiv, markierter Amplifikationsprodukte angegeben. Dabei können nur so viele Amplifikationsprodukte parallel nachgewiesen werden, wie auf Grund ihrer spezifischen Markierung voneinander unterschieden werden kön- nen. Aus der WO 00/58516 ist ein Verfahren zum parallelen Nachweis von Nukleinsäuren bekannt. Dabei wird eine Lösung, die potenziell nachzuweisende Nukleinsäuren enthält, mit einer Mehrzahl von Primern in Kontakt gebracht. Die Primer besitzen je- weils einen 3 ' -orientierten für eine nachzuweisende Nuklein- säure spezifischen ersten Abschnitt und einen durch Hybridisierung eindeutig identifizierbaren 5 ' -orientierten zweiten Abschnitt. Die Primer werden mit den nachzuweisenden Nukleinsäuren unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen ei- ne spezifische Hybridisierung stattfinden kann. Hybridisierte Primer werden in einer Verlängerungsreaktion je um ein spezifisch markiertes Nukleotid verlängert. Dadurch kann zwischen nachzuweisenden Nukleinsäuren, die sich im dazu komplementären Nukleotid unterscheiden, differenziert werden. Die Pri- merverlängerungsprodukte werden mit einer Matrix in Kontakt gebracht, auf deren Oberfläche an definierten Positionen zu den zweiten Abschnitten komplementäre Oligonukleotide immobilisiert sind. Nach Hybridisierung werden die verlängerten Primer spezifisch durch ihre Lokalisation auf der Matrix und ihre spezifische Markierung nachgewiesen. Das Verfahren kann zum Nachweis von Nukleinsäuren verwendet werden, welche sich nur in einem Nukleotid unterscheiden. Nachteilig ist, dass das Verfahren nicht sehr empfindlich ist. Weiterhin ist es von Nachteil, dass spezifisch markierte Nukleotide erforder- lieh sind.
Aus Brownie, J. et al . , Nucleic Acids Research, Band 25, Nr. 16 (1997), Seiten 3235 bis 3241 ist ein Verfahren zum Verhindern der Bildung von Primer-Dimeren in einer PCR bekannt. Da- bei werden Primer mit einem aus einer zusätzlichen Nukleotidsequenz bestehenden Anhang an ihren 5 ' -Enden verwendet. Diese Primer sind in einer so niedrigen Konzentration in der PCR vorhanden, dass sie nur an frühen Zyklen der PCR teilnehmen. In weiteren PCR-Zyklen dient ein einzelner die Sequenz des Anhangs aufweisender Primer der Amplifikation. Die Se- quenz des Anhangs führt bei aus Primer-Dimeren gebildeten Amplifikationsprodukten dazu, dass komplementäre, von der Sequenz des Anhangs abgeleitete Sequenzen eines einzelnen Amplifikationsprodukts miteinander hybridisieren und dabei eine Art "Pfannenstiel"-Struktur bilden. Durch die Hybridisierung wird das Annealing von weiteren Primern an den Anhang verhindert und dadurch die Produktion ungewünschter PCR-Produkte vermieden. Die PCR-Produkte werden gelelektrophoretisch nachgewiesen. Das ist aufwändig und lässt bei parallel in einer PCR durchgeführten Reaktionen nur den Nachweis einer sehr begrenzten Zahl von PCR-Produkten zu.
Aus der US 5,849,544 ist ein Verfahren zum Nachweis einer Nu- kleinsäure bekannt. Dabei ist eine Fängersonde an einer Ge- fäßwand immobilisiert. Die nachzuweisende Nukleinsäure wird, beispielsweise durch eine PCR, amplifiziert. Dabei wird auch eine nachzuweisende Markierung, beispielsweise ein Biotin- Gruppe, in das Amplifikationsprodukt eingebaut. Die Fängersonde weist eine Nukleinsäuresequenz auf, welche mit zumin- dest einem Teil der amplifizierten Zielnukleotidsequenz hybridisieren kann. Die amplifizierte Zielnukleotidsequenz wird mit der Fängersonde unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die ein Binden der Fängersonde an die amplifizierte Zielnukleotidsequenz erlauben. Die gebundene amplifizierte Zielnu- kleotidsequenz kann mittels der Markierungssubstanz nachgewiesen werden.
Aus Jenison, R. et al . , Biosensors & Bioelectronics 16 (2001) , Seiten 757 bis 763 ist ein Chip bekannt, der auf ei- ner Oberfläche Fängersonden enthält, die spezifisch für bestimmte Virensequenzen sind. Der Chip ermöglicht den Nachweis von spezifischen Produkten einer Multiplex-PCR. Bei der Mul- tiplex-PCR wird eine Mischung verschiedener Primer eingesetzt, die jeweils für eine zu amplifizierende Sequenz spezi- fisch sind. Der Nachweis von an den Fängersonden gebundenen PCR-Produkten erfolgt optisch durch eine durch die Bindung und eine Enzym-katalysierte Reaktion bewirkte Änderung der Farbe eines von der Oberfläche reflektierenden Lichts. Nachteilig ist bei diesem Verfahren, dass durch die Verwendung spezifischer Primer für jede der nachzuweisenden Sequenzen die Vervielfältigung dieser Sequenzen mit unterschiedlicher Effizienz erfolgen kann.
Aus der US 5,871,918 ist ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäuren mit Hilfe einer immobilisierten
Fängersonde bekannt. Nach einer Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit der Fängersonde wird die hybridisierte DNA mit einem Übergangsmetallkomplex in Kontakt gebracht, der in der Lage ist, eine vorbestimmte Base in der Fängerson- de zu oxidieren. Die Redoxreaktion wird elektrochemisch de- tektiert und mit einer Redoxreaktion der einzelsträngigen Sonde verglichen. Weichen die dabei bestimmten Reaktionsraten voneinander ab, zeigt das eine Hybridisierung an.
Nachteilig bei den aus der US 5,849,544, aus der US 5,871,918 und aus Jenison et al . bekannten Verfahren ist, dass zum parallelen Nachweis verschiedener Nukleinsäuren unter einheitlichen Bedingungen jeweils eine Sequenz für eine Fängersonde ermittelt werden muss, die ein spezifisches Binden einer der nachzuweisenden Nukleinsäuren oder eines PCR-Produkts dieser Nukleinsäuren unter diesen Bedingungen erlaubt. Je größer die Anzahl der nebeneinander nachzuweisenden Nukleinsäuren ist, desto größer ist der Aufwand zum Ermitteln der Sequenzen für die Fängersonden.
In der DE 199 34 084 AI wird ein Verfahren zum Markieren und Charakterisieren von DNA-Fragmenten offenbart. Dabei wird eine PCR durchgeführt. Bei der PCR werden drei Primer eingesetzt, von denen zwei sequenzspezifische Oligonukleotidprimer sind. Einer dieser Oligonukleotidprimer ist mit einer Adap- tersequenz versehen, die homolog zu der Oligonukleotidsequenz des dritten Primers ist. Der dritte Primer weist eine Markierungssubstanz auf und dient dazu, Amplifikationsprodukte mit einer Markierung zu erzeugen. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es bei einer gleichzeitigen Durchführung mit mehreren zu charakterisierenden DNA-Fragmenten unter einheitlichen Bedingungen wegen unterschiedlicher Bindungskinetiken der Primer zu unterschiedlich effizienten Amplifikatio- nen der verschiedenen DNA-Fragmente kommen kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und einen Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure bereitzustellen, welches/r die Nachteile nach dem Stand der Technik vermeidet. Insbesondere soll das Verfahren mit einfachen Mitteln durch- zuführen sein und eine hohe Sensitivität aufweisen. Das Verfahren soll insbesondere den parallelen Nachweis einer großen Zahl verschiedener Nukleotidsequenzen unter einheitlichen Bedingungen und insbesondere in einem gemeinsamen Reaktionsansatz ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 31 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 30 und 32 bis 38.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zum parallelen Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren S mit folgenden Schritten vorgesehen:
a) Bereitstellen je eines zusammen mit einer der Nuklein- säuren S zur Durchführung einer PCR geeigneten ersten Primerpaars mit einem ersten (Pl) und einem zweiten Primer (P2),
wobei der erste Primer (Pl) einen 5 ' -endständigen ersten Teilabschnitt (tl) sowie einen 3 ' -endständigen zweiten Teil- abschnitt (t2) und der zweite Primer (P2) einen 5 ' -endständi- gen dritten Teilabschitt (t3) und einen 3 ' -endständigen vierten Teilabschnitt (t4) aufweist,
wobei die Sequenzen des zweiten (t2) und des vierten Teilab- Schnitts (t4) so ausgewählt sind, dass der zweite Teilabschnitt (t2) mit einem vorgegebenen ersten Abschnitt der einen Nukleinsäure S unter definierten ersten Bedingungen und der vierte Teilabschnitt (t4) mit einem vorgegebenen zweiten Abschnitt einer zu der einen Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S' unter definierten zweiten Bedingungen spezifisch hybridisieren und enzymatisch verlängert werden kann und
wobei jeweils ein den ersten (tl) mit dem zweiten Teilab- schnitt (t2) verbindender für den zweiten Teilabschnitt (t2) spezifischer Zwischenabschnitt z oder ein den dritten (t3) mit dem vierten Teilabschnitt (t4) verbindender für den vierten Teilabschnitt (t4) spezifischer Zwischenabschnitt z vorgesehen ist,
wobei die ersten (Pl) oder zweiten Primer (P2) der ersten Primerpaare sich jeweils im Zwischenabschnitt z und im sich daran anschließend angeordneten zweiten (t2) oder vierten Teilabschnitt (t4) unterscheiden, wobei jeder der zweiten (t2) oder vierten Teilabschnitte (t4) spezifisch für genau eine der Nukleinsäuren S ist,
b) Inkontaktbringen der unterschiedlichen Nukleinsäuren S oder der dazu komplementären Nukleinsäuren S' mit den ersten Primerpaaren in einer Lösung und Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion, bei welcher die ersten Primer (Pl) unter den ersten Bedingungen oder die zweiten Primer (P2) unter den zweiten Bedingungen zumindest einmal mindestens so weit verlängert werden, dass die jeweils andere Pri- mer (P2, Pl) der ersten Primerpaare unter den für deren spe- zifisches Hybridisieren erforderlichen ersten oder zweiten Bedingungen an jeweils ein dabei gebildetes erstes Primerver- längerungsprodukt spezifisch binden können,
c) Durchführen einer zweiten Primerverlängerungsreaktion, bei welcher die ersten Primerverlängerungsprodukte jeweils als Matrize dienen und die jeweiligen zweiten (P2) oder ersten Primer (Pl) unter den für deren spezifisches Hybridisieren mit den jeweiligen ersten Primerverlängerungsprodukten erforderlichen ersten oder zweiten Bedingungen unter Bildung je eines zweiten Primerverlängerungsprodukts verlängert werden,
d) Bereitstellen je eines zusammen mit den jeweiligen zwei- ten Primerverlängerungsprodukten zur Durchführung einer PCR geeigneten zweiten Primerpaars mit je einem dritten (P3) und einem vierten Primer (P4) ,
wobei die Sequenzen des dritten (P3) und vierten Primers (P4) jeweils so gewählt sind, dass der dritte Primer (P3) jeweils mit einer zum ersten Teilabschnitt (tl) komplementären Sequenz und der vierte Primer (P4) jeweils mit einer zum dritten Teilabschnitt (t3) komplementären Sequenz unter definierten dritten Bedingungen spezifisch hybridisieren und enzyma- tisch verlängert werden kann,
e) Inkontaktbringen der zweiten Primerverlängerungsprodukte mit den jeweiligen zweiten Primerpaaren und Durchführen einer PCR, wobei unter Bildung dritter Primerverlängerungsprodukte jeweils der Zwischenabschnitt z oder ein dazu komplementärer
Zwischenabschnitt z' amplifiziert wird,
f) Bereitstellen je einer immobilisierten Sonde (So) für jede nachzuweisende Nukleinsäure S, wobei die Sonde (So) je- weils mit einem der Zwischenabschnitte z oder einem der dazu komplementären Zwischenabschnitte z1 unter definierten vierten Bedingungen spezifisch hybridisieren kann,
g) Inkontaktbringen der Sonden (So) mit den dritten Primer- Verlängerungsprodukten unter den vierten Bedingungen,
h) Nachweis der an den Sonden (So) bindenden oder gebundenen dritten Primerverlängerungsprodukte.
Die ersten, zweiten, dritten und vierten Bedingungen umfassen z. B. bestimmte Temperaturen oder Konzentrationen, bspw. eines Primers. Die ersten und die zweiten Bedingungen sind vorzugsweise identisch. Das Durchführen der ersten Primerverlän- gerungsreaktion gemäß Schritt lit. b und der zweiten Primer- Verlängerungsreaktion gemäß Schritt lit. c kann gleichzeitig erfolgen. Der erste und der dritte Teilabschnitt sind so gewählt, dass sie unter den ersten oder zweiten Bedingungen jeweils im Wesentlichen nicht mit der Nukleinsäure S oder der dazu komplementären Nukleinsäure S' hybridisieren. Weiterhin sind der erste und der dritte Teilabschnitt vorzugsweise so ausgewählt, dass sie keine das Verfahren störenden Sekundärstrukturen, wie z. B. Haarnadelschleifen, ausbilden und eine ähnliche Schmelztemperatur, eine Länge von 16 bis 28 Nukleo- tiden, keine Komplementär!tat zueinander, insbesondere an den 3 '-Enden, ein ausgeglichenes GC-Vehältnis und am 3 ' -Ende keine GC reichen Regionen aufweisen. Auswahlkriterien für die Wahl der Sequenzen sind im Stand der Technik, z. B. aus Michael A. Innis, David H. Gelfand und John J. Sninsky, PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, San Diego, CA, USA (1999), bekannt.
Bei einer Ausgestaltung des Verfahrens weisen der erste und der dritte Teilabschnitt dieselbe Länge auf oder unterscheiden sich um höchstens 20% in ihrer Länge. Dadurch kann er- reicht werden, dass die spezifischen Annealingtemperaturen des mit der zum ersten Teilabschnitt komplementären Sequenz hybridisierenden dritten Primers und des mit der zum dritten Teilabschnitt komplementären Sequenz hybridisierenden vierten Primers relativ eng beieinander liegen. Je enger die Annea- lingtemperaturen beieinander liegen, desto effizienter kann die PCR gemäß Schritt lit. e durchgeführt werden.
Bei der Sonde kann es sich jeweils um eine Nukleinsäure oder ein Analogon einer Nukleinsäure, wie PNA, handeln. Unter ei- nem Analogon einer Nukleinsäure wird hier jede Struktur verstanden, die spezifisch mit dem Zwischenabschnitt z oder dem dazu komplementären Zwischenabschnitt z' hybridisieren kann. Die Sonden können, z. B. an einer Membran, immobilisiert sein. Die Identifizierung der an die Sonden bindenden oder gebundenen dritten Primerverlängerungsprodukte kann dadurch erfolgen, dass jeweils die Position, in welcher jeweils eine Sonde immobilisiert ist, bekannt ist und der Ort der Hybridisierung detektiert wird. Die Sonden können auch Bestandteil eines Chips sein. Unter einem Chip wird dabei eine feste, starre Oberfläche verstanden, auf der eine der Sonden jeweils an einer definierten Position immobilisiert ist. Weitere Sonden können jeweils an anderen definierten Positionen auf der Oberfläche immobilisiert sein. Auch hier kann die Identifizierung des mit der jeweiligen Sonde hybridisierten dritten Primerverlängerungsprodukts durch Ermitteln des Orts der Hybridisierung erfolgen.
Bei dem Verfahren werden beim Vorhandensein der Nukleinsäure S erste oder zweite Primer verlängert, welche den Zwischenab- schnitt z aufweisen. Dass der Zwischenabschnitt z für den zweiten oder vierten Teilabschnitt spezifisch ist, bedeutet, dass ein bestimmter Zwischenabschnitt z eindeutig einem bestimmten zweiten oder vierten Teilabschnitt zugeordnet werden kann. Der Zwischenabschnitt z oder der dazu komplementäre Zwischenabschnitt z' wird mittels dritter und vierter Primer spezifisch amplifiziert. Durch Hybridisierung des Zwischenabschnitts z oder des dazu komplementären Zwischenabschnitts z' mit einer der Sonden beim Schritt lit. g werden Verlängerungsprodukte der dritten oder vierten Primer spezifisch an der einen Sonde gebunden und können dort beim oder nach dem Binden nachgewiesen werden.
Dadurch, dass jeder Zwischenabschnitt z genau einem zweiten oder vierten Teilabschnitt zugeordnet werden kann und jeder zweite oder vierte Teilabschnitt spezifisch für genau eine der Nukleinsäuren S ist, ist eine Zuordnung jedes Zwischenabschnitts z bzw. jedes dazu komplementären Zwischenabschnitts z' zu einer der Nukleinsäuren S möglich. Durch den spezifischen Nachweis von den Zwischenabschnitt z oder den Zwischen- abschnitt z ' enthaltenden Primerverlängerungsprodukten kann bestimmt werden, ob in der Lösung mit den zweiten oder vierten Teilabschnitten spezifisch hybridisierende Nukleinsäuren S vorhanden sind.
Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass durch den Zwischenabschnitt z eine nahezu unbegrenzt große Zahl an spezifischen Kennzeichnungen für Primer zur Verfügung gestellt werden kann. Dadurch ist ein paralleler spezifischer Nachweis einer großen Zahl von Nu- kleinsäuren möglich. Durch das durch die PCR im Schritt lit. e erreichte exponenzielle Amplifizieren des Zwischenabschnitts z oder des dazu komplementären Zwischenabschnitts z' wird eine hohe Sensitivität erreicht.
Ein paralleler Nachweis einer Mehrzahl von Nukleinsäuren kann bisher mittels einer parallelen Amplifikation dieser Nukleinsäuren in einem PCR-Ansatz, einer so genannten Multiplex-PCR, erfolgen. Dabei kann es wegen der erforderlichen hohen Gesamtkonzentration an Primern zur Bildung von Primer-Dimeren und dadurch zu einer Inhibition der gewünschten PCR- Reaktionen kommen. Ein paralleler Nachweis einer Mehrzahl von Nukleinsäuren mittels Multiplex-PCR ist daher bisher auf den Nachweis weniger Nukleinsäuren mit wenigen Primerpaaren beschränkt. Beim parallelen Nachweis einer Mehrzahl unterschiedlicher Nukleinsäuren S mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es deshalb besonders vorteilhaft, dass das jeweils erste Primerpaar in so geringer Konzentration bereitgestellt werden kann, dass durch die Konzentration der ersten Primerpaare keine Störungen verursacht werden.
Bei einem parallelen Nachweis einer Mehrzahl von Nukleinsäuren mittels Multiplex-PCR werden die Nukleinsäuren bisher üblicherweise ungleichmäßig stark vervielfältigt. Bei einer ungleichmäßigen Vervielfältigung können sich die Mengen der er- zeugten Amplifikationsprodukte so sehr voneinander unterscheiden, dass bei einzelnen Nukleotidsequenzen noch nicht die zum Nachweis erforderliche Mindestmenge erzeugt ist, während andere Nukleotidsequenzen bereits deutlich detektierbar sind. Der Grund für die ungleichmäßige Vervielfältigung kann darin bestehen, dass sich wegen der exponentiellen Vermehrung in der PCR schon kleine Unterschiede in der Effizienz der verschiedenen Primer stark auf die Menge der gebildeten Produkte auswirken. Die Effizienz der Primer wird insbesondere durch die Länge der Primer und die Bindungskinetik, mit der die Primer an die nachzuweisende Nukleinsäure binden, bestimmt. Diese kleinen Unterschiede in der Effizienz sind aber bei einer Multiplex-PCR, bedingt durch die unterschiedlichen Sequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäuren, nahezu zwangsläufig vorhanden. Es werden spezifische Primer unterschiedli- eher Sequenz und häufig auch unterschiedlicher Länge eingesetzt. Dieser Nachteil kann durch die vorliegende Erfindung dadurch überwunden werden, dass die erste und zweite Primer- verlängerungsreaktion nur einmal oder wenige Male durchgeführt werden muss. Weil dabei auf eine exponenzielle Amplifi- kation verzichtet werden kann, wirkt sich bei parallel durch- geführten Nachweisreaktionen eine unterschiedliche Effizienz zwischen unterschiedlichen ersten Primerpaaren bei der jeweils ersten und zweiten Primerverlängerungsreaktion nur geringfügig auf die Menge der dritten Primerverlängerungspro- dukte aus. Das zweite Primerpaar kann unabhängig von der Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure S gestaltet werden. Dadurch können zweite Primerpaare mit einheitlicher Effizienz bei der PCR bereitgestellt werden. Beispielsweise können dazu alle ersten Primerpaare einen ersten Primer mit einem ein- heitlichen ersten Teilabschnitt und einen zweiten Primer mit einem einheitlichen dritten Teilabschnitt aufweisen. Damit liegen zwei für alle nachzuweisenden unterschiedlichen Nukleinsäuren S gleiche universelle Primerbindungsstellen vor. Dadurch ist es möglich, beim Schritt lit. d für alle nachzu- weisenden Nukleinsäuren S ein gemeinsames zweites Primerpaar bereitzustellen und damit beim Schritt lit. e eine PCR durchzuführen.
Beim parallelen Nachweis mehrerer unterschiedlicher Nuklein- säuren S besteht ein weiterer Vorteil des Verfahrens darin, dass die Primer so gestaltet werden können, dass die Nachweise unter einheitlichen Bedingungen durchgeführt werden können. Weiterhin ist es vorteilhaft, dass einmal ermittelte Bedingungen für das Hybridisieren des Zwischenabschnitts z oder des dazu komplementären Zwischenabschnitts z1 mit der Sonde für verschiedene Nachweisreaktionen verwendet werden können. Dazu kann der Zwischenabschnitt z in unterschiedlichen ersten oder zweiten Primern mit unterschiedlichen zweiten oder vierten Teilabschnitten kombiniert sein. Dadurch kann z. B. ein verschiedene immobilisierte Sonden aufweisender Chip bereitgestellt werden. Der Chip kann mit den Sequenzen der Sonden und der Zwischenabschnitte z für das erfinderische Verfahren optimiert und zum Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren S genutzt werden. Vorzugsweise werden die erste und zweite Primerverlängerungsreaktion als PCR durchgeführt. Dadurch können diese Primer- verlängerungsreaktionen mit Enzymen und Nukleotiden durchgeführt werden, die für die Durchführung der PCR im Schritt lit. e erforderlich sind. Das Verfahren wird dadurch vereinfacht, denn es müssen nur einmal Enzyme und Nukleotide zugesetzt werden.
Es hat sich weiterhin als vorteilhaft erwiesen, wenn die er- ste und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion und/oder PCR unter so genannten Heißstartbedingungen durchgeführt wird. Dabei wird die Temperatur des Reaktionsansatzes erhöht und sichergestellt, dass eine eingesetzte DNA-Polymerase erst dann die ersten, zweiten, dritten und/oder vierten Primer verlängert, wenn die Temperatur im Reaktionsansatz mindestens die für ein spezifisches Annealing dieser Primer erforderliche Temperatur erreicht hat. Das kann z. B. dadurch sichergestellt werden, dass für die erste und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion und/oder PCR die DNA-Polymerase dem jewei- ligen Reaktionsansatz erst nach erreichen dieser Temperatur zugesetzt wird oder indem eine Polymerase verwendet wird, die erst durch Erhitzen aktiviert wird. Dadurch wird vermieden, das unspezifisch bindende erste, zweite, dritte oder vierte Primer verlängert werden .
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird die erste Primerverlängerungsreaktion unter den ersten Bedingungen und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion unter den zweiten Bedingungen höchstens 10 mal, vorzugsweise höchstens 5 mal, insbesondere höchstens 2 mal, durchgeführt. Das bedeutet nicht, dass die erste und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion insgesamt nicht öfter als 10, 5 bzw. 2 mal stattfindet, sondern dass sie nur höchstens 10, 5 bzw. 2 mal unter den für eine spezifische und effiziente erste und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion günstigen ersten und/oder zweiten Bedingungen durchgeführt wird. Selbst wenn die erste und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion auch noch später unter den dritten Bedingungen stattfindet, können die dritten Bedingungen durch eine entsprechende Gestaltung der Sequenzen der ersten (tl) und dritten Teilabschnitte (t3) so gewählt werden, dass sie für die erste und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion ungünstig sind, so dass insgesamt eine niedrige Anzahl erster und/oder zweiter Primerverlängerungsreaktionen stattfindet. Eine niedrige Anzahl erster und/oder zweiter Primerverlängerungsreaktionen bewirkt, dass es sich bei einer Mehrzahl von parallel in einem Reaktionsansatz durchgeführten Nachweisreaktionen kaum auf die Menge der gebildeten dritten Primerverlängerungsprodukte auswirkt, wenn die ersten und/oder zweiten Primerverlängerungsreaktionen mit unterschiedlicher Effizienz ablaufen.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die Sequenzen des ersten und dritten Teilabschnitts so gewählt sind, dass die dritten Bedingungen so stringent sein können, dass der zweite Teilabschnitt mit dem ersten Abschnitt der einen Nukleinsäure S und der vierte Teilabschnitt mit dem zweiten Abschnitt der zu der einen Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S' unter den dritten Bedingungen im Wesentlichen nicht hybridisiert. Das ermöglicht es, die Reakti- on in einem Ansatz durchzuführen, der von vorne herein die ersten, zweiten, dritten und vierten Primer enthält. Durch bloßes Erhöhen der Stringenz, z. B. durch Temperaturerhöhung, lässt sich dann die erste und zweite Primerverlängerungsreaktion beenden und es findet nur noch eine Verlängerung der dritten und vierten Primer bei der PCR statt, obwohl die ersten und zweiten Primer weiterhin im Ansatz enthalten sind.
Bei einer Ausgestaltung des Verfahrens sind die Sequenzen und
Konzentrationen des ersten, zweiten, dritten und vierten Pri- mers so gewählt, dass die spezifische Annealingtemperatur des mit der zum ersten Teilabschnitt komplementären Sequenz hybridisierenden dritten Primers und des mit der zum dritten Teilabschnitt komplementären Sequenz hybridisierenden vierten Primers jeweils zumindest um 5 °C höher ist als die jeweils höhere Annealingtemperatur des mit dem ersten Abschnitt der einen Nukleinsäure S hybridisierenden zweiten Teilabschnitts und des mit dem zweiten Abschnitt der komplementären Nukleinsäure S1 hybridisierenden vierten Teilabschnitts. Dadurch, dass die Annealingtemperaturen zumindest um 5 °C auseinander liegen, kann durch eine Erhöhung der Stringenz, z. B. durch eine Erhöhung der Temperatur, sicher vermieden werden, dass die erste oder zweite Primerverlängerungsreaktion beim Durchführen der PCR gemäß lit. e stattfindet.
Der Schritt lit. e kann in der Lösung durchgeführt werden. Es ist nicht erforderlich die ersten Primerverlängerungsprodukte aus der Lösung zu entfernen und in eine weitere Lösung zu überführen. Vorzugsweise werden zumindest die Schritte lit. a bis lit. e, insbesondere die Schritte lit. a bis lit. h in einem verschlossenen Gefäß durchgeführt, welches zwischen den
Schritten nicht geöffnet wird. Dadurch können das Ergebnis verfälschende Kontaminationen vermieden werden. Weiterhin vereinfacht die Nutzung eines geschlossenen Gefäßes die Handhabung und Automation des Verfahrens.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird die Konzentration des den Zwischenabschnitt z enthaltenden ersten oder zweiten Primers in der Lösung so niedrig gewählt, dass durch diesen Primer ein Hybridisieren der Sonde mit dem je- weiligen Zwischenabschnitt z oder des dazu komplementären
Zwischenabschnitts z' der dritten Primerverlängerungsprodukte beim Schritt lit. g nicht wesentlich inhibiert wird. Nicht wesentlich inhibiert bedeutet, dass das Hybridisieren beim Schritt lit. g in einem für den Nachweis beim Schritt lit. h ausreichenden Ausmaß stattfindet. Durch die genannten Merkma- le kann weit gehend verhindert werden, dass ein solcher Primer beim Schritt lit. g mit den Verlängerungsprodukten der dritten oder vierten Primer um die Bindung an der Sonde konkurriert. Es kann auch weit gehend verhindert werden, dass die Hybridisierung der Sonde mit dem zum Zwischenabschnitt z komplementären Zwischenabschnitt z' durch ein Hybridisieren des Zwischenabschnitts z' mit diesem Primer inhibiert wird. Dadurch wird das Verfahren wesentlich vereinfacht. Ein Entfernen eines Überschusses von den Zwischenabschnitt z enthal- tenden ersten oder zweiten Primern ist nicht erforderlich. Durch die niedrige Konzentration kann im Wesentlichen auch verhindert werden, dass durch eine Hybridisierung einer der genannten Primer mit der Sonde ein eigentlich dem Nachweis dienendes Signal ausgelöst wird. Durch eine niedrige Konzen- tration des ersten Primerpaars kann außerdem die Bildung von Dimeren aus ersten und zweiten Primern verhindert werden. Sie ermöglicht beim parallelen Nachweis mehrerer Nukleinsäuren S in einem Ansatz den Einsatz einer Vielzahl unterschiedlicher erster Primerpaare, ohne in der Gesamtkonzentration dieser Primerpaare den für Primerverlängerungsreaktionen günstigen Konzentrationsbereich für Primer zu überschreiten.
Vorzugsweise wird die Konzentration des jeweils ersten Primerpaars in der Lösung auf 0,001 bis 0,1 μmol/1 eingestellt. Vorteilhaft ist es, wenn das Verhältnis der Konzentrationen von jeweils erstem Primerpaar zu jeweils zweitem Primerpaar kleiner als 1:10, vorzugsweise kleiner als 1:100, besonders vorzugsweise kleiner als 1:1000, ist. Je kleiner das Verhältnis ist, desto weniger konkurriert der Zwischenabschnitt z des ersten oder zweiten Primers mit den Verlängerungsprodukten der dritten oder vierten Primer um die Bindung an der Sonde oder mit der Sonde um die Bindung an dem zum Zwischenabschnitt z komplementären Zwischenabschnitt z ' . Die zweiten Primerpaare können der Lösung vor der ersten Primerverlängerungsreaktion zugesetzt werden. Das Verfahren wird dadurch vereinfacht. Zwischen der ersten und der zweiten Primerverlängerungsreaktion sind dadurch keine Pipettierschritte erforderlich. Das Durchführen der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreaktion kann ausschließlich über Temperatur gesteuert werden.
Vorzugsweise wird beim Schritt lit. e der dritte oder der vierte Primer häufiger verlängert als der jeweils andere Primer des zweiten Primerpaars. Das kann z. B. erreicht werden, indem in dem beim Schritt lit. d bereitgestellten zweiten Primerpaar der dritte oder vierte Primer gegenüber dem jeweils anderen darin enthaltenen Primer in einem, vorzugsweise 2- bis 5-fachen, Überschuss vorliegt. Unter diesen asymmetrischen Bedingungen kann gezielt das an die Sonde bindende Verlängerungsprodukt gegenüber dem anderen Verlängerungsprodukt des dritten oder vierten Primers im Überschuss gebildet werden. Dadurch kann eine mit der Hybridisierung mit der Sonde konkurrierende Hybridisierung der Verlängerungsprodukte der dritten und vierten Primer untereinander deutlich vermindert werden, so dass ein größerer Anteil der dritten Primerverlängerungsprodukte an die Sonde bindet. Das kann die Sensitivi- tät des Nachweises verbessern bzw. ein stärkeres Signal beim Nachweis ermöglichen. Weiterhin ist das Verfahren dadurch effizienter und wirtschaftlicher, weil jeweils nur eines der beiden gebildeten dritten Primerverlängerungsprodukte zum Nachweis benötigt wird. Ein weiteren Vorteil besteht darin, dass die gebildeten PCR-Produkte nicht vor Durchführung des Schritts lit. g denaturiert werden müssen, um ein Hybridisieren mit den Sonden zu ermöglichen, weil nur ein Teil der an die Sonde bindenden Zwischenabschnitte z oder dazu komplementären Zwischenabschnitte z' hybridisiert mit ihrem in der PCR gemäß lit. e gebildeten Gegenstrang vorliegt. Wenn auf das Denaturieren verzichtet wird, werden auch häufig zufällig vorliegende in sich rückgefaltete Sequenzen nicht denaturiert. Dadurch können diese Sequenzen nicht mit den Zwischenabschnitten z oder den dazu komplementären Zwischenabschnitten z' um eine spezifische Hybridisierung an den Sonden kom- petitieren. Dadurch wird die Sensitivität und Spezifität des Nachweises erhöht. Wenn das üblicherweise durch Erhitzen erfolgende Denaturieren nicht erfolgt, werden auch, beispielsweise zu einem elektrochemischen Detektieren verwendete, Elektroden weniger stark beansprucht und weisen dadurch eine größere Haltbarkeit auf.
Der Lösung kann eine Mehrzahl erster Primerpaare zugesetzt werden, deren erste Primer einen jeweils identischen oder nahezu identischen ersten Teilabschnitt und/oder deren zweite Primer einen jeweils identischen oder nahezu identischen dritten Teilabschnitt aufweisen und deren zweiter oder vierter Teilabschnitt jeweils spezifisch für genau eine der Nukleinsäuren S ist. Teilabschnitte sind nahezu identisch, wenn die gleichen Primer damit hybridisieren können. Dadurch ist es möglich, jeweils alle dritten und jeweils alle vierten
Primer einheitlich zu gestalten, so dass nur ein zweites Primerpaar erforderlich ist. Dadurch wird das Verfahren erheblich vereinfacht.
Die Sequenzen der ersten, zweiten, dritten und vierten Primer können so gewählt sein, dass sie bei dem Verfahren keine Pri- mer-Dimere bilden und/oder nicht mit sich selbst oder untereinander hybridisieren. Die Ausbildung von Primer-Dimeren führt bei der PCR zu einer verminderten Produktion des ge- wünschten Produkts, z. B. der dritten Primerverlängerungsprodukte. Möglichkeiten die Bildung von Primer-Dimeren zu unterdrücken sind aus Brownie, J. et al . , Nucleic Acids Research, Band 25, Nr. 16 (1997), Seiten 3235 bis 3241 bekannt. Weiterhin sollen weder erste mit zweiten oder dritte mit vierten Primern noch erste mit ersten, zweite mit zweiten, dritte mit dritten oder vierte mit vierten Primern oder sonstige Primer unter den Bedingungen des Verfahrens miteinander hybridisieren können. Das erhöht die Effizienz des Verfahrens. Weiterhin ist es zur Effizienzsteigerung vorteilhaft, wenn die Sequenzen der Zwischenabschnitte z so gewählt sind, dass sie weder selbst noch die dazu komplementären Zwischenabschnitte z' bei dem Verfahren mit sich selbst oder mit den ersten, zweiten, dritten oder vierten Teilabschnitten oder deren komplementären Sequenzen hybridisieren.
Vorzugsweise sind die Sequenzen der Zwischenabschnitte z so gewählt, dass Hybride der Zwischenabschnitte z mit dazu jeweils vollkommen komplementären Nukleinsäuresträngen eine im Wesentlichen identische, insbesondere in einem Temperaturbe- reich von 5° C liegende, Schmelztemperatur aufweisen würden. Dadurch wird der Schritt lit. g vereinfacht, weil die vierten Bedingungen für sämtliche dritten Primerverlängerungsprodukte im Wesentlichen identisch sind. Dadurch können beim Schritt lit. g alle dritten Primerverlängerungsprodukte gleichzeitig an die für sie jeweils spezifischen Sonden binden.
Das Verfahren ist auch geeignet, die eine Nukleinsäure S in Gegenwart einer sich von der einen Nukleinsäure S nur in einer in der einen Nukleinsäure S enthaltenen ersten Base un- terscheidenden weiteren Nukleinsäure spezifisch nachzuweisen. Die Nukleinsäure S und die weitere Nukleinsäure können beispielsweise polymorphe Nukleinsäuren sein. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Sequenzen der ersten oder zweiten Primer so gewählt sind, dass sich die jeweilige Base des zweiten oder vierten Teilabschnitts, die zu der ersten Base oder einer dazu komplementären zweiten Base einer komplementären Nukleinsäure S' komplementär ist, am 3 ' -Ende oder in der Nähe des 3 ' -Endes des jeweils ersten oder zweiten Primers befindet. In der Nähe bedeutet dabei insbesondere, dass sich zwi- sehen der jeweiligen Base und dem Ende höchstens 3 Nukleotide befinden. Die ersten oder zweiten Bedingungen der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreaktion können dabei so gewählt werden, dass ein Primer, der eine Base aufweist, die nicht komplementär ist, bei der ersten oder zweiten Primerverlänge- rungsreaktion nicht verlängert wird.
Die Spezifität des Verfahrens kann weiter erhöht werden, indem die zweiten oder vierten Teilabschnitte eine Base enthalten, welche nicht zu einer ihr in der Position entsprechenden dritte Base im ersten Abschnitt der einen Nukleinsäure S oder im zweiten Abschnitt der zu der einen Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S' komplementär ist. Eine Base im zweiten oder vierten Teilabschnitt entspricht in der Position der dritten Base, wenn die dritte Base ihr beim Hybridisieren des zweiten oder vierten Teilabschnitts mit dem ersten oder zweiten Abschnitt gegenüberliegend positioniert wäre. Durch die nicht komplementäre Base in den zweiten oder vierten Teilabschnitten wird erreicht, dass beim Nachweis polymorpher Nukleinsäuren im Falle einer Hybridisierung mit einer nicht spezifischen weiteren Nukleinsäure zwei Fehlpaarungen vorliegen, während bei der Hybridisierung mit der spezifischen Nukleinsäure S nur eine Fehlpaarung vorliegt. Unter einer Fehlpaarung wird eine Paarung nicht komplementärer Basen verstanden. Häufig wird ein hybridisierter Primer, der nur einfach fehlgepaart ist, dennoch verlängert, während ein zweifach fehlgepaarter Primer nicht verlängert wird, insbesondere weil ein zwei Fehlpaarungen aufweisendes Hybrid relativ instabil ist .
Die jeweiligen Sequenzen der ersten, zweiten, dritten und vierten Primer und der Sonde können so gewählt sein, dass jeweils die ersten, jeweils die zweiten, jeweils die dritten und/oder jeweils die vierten Bedingungen für den Nachweis der unterschiedlichen Nukleinsäuren S identisch sind. Wenn je- weils alle ersten, jeweils alle zweiten, jeweils alle dritten und jeweils alle vierten Bedingungen identisch sind wird ein paralleler Nachweis der unterschiedlichen Nukleinsäuren S in einem Reaktionsansatz ermöglicht. Die Sequenzen sollten so gewählt werden, dass unter den genannten Bedingungen spezifi- sehe Hybridisierungen ohne Kreuzhybridisierungen erfolgen.
Besonders effizient kann das Verfahren gestaltet werden, wenn die Sonden jeweils an einer Elektrode oder in deren unmittelbarer Nähe immobilisiert sind. Der Nachweis gemäß Schritt lit. h kann dann durch Erfassen einer durch das Hybridisieren bedingten Änderung einer elektrischen Eigenschaft an der Elektrode erfolgen. In unmittelbarer Nähe bedeutet dabei, dass die jeweilige Sonde so nah an der Elektrode immobilisiert ist, dass Hybridisierungen mit der Sonde an der Elek- trode noch elektrisch erfasst und der Sonde zugeordnet werden können.
Die Elektroden können auch unabhängig von einem auf einer Änderung einer elektrischen Eigenschaft beruhenden Nachweis da- zu dienen, die dritten Primerverlängerungsprodukte durch elektrostatische Anziehung an der Sonde anzureichern. In unmittelbarer Nähe bedeutet dann, dass die Sonde so im Verhältnis zu der Elektrode angeordnet ist, dass ein solches Anreichern möglich ist. Weiterhin kann die Elektrode auch dazu dienen, durch elektrostatische Abstoßung unspezifisch gebundene dritte Primerverlängerungsprodukte von der Sonde zu entfernen. Der Nachweis beim Schritt lit. h kann auch durch Erfassen einer durch das Hybridisieren bedingten Änderung einer fluoreszenzoptischen Eigenschaft erfolgen.
Bei der Änderung der elektrischen Eigenschaft kann es sich um eine Änderung einer Redox-Eigenschaft, insbesondere bei der Oxidation von Guanin- oder Adenin-Resten der dritten Primerverlängerungsprodukte, einer Impedanz oder einer Leitfähig- keit handeln, welche über die jeweilige Elektrode gemessen wird. Die Redox-Eigenschaft kann ein Redox-Potenzial sein, dessen Änderung durch elektrochemische Umsetzung des an der Sonde gebundenen dritten Primerverlängerungsprodukts, z. B. durch Differenzielle Puls-Voltammetrie oder Chronopotentiome- trische Stripping-Analyse, erfasst wird. Beispielsweise kann die Bindung des dritten Primerverlängerungsprodukts an der Sonde durch Oxidation von dessen Guanin- und/oder Adenin- Resten elektrochemisch nachgewiesen werden. Als Elektrode kann eine Kohlenstoff enthaltende Elektrode oder eine Metal- lelektrode, insbesondere eine Goldelektrode, verwendet werden.
Der dritte und/oder vierte Primer kann einen an der Elektrode fluoreszenzoptisch oder mittels der Elektrode elektrisch oder elektrochemisch nachweisbaren, vorzugsweise redoxaktiven,
Marker aufweisen. Der Marker kann direkt oder indirekt nachweisbar sein. Indirekt ist z. B. ein Marker nachweisbar, welcher ein spezifisches Affinitätsmolekül ist bzw. aufweist. Ein spezifisches Affinitätsmolekül ist ein Molekül, an das mit hoher Spezifität und Affinität ein Gegenmolekül bindet. Das Affinitätsmolekül kann z. B. Biotin oder ein Hapten und das entsprechende Gegenmolekül Streptavidin oder ein Antikörper sein. Das Gegenmolekül kann z. B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem redoxaktiven Molekül oder einem Enzym konju- giert sein. Bei dem Enzym kann es sich um ein Enzym handeln, welches ein Substrat so umsetzen kann, dass das Reaktionsprodukt elektrochemisch oder optisch spezifisch nachgewiesen werden kann. Das Enzym kann z. B. eine Phosphatase sein, welche durch die enzymatische Umsetzung von Naphthylphosphat elektrochemisch nachgewiesen werden kann. Ist der Marker direkt nachzuweisen, kann er einen Osmium-Komplex, ein Nano- gold-Partikel, eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Ben- zochinon-, Naphthochinon- , Anthrachinon- oder p-Aminophenol- Gruppe, einen Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, oder einen Floureszenfarbstoff, insbesondere 6-FAM, HEX, TET, Cy3 , Cy5 , IRDye™700, IRDye™800, Biodipy, Flourescein, Joe, Rox, TAMRA oder Texas Red, aufweisen. Mit den genannten Fluoreszenzfarbstoffen markierte Oligonukleoti- de können von der Firma Thermo Hybaid, Sedanstrasse 18, D- 89077 Ulm, Deutschland bezogen werden.
Vorzugsweise wird eine Vielzahl unterschiedlicher zu den Zwischenabschnitten z oder den dazu komplementären Zwischenabschnitten z' komplementärer Sonden verwendet, von denen jede an oder in unmittelbarer Nähe einer separaten Elektrode gebunden ist, so dass von einem Signal an einer spezifischen Elektrode auf das Vorhandensein einer spezifischen Nukleinsäure S geschlossen werden kann. Eine Vielzahl einzeln kontaktierter oder kontaktierbarer auf einer Oberfläche, insbe- sondere einem Elektrodenchip, angeordneter Elektroden kann verwendet werden. Unter einem Elektrodenchip wird hier eine nicht notwendigerweise aus Halbleitermaterial bestehende kleine Platte mit elektronischen MikroStrukturen verstanden. Je kleiner die Oberfläche ist, desto geringer ist das für den Nachweis erforderliche Volumen der Lösung.
Eine RNA kann indirekt dadurch nachgewiesen werden, dass sie in eine DNA umgeschrieben und die DNA dann als Nukleinsäure S nachgewiesen wird. Das Umschreiben kann mittels des Enzyms "Reverse Transkriptase" erfolgen.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum parallelen Nachweis einer Mehrzahl unterschiedlicher Nuklein- säuren S enthaltend:
a) für jede nachzuweisende Nukleinsäure S je ein zusammen mit der Nukleinsäure S zur Durchführung einer PCR geeignetes erstes Primerpaar mit einem ersten und einem zweiten Primer, wobei der erste Primer einen 5 ' -endständigen ersten Teilabschnitt sowie einen 3 ' -endständigen zweiten Teilabschnitt und der zweite Primer einen 5 ' -endständigen dritten Teilabschitt und einen 3 ' -endständigen vierten Teilabschnitt aufweist,
wobei die Sequenzen des zweiten und des vierten Teilabschnitts so ausgewählt sind, dass der zweite Teilabschnitt mit einem vorgegebenen ersten Abschnitt der jeweils nachzuweisenden Nukleinsäure S unter definierten ersten Bedingungen und der vierte Teilabschnitt mit einem vorgegebenen zweiten
Abschnitt einer zu der jeweils nachzuweisenden Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S' unter definierten zweiten Bedingungen spezifisch hybridisieren kann und
wobei ein den ersten mit dem zweiten Teilabschnitt verbindender für den zweiten Teilabschnitt spezifischer Zwischenabschnitt z oder ein den dritten mit dem vierten Teilabschnitt verbindender für den vierten Teilabschnitt spezifischer Zwischenabschnitt z vorgesehen ist und
b) für jede nachzuweisende Nukleinsäure S je ein zweites Primerpaar mit einem dritten und einem vierten Primer, welches zusammen mit einem bei Anwesenheit der jeweils nachzuweisenden Nukleinsäure S mittels des ersten und zweiten Pri- mers erzeugbaren Primerverlängerungsprodukt zur Durchführung einer PCR geeignet ist und
wobei die Sequenzen des dritten und vierten Primers so gewählt sind, dass der dritte Primer mit einer zum ersten Teil- abschnitt des ersten Primers komplementären Sequenz und der vierte Primer mit einer zum dritten Teilabschnitt des zweiten Primers komplementären Sequenz unter definierten dritten Bedingungen spezifisch hybridisieren kann. In dem Kit kann für jede nachzuweisende Nukleinsäure S je eine Sonde enthalten sein, welche jeweils mit dem Zwischenabschnitt z oder dem dazu komplementären Zwischenabschnitt z ' unter definierten vierten Bedingungen spezifisch hybridisie- ren kann. Die Sonden können, insbesondere in einer spezifischen Anordnung, beispielsweise auf einem Chip, immobilisiert sein.
Vorzugsweise sind die ersten Teilabschnitte der in dem Kit enthaltenen ersten Primer und/oder die dritten Teilabschnitte der in dem Kit enthaltenen zweiten Primer gleich. Das ermöglicht es, für alle nachzuweisenden Nukleinsäuren S einheitliche dritte und/oder vierte Primer zu verwenden.
Die Sequenzen der Zwischenabschnitte z sind vorzugsweise so gewählt, dass die vierten Bedingungen für alle Zwischenabschnitte z oder die dazu komplementären Zwischenabschnitte z ' identisch sind. Das ermöglicht es, dass alle Zwischenabschnitte z oder dazu komplementäre Zwischenabschnitte z' der dritten Primerverlängerungsprodukte gleichzeitig an die jeweilige Sonde binden können. Die Auswahl der Sequenzen ermöglicht eine vereinfachte und beschleunigte Durchführung des Verfahrens .
Der Kit kann weiterhin eine Anordnung von Elektroden enthalten, wobei an oder in unmittelbarer Nähe jeder Elektrode der Anordnung jeweils eine Sonde immobilisiert ist. Dabei sind die Sonden so immobilisiert, dass eine eindeutige Zuordnung jeder Elektrode zu einer Sonde möglich ist. Die Anordnung von Elektroden kann aus Elektroden bestehen, welche auf einer
Oberfläche angeordnet sind. Die Anordnung von Elektroden kann ein Elektrodenchip sein.
Statt des ersten Primerpaars können in dem Kit Angaben der Sequenzen des ersten Teilabschnitts, des dritten Teilab- Schnitts und des Zwischenabschnitts z oder der dazu jeweils komplementären Sequenzen enthalten sein. Mittels dieser Angaben kann der Anwender des Kits das erste Primerpaar für beliebige nachzuweisende Nukleinsäuren S selbst herstellen oder herstellen lassen.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Hierbei zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines ersten (Pl) und eines zweiten Primers (P2),
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer ersten und zweiten Primerverlängerungsreaktion,
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer PCR und
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines mit einer immobilisierten Sonde hybridisierten Primerverlängerungsprodukts .
Der in Fig. 1 dargestellte erste Primer Pl besteht aus einem 5 ' -endständigen ersten Teilabschnitt tl und einem 3 ' -endständigen zweiten Teilabschnitt t2. Der zweite Primer P2 besteht aus einem 5 ' -endständigen dritten Teilabschnitt t3 und einem 3 ' -endständigen vierten Teilabschnitt t4. Zwischen dem dritten t3 und dem vierten Teilabschnitt t4 befindet sich der Zwischenabschnitt z. Der zweite Teilabschnitt t2 ist zu einem vorgegebenen ersten Abschnitt in einer nachzuweisenden Nukleinsäure S komplementär. Der vierte Teilabschnitt t4 ist zu einem vorgegebenen zweiten Abschnitt der zur nachzuweisenden Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S' komplementär. Der erste tl und der dritte Teilabschnitt t3 sind bevorzugt weder zu einem Abschnitt der Nukleinsäure S noch zu der dazu komplementären Nukleinsäure S' komplementär. In den oberen beiden Abbildungen der Fig. 2 sind erste Primerverlängerungsreaktionen dargestellt. Zunächst wird dazu die mit der Nukleinsäure S1 doppelsträngig vorliegende Nukleinsäure S, z. B. durch eine Temperaturerhöhung, denatu- riert, d.h. einzelsträngig gemacht. Dann hybridisiert der zweite Teilabschnitt t2 mit dem ersten Abschnitt der nachzuweisenden Nukleinsäure S und der vierte Teilabschnitt t4 mit dem zweiten Abschnitt der zur Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S'. Bei der ersten Primerverlängerungsreaktion werden der erste Pl und der zweite Primer P2 jeweils zumindest so weit verlängert, dass der jeweils andere Primer P2 oder Pl an einem dabei gebildeten ersten Primerverlängerungsprodukt binden kann. Bei einer anschließend durchgeführten in den unteren beiden Abbildungen der Fig. 2 dargestellten zwei- ten Primerverlängerungsreaktion dient das jeweils erste Primerverlängerungsprodukt als Matrize. Es werden zweite Primerverlängerungsprodukte gebildet, welche jeweils eine zum ersten Pl und zweiten Primer P2 komplementäre Sequenz aufweisen. Das Verfahren kann auch mit einer nachzuweisenden Nu- kleinsäure S durchgeführt werden, welche anfänglich ohne die dazu komplementäre Nukleinsäure S' vorliegt. Der zweite Primer P2 könnte dann erst mit dem ersten Primerverlängerungsprodukt anstatt mit der komplementären Nukleinsäure S' hybridisieren.
Die obere Abbildung der Fig. 3 zeigt aus der Verlängerung der ersten Pl und der zweiten Primer P2 entstandene zweite Primerverlängerungsprodukte. Mit deren 5 ' -Enden hybridisiert jeweils ein dritter P3 und ein mit einer Markierungssubstanz bzw. einem Marker versehener vierter Primer P4. Durch eine PCR entsteht eine große Anzahl dritter Primerverlängerungsprodukte der dritten P3 und vierten Primer P4. Das ist in der unteren Abbildung der Fig. 3 schematisch dargestellt. Bei der PCR wird der Zwischenabschnitt z bzw. ein dazu komplementärer Zwischenabschnitt z' vervielfältigt. In Fig. 4 ist das Hybridisieren eines zum Zwischenabschnitt z komplementären Zwischenabschnitts z' mit einer dazu komplementären Sequenz einer an einer Elektrode E immobilisierten Sonde So dargestellt. Durch das Hybridisieren wird der Marker M so in die Nähe der Elektrode E gebracht, dass er dort durch eine Änderung einer elektrischen Eigenschaft nachgewiesen werden kann. Bei dem Marker M kann es sich um eine redoxakti- ve Substanz, wie beispielsweise Osmiumtetroxyd, handeln, wel- ehe an der Elektrode reduziert bzw. oxidiert werden kann. Das über die Elektrode E messbare Redoxsignal des Markers M zeigt somit das ursprüngliche Vorhandensein der Nukleinsäure S an.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum parallelen Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren S mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen je eines zusammen mit einer der Nukleinsäuren S zur Durchführung einer PCR geeigneten ersten Primerpaars mit einem ersten (Pl) und einem zweiten Primer (P2),
wobei der erste Primer (Pl) einen 5 ' -endständigen ersten
Teilabschnitt (tl) sowie einen 3 ' -endständigen zweiten Teilabschnitt (t2) und der zweite Primer (P2) einen 5 ' -endständigen dritten Teilabschitt (t3) und einen 3 ' -endständigen vierten Teilabschnitt (t4) aufweist,
wobei die Sequenzen des zweiten (t2) und des vierten Teilabschnitts (t4) so ausgewählt sind, dass der zweite Teilabschnitt (t2) mit einem vorgegebenen ersten Abschnitt der einen Nukleinsäure S unter definierten ersten Bedingungen und der vierte Teilabschnitt (t4) mit einem vorgegebenen zweiten
Abschnitt einer zu der einen Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S' unter definierten zweiten Bedingungen spezifisch hybridisieren und enzymatisch verlängert werden kann und
wobei jeweils ein den ersten (tl) mit dem zweiten Teilabschnitt (t2) verbindender für den zweiten Teilabschnitt (t2) spezifischer Zwischenabschnitt z oder ein den dritten (t3) mit dem vierten Teilabschnitt (t4) verbindender für den vier- ten Teilabschnitt (t4) spezifischer Zwischenabschnitt z vorgesehen ist,
wobei die ersten (Pl) oder zweiten Primer (P2) der ersten Primerpaare sich jeweils im Zwischenabschnitt z und im sich daran anschließend angeordneten zweiten (t2) oder vierten Teilabschnitt (t4) unterscheiden, wobei jeder der zweiten (t2) oder vierten Teilabschnitte (t4) spezifisch für genau eine der Nukleinsäuren S ist,
b) Inkontaktbringen der unterschiedlichen Nukleinsäuren S oder der dazu komplementären Nukleinsäuren S' mit den ersten Primerpaaren in einer Lösung und Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion, bei welcher die ersten Primer (Pl) unter den ersten Bedingungen oder die zweiten Primer (P2) unter den zweiten Bedingungen zumindest einmal mindestens so weit verlängert werden, dass die jeweils anderen Primer (P2, Pl) der ersten Primerpaare unter den für deren spezifisches Hybridisieren erforderlichen ersten oder zweiten Bedingungen an jeweils ein dabei gebildetes erstes Primerver- längerungsprodukt spezifisch binden können,
c) Durchführen einer zweiten Primerverlängerungsreaktion, bei welcher die ersten Primerverlängerungsprodukte jeweils als Matrize dienen und die jeweiligen zweiten (P2) oder er- sten Primer (Pl) unter den für deren spezifisches Hybridisieren mit den jeweiligen ersten Primerverlängerungsprodukten erforderlichen ersten oder zweiten Bedingungen unter Bildung je eines zweiten Primerverlängerungsprodukts verlängert werden,
d) Bereitstellen je eines zusammen mit den jeweiligen zweiten Primerverlängerungsprodukten zur Durchführung einer PCR geeigneten zweiten Primerpaars mit je einem dritten (P3) und einem vierten Primer (P4),
wobei die Sequenzen des dritten (P3) und vierten Primers (P4) jeweils so gewählt sind, dass der dritte Primer (P3) jeweils mit einer zum ersten Teilabschnitt (tl) komplementären Sequenz und der vierte Primer (P4) jeweils mit einer zum drit- ten Teilabschnitt (t3) komplementären Sequenz unter definier- ten dritten Bedingungen spezifisch hybridisieren und enzyma- tisch verlängert werden kann,
e) Inkontaktbringen der zweiten Primerverlängerungsprodukte mit den jeweiligen zweiten Primerpaaren und Durchführen einer PCR, wobei unter Bildung dritter Primerverlängerungsprodukte jeweils der Zwischenabschnitt z oder ein dazu komplementärer Zwischenabschnitt z' amplifiziert wird,
f) Bereitstellen je einer immobilisierten Sonde (So) für jede nachzuweisende Nukleinsäure S, wobei die Sonde (So) jeweils mit einem der Zwischenabschnitte z oder einem der dazu komplementären Zwischenabschnitte z ' unter definierten vierten Bedingungen spezifisch hybridisieren kann,
g) Inkontaktbringen der Sonden (So) mit den dritten Primerverlängerungsprodukten unter den vierten Bedingungen,
h) Nachweis der an den Sonden (So) bindenden oder gebunde- nen dritten Primerverlängerungsprodukte.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste und zweite Primerverlängerungsreaktion als PCR durchgeführt werden.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion und/oder PCR unter Heißstartbedingungen durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Primerverlängerungsreaktion unter den ersten Bedingungen und/oder zweite Primerverlängerungsreaktion unter den zweiten Bedingungen höchstens 10 mal, vorzugsweise höchstens 5 mal, insbesondere höchstens 2 mal, durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sequenzen des ersten (tl) und dritten Teilabschnitts (t3) so gewählt sind, dass die dritten Bedingungen so stringent sein können, dass der zweite Teilabschnitt (t2) mit dem ersten Abschnitt der einen Nukleinsäure S und der vierte Teil- abschnitt (t4) mit dem zweiten Abschnitt der zu der einen Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S' unter den dritten Bedingungen im Wesentlichen nicht hybridisiert.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sequenzen und Konzentrationen des ersten (Pl) , zweiten
(P2), dritten (P3) und vierten Primers (P4) so gewählt sind, dass die spezifische Annealingtemperatur des mit der zum ersten Teilabschnitt (tl) komplementären Sequenz hybridisierenden dritten Primers (P3) und des mit der zum dritten Teilab- schnitt (t3) komplementären Sequenz hybridisierenden vierten Primers (P4) jeweils zumindest um 5 °C höher ist als die jeweils höhere Annealingtemperatur des mit dem ersten Abschnitt der einen Nukleinsäure S hybridisierenden zweiten Teilabschnitts (t2) und des mit dem zweiten Abschnitt der komple- mentären Nukleinsäure S' hybridisierenden vierten Teilabschnitts ( t4) .
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt lit. e in der Lösung durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest die Schritte lit. a bis lit. e, insbesondere die Schritte lit. a bis lit. h in einem verschlossenen Gefäß durchgeführt werden, welches zwischen den Schritten nicht ge- öffnet wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des den Zwischenabschnitt z enthaltenden ersten oder zweiten Primers (Pl, P2) in der Lösung so niedrig gewählt wird, dass durch diesen Primer (Pl, P2) ein Hybridi- sieren der Sonde (So) mit dem jeweiligen Zwischenabschnitt z oder dem dazu komplementären Zwischenabschnitt z ' der dritten Primerverlängerungsprodukte beim Schritt lit. g nicht wesentlich inhibiert wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des jeweils ersten Primerpaars in der Lösung auf 0,001 bis 0,1 μmol/1 eingestellt wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verhältnis der Konzentrationen von jeweils erstem Primerpaar zu jeweils zweitem Primerpaar kleiner als 1:10, vorzugsweise kleiner als 1:100, besonders vorzugsweise kleiner als 1:1000, ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweiten Primerpaare der Lösung vor der ersten Primerverlängerungsreaktion zugesetzt werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. e jeweils der dritte (p3) oder der vierte Primer (P4) häufiger verlängert wird als der jeweils andere Primer (P4, P3 ) der jeweiligen zweiten Primerpaare.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in dem beim Schritt lit. d bereitgestellten zweiten Primerpaar der dritte (P3) oder vierte Primer (P4) gegenüber dem jeweils anderen darin enthaltenen Primer (P4, P3 ) im Überschuss vorliegt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Lösung eine Mehrzahl erster Primerpaare zugesetzt wird, deren erste Primer (Pl) einen jeweils identischen oder nahezu identischen ersten Teilabschnitt (tl) und/oder deren zweite Primer (P2) einen jeweils identischen oder nahezu identischen dritten Teilabschnitt (t3) aufweisen und deren zweiter (t2) oder vierter Teilabschnitt (t4) jeweils spezifisch für genau eine der Nukleinsäuren S ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sequenzen der ersten (Pl) , zweiten (P2), dritten (P3) und vierten Primer (P4) so gewählt sind, dass sie bei dem Verfahren keine Primer-Dimere bilden und/oder nicht mit sich selbst oder untereinander hybridisieren.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sequenzen der Zwischenabschnitte z so gewählt sind, dass sie weder selbst noch die dazu komplementären Zwischenabschnitte z' bei dem Verfahren mit sich selbst oder mit den ersten (tl) , zweiten (t2), dritten (t3) oder vierten Teilabschnitten (t4) oder deren komplementären Sequenzen hybridisieren.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sequenzen der Zwischenabschnitte z so gewählt sind, dass
Hybride der Zwischenabschnitte z mit dazu jeweils vollkommen komplementären Nukleinsäuren eine im wesentlichen identische, insbesondere in einem Temperaturbereich von 5 °C liegende, Schmelztemperatur aufweisen würden.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum spezifischen Nachweis der einen Nukleinsäure S in Gegenwart einer sich von der einen Nukleinsäure S nur in einer in der einen Nukleinsäure S enthaltenen ersten Base unterschei- denden weiteren Nukleinsäure die Sequenzen der ersten (Pl) oder zweiten Primer (P2) so gewählt sind, dass sich die jeweilige Base des zweiten (t2) oder vierten Teilabschnitts (t4) , die zu der ersten Base oder einer dazu komplementären zweiten Base einer komplementären Nukleinsäure S' komplemen- tär ist, am 3 ' -Ende oder in der Nähe des 3 ' -Endes des jeweils ersten (Pl) oder zweiten Primers (P2) befindet.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweiten (t2) oder vierten Teilabschnitte (t4) eine Base enthalten, welche nicht zu einer ihr in der Position entsprechenden dritten Base im ersten Abschnitt der einen Nukleinsäure S oder im zweiten Abschnitt der Nukleinsäure S1 komplementär ist.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die jeweiligen Sequenzen der ersten (Pl), zweiten (P2), dritten (P3) und vierten Primer (P4) und der Sonde (So) so gewählt sind, dass jeweils die ersten, jeweils die zweiten, je- weils die dritten und/oder jeweils die vierten Bedingungen für den Nachweis der unterschiedlichen Nukleinsäuren S identisch sind.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sonde (So) jeweils an einer Elektrode (E) oder in deren unmittelbarer Nähe immobilisiert sind.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nachweis beim Schritt lit. h durch Erfassen einer Ände- rung einer fluoreszenzoptischen Eigenschaft oder einer durch das Hybridisieren bedingten Änderung einer elektrischen Eigenschaft an der Elektrode (E) erfolgt.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei als Änderung der elek- trischen Eigenschaft eine Änderung einer Redox-Eigenschaft, insbesondere bei der Oxidation von Guanin- oder Adenin-Resten der dritten Primerverlängerungsprodukte, einer Impedanz oder einer Leitfähigkeit über die Elektrode (E) gemessen wird.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der dritte (P3) und/oder der vierte Primer (P4) einen, insbesondere fluoreszenzoptisch oder mittels der Elektrode (E) elektrisch oder elektrochemisch nachweisbaren, vorzugsweise redoxaktiven, Marker aufweist.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Marker ein spezifisches Affinitätsmolekül, einen Osmium-Komplex, ein Nano- gold-Partikel, eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Ben- zochinon-, Naphthochinon- , Anthrachinon- oder p-Aminophenol- Gruppe, einen Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, oder einen Floureszenfarbstoff , insbesondere 6-FAM, HEX, TET, Cy3 , Cy5 , IRDye™700, IRDye™800, Biodipy, Flourescein, Joe, Rox, TAMRA oder Texas Red, aufweist.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei der Marker ein Affinitätsmolekül ist und dessen Nachweis mittels eines das Affinitätsmolekül spezifisch bindenden Gegenmoleküls erfolgt, wobei das Gegenmolekül mit einem Enzym konjugiert ist, wel- ches ein Substrat so umsetzen kann, dass das Reaktionsprodukt elektrochemisch oder optisch spezifisch nachgewiesen werden kann.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Vielzahl unterschiedlicher zu den Zwischenabschnitten z oder den dazu komplementären Zwischenabschnitten z ' komplementärer Sonden (So) verwendet wird, von denen jede an oder in unmittelbarer Nähe einer separaten Elektrode (E) gebunden ist.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Vielzahl einzeln kontaktierter oder kontaktierbarer auf einer Oberfläche, insbesondere einem Elektrodenchip, angeordneter Elektroden (E) verwendet wird.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine RNA indirekt nachgewiesen wird, indem sie in eine DNA umgeschrieben und die DNA dann als Nukleinsäure S nachgewiesen wird.
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31. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum parallelen Nachweis einer Mehrzahl unterschiedlicher Nukleinsäuren S enthaltend:
10 a) für jede nachzuweisende Nukleinsäure S je ein zusammen mit der Nukleinsäure S zur Durchführung einer PCR geeignetes erstes Primerpaar mit einem ersten (Pl) und einem zweiten Primer (P2) ,
15 wobei der erste Primer (Pl) einen 5 ' -endständigen ersten
Teilabschnitt (tl) sowie einen 3 ' -endständigen zweiten Teilabschnitt (t2) und der zweite Primer (P2) einen 5 ' -endständigen dritten Teilabschitt (t3) und einen 3 ' -endständigen vierten Teilabschnitt (t4) aufweist,
20 wobei die Sequenzen des zweiten (t2) und des vierten Teilabschnitts (t4) so ausgewählt sind, dass der zweite Teilabschnitt (t2) mit einem vorgegebenen ersten Abschnitt der jeweils nachzuweisenden Nukleinsäure S unter definierten ersten
25 Bedingungen und der vierte Teilabschnitt (t4) mit einem vorgegebenen zweiten Abschnitt einer zu der jeweils nachzuweisenden Nukleinsäure S komplementären Nukleinsäure S ' unter definierten zweiten Bedingungen spezifisch hybridisieren kann und
30 wobei ein den ersten (tl) mit dem zweiten Teilabschnitt (t2) verbindender für den zweiten Teilabschnitt (t2) spezifischer Zwischenabschnitt z oder ein den dritten (t3) mit dem vierten Teilabschnitt (t4) verbindender für den vierten Teilabschnitt '35 (t4) spezifischer Zwischenabschnitt z vorgesehen ist und b) für jede nachzuweisende Nukleinsäure S je ein zweites Primerpaar mit einem dritten (P3) und einem vierten Primer (P4), welches zusammen mit einem bei Anwesenheit der jeweils nachzuweisenden Nukleinsäure S mittels des ersten (Pl) und zweiten Primers (P2) erzeugbaren Primerverlängerungsprodukt zur Durchführung einer PCR geeignet ist und
wobei die Sequenzen des dritten (P3) und vierten Primers (P4) so gewählt sind, dass der dritte Primer (P3) mit einer zum ersten Teilabschnitt (tl) des ersten Primers komplementären Sequenz und der vierte Primer (P4) mit einer zum dritten Teilabschnitt (t3) des zweiten Primers komplementären Sequenz unter definierten dritten Bedingungen spezifisch hybridisieren kann .
32. Kit nach Anspruch 31, wobei darin für jede nachzuweisende Nukleinsäure S je eine Sonde (So) enthalten ist, welche jeweils mit dem Zwischenabschnitt z oder dem dazu komplementären Zwischenabschnitt z' unter definierten vierten Bedin- gungen spezifisch hybridisieren kann.
33. Kit nach Anspruch 32, wobei die Sonden (So) immobilisiert sind.
34. Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei die ersten Teilabschnitte (tl) der in dem Kit enthaltenen ersten Primer (Pl) gleich sind und/oder die dritten Teilabschnitte (t3) der in dem Kit enthaltenen zweiten Primer (P2) gleich sind.
35. Kit nach einem der Anspruch 31 bis 34, wobei die Sequenzen der Zwischenabschnitte z so gewählt sind, dass die vierten Bedingungen für alle Zwischenabschnitte z oder die dazu komplementären Zwischenabschnitte z' identisch sind.
36. Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 35, wobei eine Anordnung von Elektroden (E) enthalten ist, wobei an oder in unmittelbarer Nähe jeder Elektrode (E) der Anordnung jeweils eine Sonde (So) immobilisiert ist.
37. Kit nach Anspruch 36, wobei die Anordnung von Elektroden (E) ein Elektrodenchip ist.
38. Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 37, wobei statt des ersten Primerpaars Angaben der Sequenzen des ersten Teilabschnitts (tl) , des dritten Teilabschnitts (t3) und des Zwischenabschnitts z oder der dazu jeweils komplementären Sequenzen enthalten sind.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1910568A2 (de) * 2005-06-16 2008-04-16 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Navy Multiplex-polymerasekettenreaktion zur gentechnischensequenzanalyse
WO2013045700A1 (de) 2011-09-30 2013-04-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur räumlichen anordnung von probenfragmenten zur amplifikation und immobilisierung für weitere derivatisierungen
WO2016100388A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Cepheid Exponential base-greater-than-2 nucleic acid amplification
EP3378950A1 (de) * 2017-03-21 2018-09-26 Sequencing Multiplex SLK Einfache einschritt-amplifikation und -markierung (eosal)
US11352622B2 (en) 2018-10-29 2022-06-07 Cepheid Exponential base-3 and greater nucleic acid amplification with reduced amplification time

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI495727B (zh) * 2010-10-08 2015-08-11 Nat Applied Res Laboratories 微型電化學多重即時定量聚合酶連鎖反應(ｐｃｒ)系統
EP3276664B1 (de) * 2016-07-29 2020-11-11 LG Display Co., Ltd. Dünnschichttransistor, verfahren zur herstellung davon und anzeigevorrichtung damit

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996041012A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Genzyme Corporation Universal primer sequence for multiplex dna amplification
WO1997001646A2 (en) * 1995-06-27 1997-01-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
WO1999058721A1 (en) * 1998-05-12 1999-11-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Multiplex dna amplification using chimeric primers
WO2000047766A1 (en) * 1999-02-11 2000-08-17 Astrazeneca Ab Method for detecting variant nucleotides using arms multiplex amplification
WO2000055366A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Electropolymerizable film, and method of making and use thereof
WO2002014534A2 (en) * 2000-08-07 2002-02-21 Bioquant Limited Method of amplifying nucleic acids providing means for strand separation and universal sequence tags
DE10046184A1 (de) * 2000-09-18 2002-04-04 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Nachweis mindestens einer Nukleinsäuresequenz
WO2002059353A2 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Bio S & T Two-step amplification using a program primer followed by specific primers
WO2003060159A2 (en) * 2002-01-15 2003-07-24 Matforsk Methods of nucleic acid amplification

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994002634A1 (en) * 1992-07-24 1994-02-03 University Of South Australia Amplification and detection process
US5871918A (en) * 1996-06-20 1999-02-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
US5935793A (en) * 1996-09-27 1999-08-10 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers
DE19934084A1 (de) * 1999-07-15 2001-01-18 Universitaetsklinikum Charite Verfahren und Testbesteck zur Markierung von DNA-Fragmenten während einer PCR-Reaktion

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996041012A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Genzyme Corporation Universal primer sequence for multiplex dna amplification
WO1997001646A2 (en) * 1995-06-27 1997-01-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
WO1999058721A1 (en) * 1998-05-12 1999-11-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Multiplex dna amplification using chimeric primers
WO2000047766A1 (en) * 1999-02-11 2000-08-17 Astrazeneca Ab Method for detecting variant nucleotides using arms multiplex amplification
WO2000055366A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Electropolymerizable film, and method of making and use thereof
WO2002014534A2 (en) * 2000-08-07 2002-02-21 Bioquant Limited Method of amplifying nucleic acids providing means for strand separation and universal sequence tags
DE10046184A1 (de) * 2000-09-18 2002-04-04 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Nachweis mindestens einer Nukleinsäuresequenz
WO2002059353A2 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Bio S & T Two-step amplification using a program primer followed by specific primers
WO2003060159A2 (en) * 2002-01-15 2003-07-24 Matforsk Methods of nucleic acid amplification

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROWNIE JANNINE ET AL: "The elimination of primer-dimer accumulation in PCR" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, Bd. 25, Nr. 16, 1997, Seiten 3235-3241, XP002152588 ISSN: 0305-1048 in der Anmeldung erw{hnt *
INNIS, M., GELFAND, D., SNINSKY, J.: "PCR applications, protocols for functional genomics, chapter 6, Multiplex PCR: optimization guidelines" Mai 1999 (1999-05) , ACADEMIC PRESS , SAN DIEGO, USA XP002276448 Seite 73 -Seite 94 *
PASTINEN T ET AL: "MINISEQUENCING: A SPECIFIC TOOL FOR DNA ANALYSIS AND DIAGNOSTICS ONOLIGONUCLEOTIDE ARRAYS" GENOME RESEARCH, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, US, Bd. 7, Nr. 6, 1. Juni 1997 (1997-06-01), Seiten 606-614, XP000699761 ISSN: 1088-9051 *
SHUBER A P ET AL: "A SIMPLIFIED PROCEDURE FOR DEVELOPING MULTIPLEX PCRS" GENOME RESEARCH, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, US, Bd. 5, Nr. 5, 1. Dezember 1995 (1995-12-01), Seiten 488-493, XP000546034 ISSN: 1088-9051 *
THORP H H: "Cutting out the middleman: DNA biosensors based on electrochemical oxidation" TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, Bd. 16, Nr. 3, 1. M{rz 1998 (1998-03-01), Seiten 117-121, XP004108589 ISSN: 0167-7799 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1910568A2 (de) * 2005-06-16 2008-04-16 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Navy Multiplex-polymerasekettenreaktion zur gentechnischensequenzanalyse
EP1910568A4 (de) * 2005-06-16 2010-05-19 Us Gov Sec Navy Multiplex-polymerasekettenreaktion zur gentechnischen sequenzanalyse
WO2013045700A1 (de) 2011-09-30 2013-04-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur räumlichen anordnung von probenfragmenten zur amplifikation und immobilisierung für weitere derivatisierungen
DE102011054101A1 (de) * 2011-09-30 2013-04-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur räumlichen Anordnung von Probenfragmenten zur Amplifikation und Immobilisierung für weitere Derivatisierungen
US11028434B2 (en) 2014-12-15 2021-06-08 Cepheid Exponential base-greater-than-2 nucleic acid amplification
CN107429292A (zh) * 2014-12-15 2017-12-01 塞弗德公司 底数大于2的指数核酸扩增
US10273534B2 (en) 2014-12-15 2019-04-30 Cepheid Exponential base-greater-than-2 nucleic acid amplification
WO2016100388A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Cepheid Exponential base-greater-than-2 nucleic acid amplification
CN107429292B (zh) * 2014-12-15 2021-12-17 塞弗德公司 底数大于2的指数核酸扩增
US11952621B2 (en) 2014-12-15 2024-04-09 Cepheid Exponential base-greater-than-2 nucleic acid amplification
EP3378950A1 (de) * 2017-03-21 2018-09-26 Sequencing Multiplex SLK Einfache einschritt-amplifikation und -markierung (eosal)
WO2018172348A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 Sequencing Multiplex Sl Easy one-step amplification and labeling (eosal)
US11352622B2 (en) 2018-10-29 2022-06-07 Cepheid Exponential base-3 and greater nucleic acid amplification with reduced amplification time

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