WO2009056350A1 - Einschritt-multiplex-immuntest - Google Patents

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WO2009056350A1
WO2009056350A1 PCT/EP2008/009249 EP2008009249W WO2009056350A1 WO 2009056350 A1 WO2009056350 A1 WO 2009056350A1 EP 2008009249 W EP2008009249 W EP 2008009249W WO 2009056350 A1 WO2009056350 A1 WO 2009056350A1
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WO
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detection
biochip
cartridge
reaction
reaction chamber
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PCT/EP2008/009249
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Friedrich Menges
Jenny Zähringer
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Zenteris Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to a system and a method for the immunological detection of a plurality of substances or a substance with multiple features in one step, wherein the detection reaction is based on a sandwich-type immunoassay and in particular characterized in that it is easy to perform and is designed as a "one-pot reaction", which means that all detection steps are carried out in a reaction batch without rinsing steps and only with a single addition of reagents.
  • Immunoassays enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), fluorescence labeling coupled immunoassay (FLISA) or immunoassay labeled with another label are used in routine diagnostics and research to detect and quantify proteins, such as antigens, ligands, receptors, antibodies, and chemical compounds now routinely used.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
  • FLISA fluorescence labeling coupled immunoassay
  • immunoassay labeled with another label are used in routine diagnostics and research to detect and quantify proteins, such as antigens, ligands, receptors, antibodies, and chemical compounds now routinely used.
  • the protein to be detected ie the antigen (AG)
  • a solid carrier eg a polystyrene microtiter plate
  • DAK detection antibody
  • an antigen-specific binding partner the so-called capture antibody (FAK)
  • FAC capture antibody
  • the enzyme-linked immunosorbent assay involves the coupling of an enzyme to the DAKs, which catalyzes a color reaction in a third step (eg horseradish peroxidase (HRP) + tetramethylbenzidine (TMB)), thus visualizing a positive test result.
  • HRP horseradish peroxidase
  • TMB tetramethylbenzidine
  • FLISA fluorescent labeled immunoassay
  • the DACs are either directly labeled with a fluorescent label or with another binding partner to which a secondary detection system can bind (eg biotin label + Cy5-streptavidin).
  • adsorb the FACs to a solid support and add the other reagents needed for assay performance as separate components to the test kits.
  • DAKj in coupled form (ie conjugate)
  • a secondary detection system for preparing the working solutions for the second specific binding partner as well as for the secondary reagent Since a wash step is required between the steps, a conventional immunoassay kit also contains a wash buffer, usually in concentrated form.
  • WO 02/090983 A2 already describes a form of immunoassay which is simpler to use in the application and which contains only one washing step instead of several.
  • the FAK is adsorbed on the support (eg microtiter plate), but also in lyophilized form of the DAK and possibly the enzyme coupled thereto. All that remains to be done is to add the sample to be determined in the assay buffer, which reconstitutes the lyophilizate and builds up the sandwich of FAK, AG and DAK in one step. But then follows a washing step and the sequential addition of the substrate and stop solution in the case of an enzymatic Color reaction. Therefore, one can not speak of an equilibrium sandwich reaction. The quantification is carried out as usual in a plate reader. However, there is no "real" parallel reaction and thus comparability of the reactions is not guaranteed, which significantly reduces the reproducibility of the assay.With regard to desired automation, increased sample throughput and cost, however, this method is already an improvement to the standard ELISA.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for the immunological detection of several substances or a substance having a plurality of features in one step, which is particularly characterized in that all detection steps are carried out in a reaction mixture without rinsing steps and only with a single addition of reagents ,
  • bio-chip also microarray, chip, protein (Bio) chip, probe array called
  • the required biochemical reactions and detection take place in a cartridge after a single filling with all reagents without further intervention of the user, ie in a "one-tube” reaction, or even “one-pot reaction” .
  • This requires the establishment of an immunological detection , in which all detection steps are carried out in a reaction mixture without rinsing steps and subsequent addition of reagents.
  • the layout for the protein bio-chip clearly defines which binding partner (eg antibody) is at which place (spot) Software is deposited and is called up after an image acquisition for analysis of the data contained substances to be detected (eg antigens) react specifically with a detection partner (eg detection antibody) and bind to the associated capture partner (eg capture antibody) on the protein bio-chip, a measurable signal is generated by the coupled label (eg fluorescent dye).
  • the layout can then be used to determine exactly which binding partner (eg antibody) it is and to deduce the substance to be detected.
  • the invention finds application for the detection of a plurality of substances or features side by side (multiplex format) based on a sandwich detection principle (e.g., ELISA, indirect or competitive detection).
  • the assay can be used to detect proteins (e.g., antigens, antibodies), ligands, receptors, steroids, chemicals, drugs, toxins, bacteria, viruses, and the like.
  • proteins e.g., antigens, antibodies
  • ligands, receptors, steroids chemicals, drugs, toxins, bacteria, viruses, and the like.
  • it is also suitable for vaccine titre determination.
  • it is suitable for multiplex detection of bioweaponable toxins, mycotoxins, bacteria and viruses, in particular ricin, staphylococcal enterotoxin B (SEB), botulism toxins A and B.
  • SEB staphylococcal enterotoxin B
  • the detection of the reaction complex via the intensity measurement of a label.
  • the label may be attached directly to the detection binding partner (eg detection antibody) or by means of a directly coupled enzyme (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) or via an enzymatic reaction which takes place via a secondary step (biotin-streptavidin-HRP, neuramidin, Dioxigenin / anti-dioxigenin, enzyme-linked antibodies to the detection antibody, etc.).
  • a directly coupled enzyme eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc.
  • an enzymatic reaction which takes place via a secondary step
  • Any label that can be coupled directly to the reaction complex or a secondary partner and is suitable for performing an immunoassay such as fluorochromes, chemiluminescence labels, radioactive labels and the like. can be used.
  • biochemical reagent mixtures used in this method temperature control for the course of the reactions and a final evaluation algorithm are explained below, wherein an antigen detection via an antibody-antigen-antibody reaction and as a detection label the measurement of the fluorescence selected which, as stated above, is not the only possibility and should not be construed restrictively.
  • the sample containing the substances to be detected if in solid form, is taken up in a suitable buffer and placed in the biotestmix tube. If the sample is already liquid, it can be added to the Biotest mix immediately. 2. This mixture is introduced with a pipette into the sample space of a cartridge,
  • the cartridge is processed.
  • the process parameters are coded in the cartridge and stored in the software. Temperatures in the range between room temperature and 100 ° C. can be controlled for any time intervals.
  • the fluid is mechanically displaced over the biochip, and an image is taken in the fluorescence channel.
  • the software evaluates the spot intensities using the array layout and provides information about the presence of the antigens to be detected in the sample.
  • Steps 4 - 6 are fully automatic.
  • the entire detection system consists of: o Biotestmix tube for preparation of the detection o Disposable cartridge for sample collection o Device for processing the cartridge o Software for processing and evaluation
  • a component of the test is a prefabricated tube in which the DAK necessary for the detection, the antibody (s) or the antigen (s) of the Positive control and other buffer components in lyophilized form or in liquid (aqueous) form are present (biotest mix).
  • the DAKs may be fluorescently labeled, it is also possible to build up a detection cascade via a further binding step (eg biotin-labeled DAK and fluorescence-labeled streptavidin), all reagents necessary for this purpose are then also part of the biotestmix.
  • the bioassay mixture preferably contains an immunoassay assay buffer system (e.g., PBS buffer), at least one protein for stabilization (e.g., bovine serum albumin), and detection antibodies (directly fluorescently labeled or optionally biotinylated). If the detection antibody is biotinylated, the biotest mix further contains a streptavidin-labeled fluorescent dye (for sandwich detection).
  • an immunoassay assay buffer system e.g., PBS buffer
  • at least one protein for stabilization e.g., bovine serum albumin
  • detection antibodies directly fluorescently labeled or optionally biotinylated
  • the biotest mix further contains a streptavidin-labeled fluorescent dye (for sandwich detection).
  • the Biotestmix contains antibodies (eg interleukin-12 antibodies) as a positive control, which serve as a "model system” to check the functionality of the biological system, with successful antibody-antigen-antibody interaction (mouse interleukin-12 - interleukin 12 Anti-mouse interleukin-12) during the processing produces a fluorescence signal which demonstrates the functionality as a positive control
  • the biotest mix is liquid, at least one detergent, preferably Triton-X (eg Triton X-100 or Triton X-50), is also present therein
  • the detergent (s) is contained in a reconstitution solution (aqueous assay buffer) to contain the lyophilisate.
  • a stabilizer is preferably added because the macromolecules (e.g., antigen, antibodies) are very susceptible when they are not in their natural environment. In particular, when drying the spots on the bio-chip, the activity can be drastically reduced. Thus, it has been found that trehalose in biotestmix has a protective effect on stability and activity. By incorporating water of crystallization during drying, the trehalose matrix provides maximum protection. The hydration shell is preserved and preserved the native conformation of the proteins, which increases the shelf life.
  • the macromolecules e.g., antigen, antibodies
  • antibodies for most of the antigens to be detected (e.g., toxins, bacteria, viruses), various commercially available antibodies (monoclonal and / or polyclonal) already exist which can be used for the detection reaction.
  • the selection of suitable antibodies is a key process to prevent cross-reactions, which can occur more often due to the system properties, since it is deliberately omitted washing steps.
  • the present immunological detection method dispenses with washing steps, the antibodies may well be less "robust" than in the conventional microtiter plate ELISA signal enhancement is achieved over the use of polyclonal antibodies, since monoclonal
  • Antibodies have only one epitope and thus bind only one antigen. When using polyclonal antibodies, several antigens can bind to this antibody, but it is only coupled to a single fluorescent molecule, i. the signal strength could be lower.
  • Biotestmixes are mixed together in appropriate concentrations and mixed for the detection reaction with the corresponding ready-made sample.
  • a preferred final composition of the biotest mix includes: Component ⁇ anz preferred Conc. Preferred Conc
  • the actual immunoassay is carried out in such a way that catcher antibodies are immobilized on the biochip in spots which specifically recognize and bind certain antigens in the sample liquid to be analyzed.
  • the reaction solution contains detection antibodies which specifically recognize and bind to certain antigens in the sample to be analyzed, and which are directly or indirectly coupled to a dye.
  • the sample is mixed with the reaction solution and introduced into the reaction space with biochip. Under the influence of a defined temperature profile, the antigens of the sample to be analyzed bind specifically to the corresponding capture antibodies on the bio-chip surface.
  • the immunoassay is running in a closed compartment from ⁇ sample space) can be generated in the defined temperatures between room temperature and 100 0 C.
  • the sample room is part of a disposable cartridge.
  • biochip Another component of the sample space is a solid support (biochip) on which the FACs are immobilized.
  • the biochip can z.
  • the biochip has a commercial size and is about 2-5 x 2-5 mm in size, preferably square.
  • the immobilization is preferably carried out by covalent coupling of the FAK to a functionalized coating of the biochip, such as Example, the coupling of lysine amino groups to an epoxy silane functionalized glass carrier.
  • Another function of the biochip coating is to prevent non-specific binding of the antigen to the surface of the biochip.
  • an epoxysilane-functionalized carrier it would also be possible to use an aminopropylsilane, aldehyde or poly-L-lysine-functionalized carrier.
  • the immobilization is carried out spatially resolved for each FAK variety individually in separate areas (spots) on the biochip.
  • the spot size is between 50 and 200 ⁇ m, the spot distance of 100 - 300 ⁇ m.
  • Each FAK variety is duplicated (replicates), it may be 2-24, preferably 4 -12, most preferably 6, positions. Furthermore, there are positions at which process controls take place, such. B. Positive and negative controls.
  • Sandwich ELISA with immobilized capture antibodies described in more detail, this being understood as a possible exemplary embodiment and is not construed limiting. With regard to the cartridge and the measuring procedure, various variations are possible which ensure successful implementation of the method according to the invention.
  • a small amount e.g., 2 ⁇ l
  • the biotest mix reconstituted with Triton-X containing buffer standard laboratory pipette
  • the resulting reaction mixture (about 40 ⁇ l) is completely injected into the reaction chamber of the cartridge.
  • the cartridge is then inserted into the processing device and the analysis process is started.
  • the antibody-antigen reaction In the closed reaction chamber of the cartridge is now the antibody-antigen reaction. Basically, this works like a sandwich immunoassay, with three bonds between four "proteins" (general peptides) come about. Spotted on the bio-chip is covalently bound the capture antibody (FAK), which specifically binds to an epitope of the antigen (AG) (eg ricin). Then there is the biotin-labeled detection antibody (DAK), which in turn is specific but to another Epitope of the antigen (AG) binds.
  • FAM capture antibody
  • DAK biotin-labeled detection antibody
  • SA fluorescent dye-labeled Streptavidin
  • the process in e.g. Standard ELISA is such that a washing step is performed between each specific binding reaction. First, only the (AG) is added, after a reasonable time is washed, all unbound antigen is removed. Then the (DAK) is added which binds specifically to the (AK) - (AG), then washed again and the unbound (DAK) removed. Next step: adding the "visualization protein". In the standard ELISA procedure, it is finally washed again to minimize the background for image capture. The selection of antibodies for such a detection method will therefore, in addition to the specificity, above all work towards the fact that the washing steps are withstood as well as possible.
  • the (FAK) - (AG) bond has to withstand the wash puff procedure three times, the (AG) - (DAK) bond at least two washes, etc.
  • the influence of temperature is such that at higher temperature re-breaking of a suboptimal bond takes place more easily / more quickly, ie the equilibrium is reached more quickly.
  • the rate of diffusion depends, inter alia, on the molecular size, in particular a protein complex such as (AG) - (DAK) takes longer to diffuse to the (FAK) than if the constituents move there individually.
  • the detergent eg Triton-X
  • the viscosity of the solvent naturally also has a direct effect on the diffusion.
  • the bonds are never even put to the test due to the lack of washing steps; the decisive factor is the sufficiently rapid generation of the cascade (FAK) - (AG) - (DAK). Accordingly, antibodies obtained by the standard immunological method, e.g. ELISA methods, give optimal results, be unsuitable for the system of the invention, and vice versa, antibodies which give poor results in the standard immunological method (e.g., ELISA methods) may be optimal for the system of the invention.
  • the standard immunological method e.g. ELISA methods
  • a cartridge is required in which after the filling with the sample liquid different temperature curves can be adjusted so that the corresponding biological reaction takes place, and then carried out the optical detection.
  • This cartridge acts as a biological microreactor in which all biochemical reactions are controlled for the analysis of biological samples.
  • cartridge I which includes: a reaction space containing the biochip with applied reaction fields (spots) with known fixed capture molecules,
  • a filling device for introducing the sample liquid in the
  • the cartridge I is an inlay with a biochip in the reaction chamber.
  • MxN spots (reaction fields) with different biological information are arranged.
  • On each spot known catcher molecules are fixed, which connects only with one particular type of molecule from the sample liquid to be examined. The biological detection reaction is after the
  • a defined temperature profile is driven and the molecules are selectively bound to the spots on the biochip.
  • the dye molecules chemically bound to these molecules can then be detected by means of an optical module and suitable optical fluorescence measurement methods.
  • the cartridge I and the measuring method can be described as follows in a preferred embodiment:
  • a silicone seal may be provided which can be pierced with a cannula for filling the sample space.
  • the biochip 6 (FIG. 2) contains a number of M N reaction fields 6.1. To avoid optical back reflections and unwanted (fluorescence) radiation from the flex circuit board, the biochip on the back is optically opaque and non-fluorescent, e.g. coated with black chrome 6.2.
  • the biochip 6 is fixed on the flex circuit board 10, and then the flex circuit board is connected to the base board 1.
  • the connection between the flex PCB and the biochip takes place with an adhesive bonding layer, such as a suitable adhesive tape (suitable for biological reactions) or with a bonding tape Silicone glue, finally the Flex-LP is adjusted with the applied biochip to the basic body and fixed and forms the inlay.
  • a durable, temperature and water resistant compound can be realized eg by means of biocompatible adhesive tape, with silicone adhesive, by laser welding, by ultrasonic welding or other biocompatible adhesives.
  • a second possibility of the connection of Flex-LP, Biochip and body consists in the targeted surface bonding of the biochip with the Flex-LP (adhesive only under the biochip) and the subsequent fixation of the body only outside the reaction space. With this type of bonding, the heat transfer from the heating structure 10.3 in the Flex-LP into the reaction space is more efficient.
  • the pre-assembled unit of the inlay consisting of base plate, biochip, flex circuit board and non-return valve, is pressed into a cartridge for easier handling and stabilization.
  • the sample liquid is injected through the check valve 8 or through the silicone seal through the filling channel 7 into the reaction space.
  • the sample liquid first fills the reaction chamber 5 and then flows into the equalization channel 4.
  • an overpressure is created in the inlay system and the air in the compensation chamber is compressed.
  • the filling level can be monitored. Since the volumes of the filling channel 7, the reaction space 5 and the compensation channel 4 are known, can be filled with a constant volume of liquid, even without viewing the optical window.
  • the pressure-tight closure with the check valve 8 or the silicone gasket generates an overpressure in the reaction chamber when filling the cartridge.
  • the air in the Compensation volume is compressed.
  • the overpressure can be adjusted in a targeted manner.
  • the internal pressure doubles during filling.
  • the thermal expansion of the sample liquid leads to a deflection in the compensation channel 4.
  • a stabilizing disk inserted into the cartridge can minimize expansion of the elastic flex circuit board 10 during the filling process without losing the ability of resiliently pressing the biochip 6 against the detection surface.
  • a pressure increase of 1 bar in the cartridge has the advantage that the boiling point of the sample liquid increases.
  • the formation of air bubbles in the reaction space is thus minimized and the mixing of the reaction components is facilitated.
  • the course of a temperature-controlled biological detection reaction requires the adjustment of accurate temperatures of the sample liquid in the reaction space, i. a reaction chamber whose temperature can be adjusted. It will be at the
  • Carrying out an ELISA for example, temperatures between 20 0 C and 50 0 C, preferably between 30 c C and 40 0 C 1 most preferably between 35 0 C and 39 ° C, driven.
  • the temperature distribution of the sample liquid must be homogeneous in the reaction space and temperature changes (heating, cooling) should be fast.
  • temperature is an important component. In the broadest sense, it is the driving force that provides the necessary activation energies.
  • the batch is controlled with cyclic temperature, alternately for 30 minutes between 30 0 C and 4O 0 C is changed with holding times of 30 seconds and then at 37 ° C an image is generated.
  • a heating structure 10.3 which acts as a heater when current through the ohmic resistance.
  • the heating structure can be used simultaneously as a temperature detector by using the resistance characteristic R (T) to determine the temperature.
  • the printed circuit board with the integrated heating tracks causes local temperature fluctuations. Directly above the heating structures are hotspots. A preferably applied temperature homogenization layer on the printed circuit board causes a homogenization of the temperature distribution on the upper side of the printed circuit board.
  • a heater integrated in the printed circuit board has a low own heat capacity. Thus, higher heating rates GT (t) of the sample liquid can be realized in the reaction space.
  • the cooling of the sample liquid in the reaction chamber is carried out either by means of air, cooled air or mounted heat sinks.
  • the flex circuit board 10 When using the cartridge I after performing an immunoassay, the flex circuit board 10 is elastically deformed by pressing the plunger 12 so that the glued biochip 6 presses against the detection surface (FIG. 3). To overcome the air pressure in the compensation chamber, a force Fo must be expended. With an area of about 0.5cm 2 you only need about 5N to build up a pressure of 1 bar. In addition, a certain force Fi still has to be expended in order to deform the elastic flex-LP with applied biochip 6 by means of a plunger 12 in such a way that the biochip is pressed uniformly against the detection surface. The sum of the forces F 0 + F 1 should not exceed 3ON.
  • the supernatant fluid When ramming thus the supernatant containing dye molecules sample liquid, the supernatant fluid is pushed away between biochip and detection surface. It fills the equalization channel and the equalization chamber.
  • the illumination unit of the optical module 27 only excites the dye molecules bound on the biochip for fluorescence.
  • the detection unit of the optical module 27 detects only the fluorescent light of the dye molecules bound on the biochip after ramming.
  • the illumination of the biochip takes place via a suitable light source, which is adapted to the dye used in the sample solution.
  • a light source are preferably laser and LED.
  • One function of the optics module is the realization of homogeneous biochip illumination. This can be realized with a suitable optical module. By means of a rectangular aperture, mechanically applied to the base body over the reaction space or integrated into it, with the geometric dimensions slightly smaller than the biochip, the optical fluorescence excitation of the dye in the reaction space next to the biochip is prevented.
  • This diaphragm can be introduced as an optically absorbing diaphragm during injection molding of a transparent base body or during injection molding of a nontransparent basic body as a transparent optical diaphragm.
  • the aperture can also be subsequently applied to the optical observation window (detection surface).
  • the transmission of the diaphragm layer should be less than 10 "2 .
  • the possibility of continuing the immunoassay in the cartridge used according to the invention is possible , If the plunger is moved back, the Flex-LP deviates due to the overpressure in the reaction chamber and the sample liquid from the compensation channel flows back into the reaction chamber, also between the biochip and the cover glass. This can be continued even after detection of the ELISA. In particular, a real-time detection is possible.
  • the cartridge II which is possible as an alternative to the cartridge I described above preferably comprises:
  • reaction chamber a reaction chamber and a biochip arranged in the reaction chamber
  • a compensation chamber communicating with the reaction chamber is connected, wherein the reaction chamber, the compensation chamber and all connected lines form a closed up to the filler neck space, the filler neck forms a free passage from outside the cartridge to the reaction chamber, and a plug provided is that is positively and tightly received in the filler neck so that it displaces fluid from the filler neck in the direction of the reaction chamber when pushing over a certain way.
  • the sample solution can be easily filled eg with a standard pipette. No syringe is needed to puncture a membrane. No pressure has to be built up to penetrate a valve. There is no force or counter pressure during filling, which must be overcome in order to introduce the sample into the cartridge. The filling is thus carried out without pressure. There is no danger that some of the samples will be spilled during filling.
  • the sample solution is pressurized when the stopper is pushed in. This raises the boiling point. As a result, even when heated to temperatures in the range of about 100 0 C in the sample solution no gas bubbles that could affect the measurements.
  • the air in the equalization chamber acts on the sample solution like an elastic spring element, which allows further displacement of sample solution, wherein the restoring force exerted by the air on the sample solution is small.
  • the open filler neck communicates via lines communicating with the reaction chamber, a level indicator and the compensation chamber, so that prevails before filling in all cavities of the cartridge Il ambient pressure or normal pressure.
  • the filler neck fills up. Pushing in the stopper compresses the air in the cartridge. Since the sample chamber, expansion chamber and filler neck are communicating, the pressure in the entire vascular system is compensated simultaneously.
  • the volumes are dimensioned so that the reaction chamber is completely filled with sample liquid and an internal pressure of 0.3 to 0.5 bar and preferably about 0.4 bar is generated. A movement of the stopper minimizes the pressure and ensures a movement of the liquid in the sample chamber, which causes mixing.
  • the cartridge Il has an open filler neck.
  • the region of the cartridge opposite the biochip is designed as a transparent film.
  • the flexible transparent film serves as a window for the optical measurements of the sample solution.
  • one side of the reaction chamber is bounded by a printed circuit board.
  • the biochip is located directly on the circuit board. Heating / measuring structures can be integrated in this printed circuit board. Such a printed circuit board is used for heating and measuring the sample solution.
  • the cartridge II is preferably made of COC (cycloolefin copolymer). This is an inert plastic material that does not require additional passivation of surfaces to conduct temperature-controlled biological reactions in the reaction chamber.
  • COC cycloolefin copolymer
  • the transparent plastic film may be provided on its side facing the biochip with an adhesive or adhesive layer which can be activated when it comes in contact with the sample solution.
  • an adhesive or adhesive layer which can be activated when it comes in contact with the sample solution.
  • This adhesion or adhesive layer is preferably provided on the region of the film which does not come into contact with the area containing the spots of the biochip. The adhesion or adhesive layer is thus arranged circumferentially around the active region of the biochip.
  • the cartridge 101 includes, e.g. by means of injection molding made of plastic elongated approximately shell or trough-like housing 102 on.
  • the housing 102 comprises a base wall 103 and a circumferential side wall 104 with two longitudinal sides 105 and two end sides 106.
  • the side of the housing 102 on which the side wall 104 is arranged is referred to as inner side 107.
  • a printed circuit board 108 is attached to the housing 102.
  • This side of the housing 102 is referred to as outside 109.
  • a tubular section extending in the longitudinal direction is formed as a filler neck 110.
  • Filler neck 110 has a filling portion 111 and a compression portion 112.
  • the compression portion 112 is a cylindrical portion 116 of circular cross-section, which merges into a funnel-shaped portion 117, at the end of a filling opening 118 is formed.
  • the filling opening 118 is connected to a reaction chamber 122 via a filling line section 120.
  • a filling indicator 119 is provided in the cylindrical portion 116 of the compression portion 112.
  • the filling section 111 has a larger inside width than the compacting section 112.
  • a chamfer 113 is provided as a transition between the filling portion 111 and the compression portion 112. This chamfered portion 112 has approximately in the middle of a sealing point 114, from which a plug 115 closes the filler neck 110 tight.
  • a compensation line section 123 is connected to the tip of the diamond-shaped through-opening 121, which is oriented in the direction of the filler neck 110, and terminates in a tip of a half-cone-shaped compensation chamber 124.
  • a through hole 125 Adjacent to the tip of the rhombic through hole 121 is a through hole 125.
  • This through hole 125 forms a filling indicator 127 in conjunction with a hemisphere 126 of transparent plastic.
  • the reaction chamber 122 or the passage opening 121 is bounded by a flexible transparent film 128.
  • the film 128 is adhered to the base wall 103.
  • the film 128 is preferably formed from a perfluoroethylene propylene copolymer (FEP) or other suitable plastic.
  • FEP perfluoroethylene propylene copolymer
  • the flexible transparent film 128 serves as a window for the optical measurements of the sample solution.
  • a circumferential seal 129 is disposed in the region around the passage opening 121.
  • the printed circuit board 108 forms a boundary wall of the same in the region of the diamond-shaped through-opening 121 or the reaction chamber 122. In the region of the filling line section 120, the equalizing line section 123, the filling indicator 127 and the compensation chamber 124, the printed circuit board 108 closes so tightly with these recesses that they are bounded downward and form a continuous, communicating, channel structure.
  • the printed circuit board 108 includes contact pads, a digital storage medium (e.g., an EEPROM), and an internal heating / measuring structure 132, which will be discussed in greater detail below.
  • a digital storage medium e.g., an EEPROM
  • an internal heating / measuring structure 132 which will be discussed in greater detail below.
  • the printed circuit board 108 can also be provided for heating and cooling, a plate made of a highly thermally conductive material with a micro-Peltier element arranged thereon.
  • a biochip 130 is arranged on the printed circuit board 108.
  • the biochip 130 has a height of about 0.7 mm and a number of MxN spots.
  • the biochip 130 on the backside is optically opaque and non-fluorescent, e.g. coated with black chrome.
  • the reaction chamber 122 is limited.
  • the circuit board 108 is provided with the heating / measuring structure to heat the biochip 130 to a predetermined temperature and to measure the temperature.
  • the film 128 serves as a viewing window for an optical detection device, which passes through the film 128 through optical spots located on the biochip 130. Since the film 128 is flexible, it can be applied to scan the biochip 130 on the surface thereof.
  • a plug 115 is provided for closing the filler neck 110 and for generating the overpressure in the reaction chamber 122.
  • the plug is preferably formed of a thermoplastic elastomer (TPE).
  • TPE thermoplastic elastomer
  • the plug 115 is formed cylindrically with a circular cross section. The outer diameter of the plug 115 is designed such that it can be received almost free of play in the compression section 112 of the filler neck 110.
  • the cylindrical compression portion 112 of the filler neck 110 and the plug 115 form a kind of cylinder-piston system.
  • the plug 115 is provided with a sealing ring 131 of preferably the same material as the plug.
  • the plug 115 may also be provided with a circumferential groove in which a sealing ring 131 is arranged. The plug 115 seals the cavities of the cartridge 101 in a fluid-tight manner after it has been inserted into the filler neck 110 about one third of its length.
  • a circular centering pin 144 is integrally formed in the area of the tip of the reaction chamber 122 which is oriented in the direction of the compensation chamber 124.
  • the centering pin 144 serves as a centering when placing the scanning chamber.
  • the filling and equalizing line sections 120, 123 are formed as short as possible and with the smallest possible cross section, so that the dead volume is kept small and the necessary excess of sample liquid is kept small.
  • the line sections 120, 123 are nevertheless guided around the reaction chamber 122, so that during filling, in which the filler neck 110 is arranged at the top, the reaction chamber 122 fills from below. As a result, a bubble-free filling of the reaction chamber 122 is ensured.
  • the filler neck 110 is arranged at the bottom and the compensation chamber 124 at the top, so that sample liquid can be displaced reversibly into the compensation chamber 124, the bubble being always above the sample liquid in the compensation chamber 124.
  • the course of a temperature-controlled biological detection reaction requires the setting of accurate temperatures of the sample liquid in the reaction space.
  • temperatures between 2O C and 50 ° C, preferably between 30 and 40 0 C, most preferably driven between 35 ° C and 39 ° C in the implementation of an ELISA.
  • the temperature distribution of the sample liquid must be homogeneous in the reaction space and temperature changes (heating, cooling) should be fast.
  • Temperature is an important component for the optimal performance of an immunoassay. In the broadest sense, it is the driving force that provides the necessary activation energies.
  • the batch is controlled with cyclic temperature, alternating alternately for 30 minutes between 3O 0 C and 40 0 C with holding times of 30 seconds and then at 37 ° C an image is generated.
  • a heating / measuring structure 132 which acts as a heater when current through the ohmic resistance.
  • the heating / measuring structure 132 can be used simultaneously as a temperature detector by using the resistance characteristic R (T) for determining the temperature.
  • the printed circuit board 108 may be provided with a temperature homogenizing layer which effects homogenization of the temperature distribution on the upper side of the printed circuit board 108.
  • the electrical control of the heating / measuring structure 132 is described in detail in WO 2008/064865 A2. This document is referred to the control of the heating / measuring structure 132.
  • the printed circuit board 108 has printed conductors 137 and corresponding contact points 138, 139 for connecting a semiconductor electrical memory. This
  • Semiconductor memory is used to store calibration data for the heater and the data of the biological experiments to be performed on the biochip of the cartridge. These data are thus stored without confusion.
  • This device comprises a sampling chamber 140, a detection device 149 and a compressed air supply source 150.
  • the tubular sampling chamber 140 is placed with an open sample side 141 on the reaction chamber 122 bounding film 128 and on the seal 129 disposed thereon.
  • the diameter of the tube 140 on the sample side 141 corresponds to the
  • the sample side 141 is frontally bounded by a sharp-edged circumferential blade 142.
  • the blade 142 is designed in such a way that when the scanning chamber 140 is placed on the cartridge 101, it penetrates into the seal 129 of the cartridge 101 and provides a pressure-tight connection.
  • Recesses 143 are provided on the sample side 141 of the tube 140 in order to receive the centering pin 144 and the two stops 145 of the cartridge 101. In this way, the sampling chamber 140 is positioned exactly on the cartridge 101 or its seal 129 and above the reaction chamber 122. By the stops 145 of the exact contact pressure is adjusted with which the sampling chamber 140 rests pressure-tight on the cartridge 101.
  • a compressed air line 148 is connected, which is connected to a compressed air supply source 150.
  • the sampling chamber 140 in the region between the lenses 147 and the cartridge 101 can be acted upon with compressed air. In this way, the film 128 is applied flat to the biochip 130.
  • a detection device 149 for scanning the biochip 130 is arranged.
  • the detection device 149 for reading out the biochip 130 is described in detail in WO 2007/135 091 A2, to which reference is hereby made.
  • the Optical detection device 149 comprises an LED with molded plastic optics (preferably Lambert LED), an LED optics, an illumination optics, an excitation filter, a dichroic mirror, a NA diaphragm, an emission filter, a readout optics and a camera.
  • a single high power LED having a high optical power density and a high numerical aperture (NA) LED optics is used.
  • High-performance light-emitting diodes are light-emitting diodes with a luminous flux of at least 35 Im.
  • Light-emitting diodes with a luminous flux of at least 40 Im, at least 50 Im or at least 100 Im are preferably used.
  • the light emitting diode Luxeon Star red, 1 W electrical power consumption, 42 in the luminous flux
  • An advantage of a LED for illuminating biochips lies in the variability of the wavelength. LEDs are available throughout the visible spectrum with high efficiency.
  • a spectrally well adapted LED can be used as the light source.
  • a spectrally well adapted LED can be used as the light source.
  • ⁇ E which is required for fluorescence measurements (eg for dyes Cy5, Cy3, Alexa, etc.).
  • the camera has a flat CCD element as a detector, so that a rectangular, in particular square image can be detected.
  • the camera is designed to allow exposure times of up to 20 seconds. The longer the exposure time, the weaker Fluorescence signals can be detected. The strength of the fluorescence signals depends strongly on the number of immune reactions performed on the biochip 130. These relatively long exposure times also provide an advantage over conventional scanners, which scan the individual spots in turn, since in this method the exposure time is not freely variable.
  • the sampling chamber 140 is placed with its sample side 141 on the film of the cartridge 101.
  • the recesses 143 of the sampling chamber 140 engage in the centering pin 144 and the two stops 145, whereby the sampling chamber 140 is positioned and the contact pressure on the seal 129 is limited.
  • the blade 142 penetrates into the seal 129 and ensures a pressure-tight connection.
  • the sampling chamber is filled with air via the compressed air line.
  • an overpressure between 2 bar and 4 bar is generated in the space sealed between optic 146 and transparent foil 128. Due to the overpressure, the transparent film 128 contacts the biochip 130 and displaces the fluorescence supernatant of the sample liquid above the biochip 130. The fluorescence in the remaining sample space is dimmed. Thus, a fluorescence image of the biochip 130 can be recorded.
  • Reaction rate of the hybridization / incubation therefore shortens the incubation time or higher signal intensities are possible.
  • Such forced convection can therefore be achieved not only by varying the temperature, but also by varying the outside pressure applied to the film.
  • the "window" film 128 is subjected to mechanical stress, in particular during heating, and would undergo plastic deformation be neutralized. This is for example advantageous during the immunological reaction in which the film is subjected to considerable thermal stress.
  • the optical quality of the film 128 Due to its small thickness and the proximity of the film 128 to the biochip 130, the optical quality of the film 128 has only a slight influence on the readability of the fluorescence signals
  • biochip reader All information about the cartridge, including biochip, must be read out by the biochip reader. To control exact temperatures, data of the heater is needed on the circuit board. Also, the information on the biochip applied reaction fields (spots), ID numbers, exposure times for image acquisition, etc., must be read by the reader to control the temperature-controlled biological response and to allow a logging and archiving. The necessary information can be applied to the cartridge as a dot code or as a bar code. To read these codes you need a dot code reader (or bar code reader). More flexible is the use of writable and readable tamper-resistant storage media which are advantageously integrated on the circuit board.
  • the information obtained is processed by suitable software, whereby the spatial arrangement of the FAK (Array Layout) spots via the layout is already stored in the software.
  • FAK Array Layout
  • a contacted electrically programmable non-volatile memory and information during the immune reaction when reading the biochip can be stored.
  • the data can be stored tamper-proof. After a successful processing, the cartridge can also be marked as "processed".
  • the detection can take place only when all reactions have taken place.
  • Biochip / Microarrav> fixing the protein spots with a stabilizer (very preferably:
  • Trehalose to obtain the tertiary structure of the proteins; besides, increase the durability.
  • Convection in the sample chamber can accelerate the diffusion and thus accelerate the reactions and thus considerably reduce the processing time.
  • the convection is achieved, for example, by cycling the temperature, eg changing between 32 ° C. and 40 ° C. for 30 seconds or by changing the pressure in the sample chamber to a minimum
  • the background in detection becomes lower and more uniform than can be achieved by washing steps. This leads to a high signal-to-background ratio and thus to a more sensitive measurement method, which also shows low assay variances. The reason is that the specific bonds to the substrate are not affected by the washing and thus no signal loss takes place by washing away. In addition, the background remains weak and evenly due to the "non-washing".
  • Fig. 1 main body of the cartridge I
  • Fig. 2 shows an embodiment of the reaction fields (spots) on the biochip with optically opaque and non-fluorescent back
  • FIG. 4 is a perspective view of a housing of a cartridge II
  • FIG. 5 is a side view in partial section along with a stopper
  • FIG. 7 shows a section through the cartridge II and a scanning chamber, 8 filling process of the cartridge II with unplugged plug,
  • FIG. 9 filling process of the cartridge II with the stopper pressed in, FIG.
  • FIG. 11 the sampling chamber of Figure 7 and a compressed air supply source connected thereto in a sectional view.
  • FIG. 22 Time kinetics of ricin detection (single plex)
  • the toxin assay allows the simultaneous detection of three bioweapons capable toxins. These are ricin, staphylococcal enterotoxin B (SEB) and botulism toxins A and B (BoNT A / B).
  • the toxins may be present in their active form as crude extract or purified, mineral water is established as a sample matrix.
  • Biochip • The glass carrier for the biochip consists of float glass (SCHOTT Borofloat 33,
  • the coated glass carrier is sawed on the front in a square grid 0.55 mm deep (grid dimension: 3.3 mm).
  • the sawing blades later serve as predetermined breaking points during "singulation" of the biochips prior to assembly in the cartridge (FIG. 18).
  • the sawn glass slide (external dimensions in slide format 25x75.6mm) is functionalized with an epoxy silane (after ultrasonic cleaning with 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane in toluene for 3h at 80 0 C) •
  • Each individual biochip position of the south is with an identical arrangement spotted by antibodies (array layout).
  • the spotting solution consists of the respective antibody in a concentration of 0.5 mg / ml, in IxPBS and 20 mM trehalose, and possibly 0.025% BSA.
  • the spotting is done with a non-contact piezo nanodispenser (spotter).
  • the immobilized antibodies are each after spotting in a round area of about
  • spots are applied at a distance of 200 or 240 ⁇ m.
  • reaction of the amino groups of lysine amino acids on the surface of the antibodies with the epoxy groups of the Silane coating takes place a covalent, irreversible coupling of the capture antibodies to the glass carrier (FIG. 17).
  • Marker spots are automatically recognized by the software (Fig. 19) and, together with the array layout stored in the software (Fig. 18), serve to allocate the evaluated signal intensities of the spots to the corresponding antibody types.
  • Negative control (4 pieces as 6-fold replica): Here, the serum-derived IgGs are spotted, which originate from the animal species immunized for antibody production. If an agent present in the sample to be examined binds non-specifically to all antibodies of a particular animal species, for example, the corresponding negative control would also enter Signal. Thus false positives can be excluded in the detection.
  • the biochip slides are stored refrigerated under a nitrogen atmosphere.
  • the central part is an Inlay made of a cycloolefin copolymer (Zeonex, Zeonor or Topas)
  • the material is very hydrophobic with a low surface energy, therefore there are no problems with the adsorption of the biological components on the surface of the reaction vessel
  • Embedded in the surface are structures which define a sample space (with optical window), a pressure equalization space, a filling opening and channels as a connection between these compartments.
  • the second component is a flexible printed circuit board containing a heating structure, as well as a memory module for cartridge-relevant data and contact islands for the electronic control and reading of the flex printed circuit board in the device.
  • This flexible circuit board is bonded with a double-sided biocompatible adhesive tape ("ARcare 8932" from Adhesives Research), the biochip is placed on the heating structure and the Flex circuit board is glued to the inlay, resulting in a hermetically sealed structure in the inlay. the biochip-containing interior, which is temperature controlled via the flex heating structure.
  • the inlay is housed in two plastic injection-molded half shells, which together make up the cartridge.
  • a square aperture is inserted, which is centered aligned with the biochip located in the sample space.
  • Shells are structures that ensure easy and accurate automatic positioning of the cartridge when inserted into the device. 4.
  • the biomix contains the fluorescently labeled detection antibodies, the PBS buffer components and trehalose.
  • a mixture of 40 ⁇ l of water containing 10 mM PBS, 10 mM trehalose and 0.5% BSA with 4 Cy5-labeled detection antibodies (2-15 ⁇ g / ml), the Cy5-labeled Interleukin-12 antibody (2 ⁇ g / ml) and interleukin - 12 (400ng / ml) is lyophilized directly in Eppendorf tubes.
  • trehalose is included to minimize exposure of the antibodies by the lyophilization process and to ensure the shelf life of the lyophilizate.
  • the assay buffer consists of water and 0.5% Triton-X 100. It is needed to reconstitute the lyophilizate before adding the sample.
  • the device is operated via an external PC with software that controls all components of the device fully automatically and that can be operated via the built-in screen.
  • An opto-electromechanical module is constructed around this cartridge receptacle, which brings about the temperature control of the sample space during processing, the pressing of the biochip on the optical window and the image acquisition in the fluorescence channel.
  • the user interaction is limited to inserting the cartridge and starting the processing at the push of a button. Until the final result is displayed, no further interaction is required.
  • the device can be controlled externally via TCP / IP.
  • a suitable device is commercially available for purchase from the company Zenteris GmbH.
  • Negative control negative no toxins detected, the positive control must be active. o
  • the signal level of the antigen to be detected must exceed a certain threshold (assay-specific, determined during development) and fulfill statistical criteria in order to be regarded as positive detection. o Then, this result is displayed on the screen (Fig. 24). o Evaluation of the results (FIG. 21)
  • the advantage of the method used compared to all other known methods is that no further interaction by the user is necessary after the start of the processing.
  • Interleukin 12 final concentration 400 ng / ml
  • Interleukin 12 final concentration 400 ng / ml
  • BONT A complex final concentration 1 ⁇ g / ml
  • BONT B complex final concentration 1 ⁇ g / ml
  • the 4-Plex detection provides comparable results with Rizin crude extract, SEB, BONT A and BONT B culture supernatants.
  • the detection limit of this toxin is determined.
  • Detector body batch (lyophilized): 1 (final concentration 13.5 ⁇ g / ml)
  • Interieukin 12 final concentration 50 ng / ml

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System und ein Verfahren zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen oder einer Substanz mit mehreren Merkmalen in einem Schritt, wobei die Nachweis-Reaktion auf einem immunologischen Verfahren vom Sandwich-Typ basiert und sich insbesondere dadurch auszeichnet, dass sie einfach durchzuführen ist und als „Ein-Topf-Reaktion' konzipiert ist, was bedeutet, dass alle Nachweisschritte in einem Reaktionsansatz ohne Spülschritte und nur einmalige Hinzugabe von Reagenzien ausgeführt werden.

Description

Einschritt-Multiplex-Immuntest
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System und ein Verfahren zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen bzw. einer Substanz mit mehreren Merkmalen in einem Schritt, wobei die Nachweis-Reaktion auf einem Immuntest vom Sandwich-Typ basiert und sich insbesondere dadurch auszeichnet, dass sie einfach durchzuführen ist und als „Ein-Topf-Reaktion" konzipiert ist, was bedeutet, dass alle Nachweisschritte in einem Reaktionsansatz ohne Spülschritte und nur unter einmaliger Hinzugabe von Reagenzien ausgeführt werden.
Immuntests, Enzym gekoppelte Immuntests (ELISA), Fluoreszenz-Markierung gekoppelte Immuntests (FLISA) oder mit einem anderen Label markierte Immuntests werden in der Routinediagnostik und Forschungsdiagnostik zur Detektion und Quantifizierung von Proteinen, zum Beispiel Antigenen, Liganden, Rezeptoren, Antikörpern sowie von chemischen Verbindungen inzwischen routinemäßig eingesetzt.
Beim „indirekten Immunoassay" wird das nachzuweisende Protein, d.h. das Antigen (AG), durch Adsorption an einen festen Träger, z. B. eine Polystyrol-Mikrotiterplatte, gebunden. Nach einem Waschschritt wird ein spezifischer Bindungspartner, der sogenannte Detektions-Antikörper (DAK), hinzugegeben.
Beim „Sandwich-Immunoassay" wird zuerst ein Antigen-spezifischer Bindungspartner, der sogenannte Fänger-Antikörper (FAK), am festen Träger adsorbiert. Nach einem Waschschritt kann die Probe zugegeben werden, nach einem weiteren Waschschritt dann der DAK. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass das Antigen durch den FAK selektiv aus der Probenlösung eingefangen wird, wodurch deutlich kleinere Mengen nachweisbar sind.
Beim „Enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) ist an die DAKs ein Enzym gekoppelt, das in einem dritten Schritt eine Farbreaktion katalysiert (z. B. Meerrettichperoxidase (HRP) + Tetramethylbenzidin (TMB)) und so ein positives Testergebnis visualisiert. Beim „fluorescent labelled immunoassay " (FLISA) sind die DAKs entweder direkt mit einem Fluoreszenzlabel versehen oder mit einem weiteren Bindungspartner, an den die Bindung eines sekundären Detektionssystems möglich ist (z. B. Biotin-Label + Cy5-Streptavidin).
Für die Durchführung eines „Sandwich-ELISA" oder „Sandwich-FLISA" ist es üblich, die FAKs durch Adsorption an einen festen Träger zu binden und die weiteren für die Versuchsdurchführung benötigten Reagenzien als separate Komponenten den Testkits hinzuzufügen. Diese Reagenzien sind üblicherweise ein Standard- und Probenverdünnungsmedium, der zweite spezifische Bindungspartner (= DAKj in gekoppelter Form (d.h. Konjugat) als Konzentrat oder Arbeitslösung und falls benötigt ein sekundäres Detektionssystem. Zum Herstellen der Arbeitslösungen für den zweiten spezifischen Bindungspartner sowie für das Sekundärreagenz steht ein Assaypuffer zur Verfügung, welcher meist als Konzentrat vorliegt. Da zwischen den Arbeitsschritten Waschschritte erforderlich sind, enthält ein herkömmlicher Immuntest- Kit auch einen Waschpuffer, üblicherweise in konzentrierter Form.
Die Notwendigkeit mehrerer Waschschritte während einem Immuno-Assay, egal auf welchem Nachweisprinzip er beruht, macht die Tests oft zeitaufwändig und personalintensiv. Jeder Waschschritt muss als Differenzierungsschritt verstanden werden, dessen Zeitdauer, Intensität, Temperatur und Medienzusammensetzung je nach Molekülart differenzierte Ergebnisse zeigt und vor allem keine optimale Reaktionsgleichgewicht-Einstellung zulässt. Dies resultiert in klaren Nachteilen bzgl. Reproduzierbarkeit, Multiplex-Möglichkeiten, Zeitdauer, Probendurchsatz, Automatisierung und Kosten.
In der WO 02/090983 A2 ist aber schon eine in der Anwendung einfachere Form eines Immuno-Assays beschrieben, die statt mehreren nur noch einen Waschschritt enthält. Dabei ist auf dem Träger (z. B. Mikrotiterplatte) nicht nur der FAK adsorbiert, sondern auch in lyophilisierter Form der DAK und eventuell das daran gekoppelte Enzym. Es muss nur noch die zu bestimmende Probe im Assaypuffer zugegeben werden, wodurch das Lyophilisat rekonstituiert und das Sandwich aus FAK, AG und DAK in einem Schritt aufgebaut wird. Es folgt dann aber ein Waschschritt und die sequentielle Zugabe der Substrat- und Stopplösung im Falle einer enzymatischen Farbreaktion. Von einer Gleichgewichts-Sandwich-Reaktion kann man deshalb nicht sprechen. Die Quantifizierung erfolgt wie üblich in einem Plattenreader. Es findet aber keine „echte" parallele Reaktion statt und damit ist eine Vergleichbarkeit der Reaktionen nicht gewährleistet, was die Reproduzierbarkeit des Assays deutlich reduziert. Hinsichtlich gewünschter Automatisierung, erhöhtem Probendurchsatz und Kosten stellt diese Methode allerdings bereits eine Verbesserung zum Standard ELISA dar.
Der automatisierte Nachweis von molekularen Wechselwirkungen mehrerer Moleküle ist in den Patentanmeldungen DE 10 2005 052 752 A1 , DE 10 2005 052 713 A1 und WO 07/0 51 861 A1 der Firma Clondiag beschrieben. Diese Anmeldungen sind allerdings auf den Nachweis von Nukleinsäuren beschränkt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen oder einer Substanz mit mehreren Merkmalen in einem Schritt bereitzustellen, das sich insbesondere dadurch auszeichnet, dass alle Nachweisschritte in einem Reaktionsansatz ohne Spülschritte und nur unter einmaliger Zugabe von Reagenzien ausgeführt werden.
Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche 1 und 1Z gelöst.
Von den Erfindern wurde gefunden, dass der immunologische Nachweis mehrerer nachzuweisender Substanzen oder Merkmale nebeneinander (z.B. eines Antikörpers mit mehreren Spezifitäten) durch einen Multiplex-Nachweis unter Verwendung eines Bio-Chips (auch Microarray, Chip, Protein-(Bio)-Chip, Sondenarray genannt) durchgeführt werden kann. Die erforderlichen biochemischen Reaktionen und die Detektion finden in einer Kartusche nach einmaligem Füllen mit allen Reagenzien ohne weiteres Eingreifen des Anwenders, also in einer "one-tube"-Reaktion, oder auch „Eintopf-Reaktion" statt. Dies erfordert die Etablierung eines immunologischen Nachweises, bei dem alle Nachweisschritte in einem Reaktionsansatz ohne Spülschritte und spätere Hinzugabe von Reagenzien ausführt werden. Über das Layout für den Protein Bio-Chip wird eindeutig festgelegt, welcher Bindungspartner (z.B. Antikörper) an welchem Platz (Spot) ist. Das Layout ist in einer Software hinterlegt und wird nach einer Bildaufnahme zur Analyse der Daten aufgerufen. Wenn die in der Probe enthaltenen nachzuweisenden Substanzen (z.B. Antigene) spezifisch mit einem Detektionspartner (z.B. Detektionsantikörper) reagieren und an den zugehörigen Fängerpartner (z.B. Fängerantikörper) auf dem Protein-Bio-Chip binden, wird durch das gekoppelte Label (z.B. Fluoreszenzfarbstoff) ein messbares Signal erzeugt. Über das Layout kann dann exakt bestimmt werden um welchen Bindungspartner (z.B. Antikörper) es sich handelt und auf die nachzuweisende Substanz rückgeschlossen werden.
Die Erfindung findet Anwendung zur Detektion von einer Vielzahl von Substanzen oder Merkmalen nebeneinander (Multiplex-Format) auf der Basis eines Sandwich- Nachweisprinzips (z.B. ELISA, indirekter oder kompetitiver Nachweis). Insbesondere kann der Test zum Nachweis von Proteinen (z.B. Antigenen, Antikörpern), Liganden, Rezeptoren, Steroiden, chemischen Substanzen, Medikamenten, Toxinen, Bakterien, Viren und ähnlichen Substanzen eingesetzt werden. Beispielsweise eignet er sich auch zur Impftiterbestimmung. Insbesondere eignet er sich zum Multiplex-Nachweis von biowaffenfähigen Toxinen, Mykotoxinen, Bakterien und Viren, insbesondere Rizin, Staphylococcus-Enterotoxin B (SEB), Botulismus-Toxine A und B.
Die Detektion des Reaktionskomplexes erfolgt über die Intensitäts-Messung einer Markierung (Label). Dabei kann die Markierung direkt am Detektionsbindungspartner (z.B. Detektionsantikörper) angebracht sein oder mit Hilfe eines direkt gekoppelten Enzyms (z.B. Meerrettich-Peroxidase, Alkalische Phosphatase u.a.) oder über eine enzymatische Reaktion, welche durch einen Sekundärschritt erfolgt (Biotin- Streptavidin-HRP, Neuramidin, Dioxigenin/Antidioxigenin, enzym-gekoppelter Antikörper gegen den Detektionsantikörper u.a.). Jedes Label, das direkt an den Reaktionskomplex oder einen Sekundärpartner gekoppelt sein kann und für die Durchführung eines Immuntests geeignet ist, wie Fluorochrome, Chemilumineszenz- Label, radioaktive Label u.a. kann benutzt werden.
Die in diesem Verfahren benutzten biochemischen Reagenzienmixe, Temperierung für den Ablauf der Reaktionen und ein abschließender Auswertealgorithmus werden im Folgenden erläutert, wobei eine Antigen-Detektion über eine Antikörper-Antigen- Antikörper-Reaktion und als Nachweis-Label die Messung der Fluoreszenz gewählt wurde, was aber wie oben gesagt, nicht die einzige Möglichkeit darstellt und nicht beschränkend auszulegen ist.
Zusammengefaßt läuft das Verfahren wie folgt ab:
1. Die Probe, die die nachzuweisenden Substanzen enthält, wird, falls sie in fester Form vorliegt, in einem geeigneten Puffer aufgenommen und in den Biotestmix-Tube gegeben. Bei einer bereits flüssigen Probe kann die Zugabe zum Biotest-Mix sofort erfolgen. 2. Diese Mischung wird mit einer Pipette in den Probenraum einer Kartusche eingebracht,
3. Die Kartusche wird ins Gerät eingelegt, der Prozess gestartet.
4. Die Kartusche wird prozessiert. Die Prozessparameter sind in der Kartusche codiert und in der Software hinterlegt, es können Temperaturen im Bereich zwischen Raumtemperatur und 1000C für beliebige Zeitintervalle angesteuert werden.
5. Nach abgeschlossener Inkubation wird die Flüssigkeit über dem Biochip mechanisch verdrängt, und ein Bild im Fluoreszenzkanal aufgenommen.
6. Die Software wertet unter Anwendung des Array Layouts die Spotintensitäten aus und liefert eine Aussage über die Anwesenheit der nachzuweisenden Antigene in der Probe.
Die Schritte 4 - 6 laufen vollautomatisch ab.
Das gesamte Nachweis-System besteht aus: o Biotestmix-Tube zum Ansetzen des Nachweises o Einmal-Kartusche zur Probenaufnahme o Gerät zur Prozessierung der Kartusche o Software zur Prozessierung und Auswertung
Somit ist Bestandteil des Test ein vorkonfektioniertes Tube, in dem die für den Nachweis notwendigen DAK, der/die Antikörper bzw. das/ die Antigen(e) der Positivkontrolle und sonstige Pufferbestandteile in lyophilisierter Form oder in flüssiger (wässriger) Form vorliegen (Biotestmix). Die DAK können Fluoreszenz-gelabelt sein, es ist auch möglich über einen weiteren Bindungsschritt eine Nachweiskaskade aufzubauen (z. B. Biotin-gelabelter DAK und fluoreszenz-gelabeltes Streptavidin), alle hierfür notwendigen Reagenzien sind dann auch Bestandteil des Biotestmixes.
Der Biotestmix enthält bevorzugt ein in der Immunologie übliches Assay-Puffer-System (z.B. PBS-Puffer), mindestens ein Protein zur Stabilisierung (z.B. Rinderserum-Albumin) und Detektionsantikörper (direkt fluoreszenz-markiert oder ggf. biotinyliert). Ist der Detektionsantikörper biotinyliert, enthält der Biotestmix weiter einen Streptavidin markierten Fluoreszenzfarbstoff (für den Sandwich-Nachweis). Weiterhin sind im Biotestmix Antikörper (z.B. lnterleukin-12 Antikörper) als Positiv-Kontrolle enthalten, die als „Modellsystem" dienen, um die Funktionsfähigkeit des biologischen System zu überprüfen. Bei erfolgreicher Antiköper-Antigen -Antikörper Wechselwirkung (Mouse lnterleukin-12 - Interleukin 12 - Anti Mouse lnterleukin-12) während der Prozessierung entsteht ein Fluoreszenzsignal, das als Positivkontrolle die Funktionsfähigkeit demonstriert. Ist der Biotestmix flüssig, ist desweiteren mindestens ein Detergenz, bevorzugt Triton-X (z.B. Triton X-100 oder Triton X-50), darin enthalten. Liegt der Biotestmix in lyophilisierter Form vor, ist das Detergenz/die Detergenzien in einer Rekonstituierungslösung (wässriger Assay-Puffer) zur Aufnahme des Lyophilisats enthalten.
Tabelle 1 : Bevorzugte Zusammensetzung des Biotestmix (Detektionsantikörper-Mix)
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Ein Stabilisator wird bevorzugt zugesetzt, da die Makromoleküle (z.B. Antigen, Antikörper) sehr anfällig sind, wenn sie sich nicht in ihrer natürlichen Umgebung befinden. Insbesondere beim Eintrocknen der Spots auf dem Bio-Chip kann die Aktivität drastisch verringert werden. So hat man gefunden, daß Trehalose im Biotestmix einen schützenden Effekt auf die Stabilität und Aktivität hat. Durch Einlagerung von Kristallwasser beim Eintrocknen bietet die Trehalose-Matrix maximalen Schutz. Die Hydrathülle wird erhalten und die native Konformation der Proteine erhalten, was die Haltbarkeit erhöht.
Für die meisten nachzuweisenden Antigene (z.B. Toxine, Bakterien, Viren) existieren bereits verschiedene kommerziell erhältliche Antikörper (monoklonal und/oder polyklonal), welche für die Nachweisreaktion eingesetzt werden können. Für die Etablierung des Multiplex-Nachweises ist die Auswahl von geeigneten Antikörpern ein Schlüsselprozess, um Kreuzreaktionen zu verhindern, die aufgrund der Systemeigenschaften vermehrt auftreten können, da hier auf Waschschritte bewusst verzichtet wird. Da bei dem vorliegenden immunologischen Nachweisverfahren aber auf Waschschritte verzichtet wird, können die Antikörper durchaus weniger „robust" sein als beim üblichen Mikrotiterplatten-ELISA. Bevorzugt ist der Einsatz von monoklonalen Antikörpern. Insbesondere durch den Einsatz monoklonaler Antikörper als Detektionsantikörper, also im Biotestmix, kann gegenüber dem Einsatz von polyklonalen Antikörpern eine Signalsteigerung erzielt werden, da monoklonale
Antikörper nur ein Epitop haben und damit auch nur ein Antigen binden. Beim Einsatz von polyklonalen Antikörper können auch mehrere Antigene an diesen Antikörper binden, der aber nur mit einem einzigen Fluoreszenzmolekül gekoppelt ist, d.h. die Signalstärke könnte geringer sein.
Die Bestandteile des Biotestmixes werden in entsprechenden Konzentrationen zusammengemischt und für die Nachweisreaktion mit der entsprechend konfektionierten Probe versetzt.
Eine bevorzugte End-Zusammensetzung des Biotestmixes enthält : Bestandteil αanz bevorzuαte Konz. Bevorzuqter Konz.bereich
Triton-X 0,25% 0,05 - 2%
BSA 0,5% 0,1 - 1 ,5%
PBS 1OmM 5 - 25 mM Trehalose 10OmM 20 - 200 mM
IL-12 50ng/ml 10 -200 ng/ml
DAK 1-10 μg/ml (je nach AK) 05-30 μg/ml (je nach AK)
Im Falle eines Sandwich-ELISA läuft der eigentliche Immunoassay so ab, daß auf dem Biochip Fängerantikörper in Spots immobilisiert sind, die spezifisch bestimmte Antigene in der zu analysierenden Probenflüssigkeit erkennen und binden. Die Reaktionslösung enthält Detektionsantikörper, die spezifisch bestimmte Antigene in der zu analysierenden Probe erkennen und binden, und die direkt oder indirekt mit einem Farbstoff gekoppelt sind. Die Probe wird mit der Reaktionslösung gemischt und in den Reaktionsraum mit Biochip eingebracht. Unter dem Einfluss eines definierten Temperaturprofils binden die Antigene der zu analysierenden Probe spezifisch an die entsprechenden Fängerantikörper auf der Bio-Chip-Oberfläche. Auf der Chipoberfläche bildet sich an den Spots damit ein Molekülkomplex genannt "Sandwich", bestehend aus immobilisiertem Fänger-Antikörper, gebundenem Proben- Antigen und Detektionsantikörper mit Farbstoff (Fig. 13). Das „Layout" eines anderen immunologischen Nachweistests ist analog und wird von einem Fachmann beherrscht.
Der Immuntest läuft in einem abgeschlossenen Kompartiment {Probenraum) ab, in dem definierte Temperaturen zwischen Raumtemperatur und 1000C erzeugt werden können. Der Probenraum ist Bestandteil einer Einmal-Kartusche.
Ein weiterer Bestandteil des Probenraumes ist ein fester Träger (Biochip), auf dem die FAK immobilisiert sind. Der Biochip kann z. B. aus Glas, Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol und/oder PMMA bestehen. Der Biochip hat eine handelsübliche Größe und ist ca. 2-5 x 2-5 mm groß, bevorzugt quadratisch. Die Immobilisierung erfolgt bevorzugt durch kovalente Kopplung der FAK an eine funktionalisierte Beschichtung des Biochips, wie z. B. die Kopplung von Lysin-Aminogruppen an einen Epoxysilan- funktionalisierten Glasträger. Eine weitere Funktion der Beschichtung des Biochips besteht in der Verhinderung unspezifischer Bindung des Antigens an die Oberfläche des Biochips. Statt eines Epoxysilan-funktionalsierten Trägers könnte auch ein Aminopropylsilan-, Aldehyd- oder Poly-L-Lysin-funktionalisierter Träger eingesetzt werden.
Die Immobilisierung erfolgt ortsaufgelöst für jede FAK-Sorte einzeln in getrennten Bereichen (Spots) auf dem Biochip. Die Spotgröße beträgt zwischen 50 und 200μm, der Spotabstand von 100 - 300 μm. Jede FAK-Sorte ist mehrfach vorhanden (Replikate), es können 2-24, bevorzugt 4 -12, ganz bevorzugt 6, Positionen sein. Weiterhin gibt es Positionen, an denen Prozeßkontrollen stattfinden, wie z. B. Positiv- und Negativkontrollen.
Im nachfolgenden wird die Kartusche und der Meßvorgang am Beispiel des
Sandwich-ELISA mit immobilisierten Fängerantikörpern ausführlicher beschrieben, wobei dies als mögliche beispielhafte Ausgestaltung zu verstehen ist und nicht beschränkend auszulegen ist. Hinsichtlich der Kartusche und dem Meßablauf sind mannigfaltige Variationen möglich, die eine erfolgreiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewährleisten.
Beispielsweise wird eine kleine Menge (z.B. 2 μl) der Probe mit dem zu testenden Antigen zum mit Triton-X enthaltendem Puffer rekonstituierten Biotestmix hinzugegeben (mit Standard Laborpipette). Der resultierende Reaktionsansatz (ca. 40 μl) wird komplett in den Reaktionsraum der Kartusche injiziert. Die Kartusche wird dann in das Prozessierungsgerät eingelegt und der Analyseprozess wird gestartet.
Im geschlossenen Reaktionsraum der Kartusche erfolgt nun die Antikörper-Antigen Reaktion. Grundsätzlich funktioniert diese wie ein Sandwich-Immuntest, wobei drei Bindungen zwischen vier "Proteinen" (allg. Peptiden) zustande kommen. Gespottet auf dem Bio-Chip befindet sich kovalent gebunden der Fänger-Antikörper (FAK), dieser bindet spezifisch an ein Epitop des Antigens (AG) (z. B.. Ricin). Dann gibt es den Biotin- gelabelten Detektions-Antikörper (DAK), der wiederum spezifisch, aber an ein anderes Epitop des Antigens (AG) bindet. Um das Ganze sichtbar zu machen, gibt es Fluoreszenzfarbstoff-gelabettes Streptavidin (SA) (z.B. als SA-Dyüght647), das wiederum eine sehr stabile Bindung an Biotin macht, und somit dort Fluoreszenzdetektion erlaubt, wo die Kaskade (FAK) — (AG) — (DAK) — (SA) zustande gekommen ist.
Der Ablauf im z.B. Standard-ELISA ist so, daß zwischen jeder spezifischen Bindungsreaktion ein Waschschritt vorgenommen wird. Als erstes wird nur das (AG) zugegeben, nach angemessener Zeit wird gewaschen, alles nicht gebundene Antigen wird entfernt. Dann wird der (DAK) zugegeben, der spezifisch ans (AK) — (AG) bindet, dann wird wieder gewaschen und die nicht gebundenen (DAK) entfernt. Nächster Schritt: Zugabe des "Visualisierungs-Proteins". Beim Standard-ELISA Verfahren, wird am Ende wieder gewaschen, um den Hintergrund für die Bildaufnahme zu minimieren. Die Selektion von Antikörpern für ein solches Nachweisverfahren, wird also neben der Spezifität vor allem darauf hinarbeiten, daß die Waschschritte möglichst gut überstanden werden. Die (FAK) — (AG)-Bindung muß dreimal die Waschpnozedur aushalten, die (AG) — (DAK)-Bindung immerhin zwei Waschschritte, usw.
Im erfindungsgemäßen System liegen alle Bestandteile gleichzeitig vor! Es können sich (AG) und (DAK) verbinden, bevor das (AG) and den (FAK) gebunden hat. Während der Inkubationszeit läuft das dann so ab, daß diese Bindungen (weil nicht kovalent) sich ständig bilden und wieder lösen. Alle Bestandteile bilden ständig sich ändernde Koalitionen. Es wird sich aber, wenn genügend Zeit gelassen wird, ein therrnodynamisches Gleichgewicht einstellen und das System sich ins Energieminimum bewegen. Die Geschwindigkeit, mit der dies passiert (also die benötigte Assay-Zeit), hängt wesentlich von der Temperatur und den Diffusionsgeschwindigkeiten ab, das Ergebnis aber hängt von den Bindungsstärken ab, da im Gleichgewicht die stärkeren Bindungen bevorzugt sind. Hier spielen die Viskosität und lonenstärke des Puffers eine Rolle.
Der Temperatureinfluß ist so, daß bei höherer Temperatur das Wieder-Aufbrechen einer suboptimalen Bindung leichter/schneller stattfindet, d. h. das Gleichgewicht wird schneller erreicht. Die Diffusionsgeschwindigkeit hängt u. a. von der Molekülgröße ab, insbesondere braucht ein Proteinkomplex wie (AG)-(DAK) länger, um zum (FAK) zu diffundieren, als wenn die Bestandteile sich einzeln dort hinbewegen. Das Detergenz (z.B. Triton-X) hat hier einen gewissen Einfluß, da es dazu beiträgt, die Bestandteile einigermaßen auseinander zu halten. Außerdem wirkt sich die Viskosität des Lösungsmittels natürlich auch direkt auf die Diffusion aus.
Beim erfindungsgemäßen System werden die Bindungen durch die fehlenden Waschschritte überhaupt nie auf die Probe gestellt, entscheidend ist die hinreichend schnelle Erzeugung der Kaskade (FAK)-(AG)-(DAK). Dementsprechend können Antikörper, die im immunologischen Standardverfahren, z.B. ELISA-Verfahren, optimale Ergebnisse liefern, für das erfindungsgemäße System ungeeignet sein und umgekehrt Antikörper, die im immunologischen Standardverfahren (z.B. ELISA-Verfahren) schlechte Ergebnisse liefern, möglicherweise optimal für das erfindungsgemäße System sein.
Für die einfache Durchführung des Tests ist eine Kartusche erforderlich, in der nach der Befüllung mit der Probenflüssigkeit unterschiedliche Temperaturverläufe eingestellt werden können, damit die entsprechende biologische Reaktion abläuft, und anschließend die optische Detektion erfolgt. Diese Kartusche wirkt als biologischer Mikroreaktor, in dem alle biochemischen Reaktionen für die Analyse biologischer Proben gesteuert ablaufen..
Im nachfolgenden werden zwei verschiedene Arten von Kartuschen I und Il beschrieben, die gut funktionierende Alternativen für die Durchführung des immunologischen Nachweisverfahrens darstellen.
Zuerst soll Kartusche I beschrieben werden, die beinhaltet: - einen Reaktionsraum in dem sich der Biochip mit aufgebrachten Reaktionsfeldern (Spots) mit bekannten fixierten Fängermolekülen befindet,
- ggf. eine Befüllvorrichtung zum Einbringen der Probenflüssigkeit in den
Reaktionsraum
- eine Temperiervorrichtung zur Einstellung unterschiedlicher Temperaturen und deren schnelle Änderung im Reaktionsraum
- ein Detektionsfenster durch das eine optische Detektion der Spots auf dem Biochips, nach erfolgter immunologischer Reaktion mit einem Optikmodul erfolgt. In der Kartusche I befindet sich ein Inlay mit einem Biochip im Reaktionsraum. Auf dem Biochip sind MxN Spots (Reaktionsfelder) mit unterschiedlichen biologischen Informationen angeordnet. Auf jedem Spot sind bekannte Fängermoleküle fixiert, die sich nur mit jeweils einer bestimmten Molekülsorte aus der zu untersuchenden Probenflüssigkeit verbindet. Die biologische Nachweisreaktion wird nach dem
Einfüllen der zu untersuchenden Probenflüssigkeit in den Reaktionsraum gestartet. Dazu wird ein definiertes Temperaturprofil gefahren und die Moleküle selektiv an den Spots auf dem Biochip gebunden. Die an diese Moleküle chemisch gebundenen Farbstoffmoleküle können dann mittels eines Optikmoduls und geeigneter optischer Fluoreszenz-Meßverfahren detektiert werden.
Mit Bezug auf die Figuren 1 - 3 kann die Kartusche I und das Meßverfahren wie folgt in einer bevorzugten Ausführungsform beschrieben werden:
Ein beispielsweise mittels Spritzguss hergestellter Grundkörper 1 enthält
Aussparungen für den Befüllkanal 7 mit dem Rückschlagventil 8, die Befüllöffnung 9, den Reaktionsraum 5, den Verbindungskanal 4 zwischen Probenraum 5 und Ausgleichsraum 2, , und einem Sichtfenster 3. Das Rückschlagventil 8 wird in den Befüllstutzen 9 eingesetzt und fixiert (Fig. 1 ,3 ).
Als Alternative kann statt des Rückschlagventils auch eine Silikondichtung vorgesehen sein, die mit einer Kanüle zur Befüllung des Probenraums durchstochen werden kann.
Der Biochip 6 (Fig.2) enthält eine Anzahl M N Reaktionsfelder 6.1. Zur Vermeidung von optischen Rückreflexen und unerwünschter (Fluoreszenz)strahlung von der Flex- Leiterplatte ist der Biochip auf der Rückseite optisch undurchlässig und nicht fluoreszierend, z.B. mit Schwarzchrom beschichtet 6.2.
Der Biochip 6 wird auf der Flex-Leiterplatte 10 fixiert und anschließend die Flex- Leiterplatte mit der Grundplatte 1 verbunden. Die Verbindung zwischen Flex- Leiterplatte und Biochip erfolgt mit einer Haftverbindungsschicht wie z.B. einem geeigneten Klebeband (geeignet für biologische Reaktionen) oder mit einem Silikonkleber, nschließend wird die Flex-LP mit dem aufgebrachten Biochip zum Grundkörper justiert und fixiert und bildet das Inlay . Eine dauerhafte, temperatur- und wasserbeständige Verbindung kann z.B. mittels biologisch-verträglichem Klebeband, mit Silikonkleber, durch Laserschweißen, durch Ultraschallschweißen oder andere biologisch verträgliche Klebstoffe realisiert werden. Dabei gibt es die Möglichkeit, die ganze Flex-LP großflächig mit dem Klebeband (oder Klebstoff) zu beschichten, den Biochip über der Heizstruktur der Flex-LP aufzukleben, und dann den Grundkörper zum Biochip zu justieren und die Flex-LP über der gesamten Fläche des Grundkörpers zu fixieren .
Eine zweite Möglichkeit der Verbindung von Flex-LP, Biochip und Grundkörper besteht in der gezielten flächigen Verklebung des Biochips mit der Flex-LP (Kleber nur unter dem Biochip) und der anschließenden Fixierung des Grundkörpers nur außerhalb des Reaktionsraums . Mit dieser Art der Verklebung ist der Wärmeübergang von der Heizstruktur 10.3 in der Flex-LP in den Reaktionsraum effizienter.
Die so vormontierte Einheit des Inlays, bestehend aus Grundplatte, Biochip, Flex- Leiterplatte und Rückschlagventil wird zur einfacheren Handhabung und Stabilisierung in eine Kartusche eingepresst.
Der Befüllvorgang von Kartusche I findet wie folgt statt:
Die Probenflüssigkeit wird durch das Rückschlagventil 8 oder durch die Silikondichtung hindurch über den Befüllkanal 7 in den Reaktionsraum eingespritzt. Die Probenflüssigkeit füllt zunächst den Reaktionsraum 5 aus und strömt dann in den Ausgleichskanal 4. Beim Befüllvorgang entsteht im Inlay-System ein Überdruck und die Luft im Ausgleichsraum wird komprimiert. Durch ein Kontrollfenster im Ausgleichskanal 4 kann der Befüllstand überwacht werden. Da die Volumina des Befüllkanals 7, des Reaktionsraums 5 und des Ausgleichskanals 4 bekannt sind, kann mit einem konstanten Flüssigkeitsvolumen, auch ohne Betrachtung des optischen Fensters, befüllt werden.
Der druckdichte Abschluss mit dem Rückschlagventil 8 oder der Silikondichtung erzeugt beim Befüllen der Kartusche einen Überdruck im Reaktionsraum. Die Luft im Ausgleichsvolumen wird komprimiert. Mit der Variation der Volumina von Reaktionsund Ausgleichsraum kann der Überdruck gezielt eingestellt werden. Bei gleichen Volumina des Reaktions- und des Ausgleichsraumes verdoppelt sich der Innendruck bei der Befüllung. . Die thermische Ausdehnung der Probenflüssigkeit führt zu einem Ausweichen in den Ausgleichskanal 4. Beim Abkühlvorgang zieht sich die
Probenflüssigkeit wieder zurück. Die Druckunterschiede bei Tmax und Tmin (im kalten und heißen Zustand) sind nur minimal, da die Luft im Ausgleichsraum komprimiert wird. Das Volumen des Ausgleichsraums ist deutlich größer als die Volumenzunahme der Probenflüssigkeit bei Erwärmung.
Eine in die Kartusche eingefügte Stabilisierungsscheibe kann eine Ausdehnung der elastischen Flex-Leiterplatte 10 beim Befüllvorgang minimieren, ohne die Fähigkeit des elastischen Andrückens des Biochips 6 an die Detektionsfläche zu verlieren.
Eine Druckerhöhung um 1 bar in der Kartusche hat den Vorteil, dass der Siedepunkt der Probenflüssigkeit ansteigt. Die Bildung von Luftblasen im Reaktionsraum wird damit minimiert und die Durchmischung der Reaktionskomponenten wird erleichtert. Der Ablauf einer temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion erfordert die Einstellung genauer Temperaturen der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum, d.h. eine Reaktionskammer, deren Temperatur einjustierbar ist. Dabei werden bei der
Durchführung eines ELISA z.B. Temperaturen zwischen 200C und 500C , bevorzugt zwischen 30cC und 400C1 ganz bevorzugt zwischen 35 0C und 39°C, angesteuert. Die Temperaturverteilung der Probenflüssigkeit muss im Reaktionsraum homogen sein und Temperaturänderungen (Heizen, Kühlen) sollen schnell erfolgen.
Für die optimale Durchführung des Immuntests stellt die Temperatur eine wichtige Komponente dar. Sie ist im weitesten Sinn als die treibende Kraft, die die nötigen Aktivierungsenergien liefert, anzusehen. Durch Wechseln der Temperatur mit nur kleiner Temperaturdifferenz kann im Reaktionsraum Konvektion erzeugt werden, die die Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle beschleunigt, was sich für die Reaktionszeit positiv auswirkt. Vorteilhafterweise wird der Ansatz mit zyklierender Temperatur gesteuert, wobei abwechselnd für bis zu 30 Minuten zwischen 300C und 4O0C gewechselt wird mit Haltezeiten zu je 30 Sekunden und anschließend bei 37°C ein Bild erzeugt wird. Auf der Flex-LP 10 der Kartusche I befindet sich eine Heizstruktur 10.3, die bei Stromführung durch den ohmschen Widerstand als Heizer wirkt. Damit wird die Probenflüssigkeit im Reaktionsraum auf die erforderliche Temperatur T erwärmt. Die Heizstruktur kann gleichzeitig als Temperaturdetektor eingesetzt werden, indem die Widerstandskennlinie R(T) zur Bestimmung der Temperatur verwendet wird.
Die Leiterplatte mit den integrierten Heizbahnen verursacht lokale Temperaturschwankungen. Direkt über den Heizstrukturen befinden sich Hotspots. Eine vorzugsweise aufgebrachte Temperaturhomogenisierungsschicht auf der Leiterplatte bewirkt eine Homogenisierung der Temperaturverteilung auf der Oberseite der Leiterplatte.
Ein in die Leiterplatte integrierter Heizer hat eine niedrige eigene Wärmekapazität. Damit sind höhere Heizraten GT(t) der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum realisierbar.
Die Kühlung der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum erfolgt entweder mittels Luft, gekühlter Luft oder aufgesetzten Kühlkörpern.
Die Temperatursteuerung in der Reaktionskammer wird genauer in den Anmeldungen WO/2008/000767 A2 (PCT/EP2007/056420) und WO/2008/000770 A2 (PCT/EP2007/056430) beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird und der Inhalt dieser Anmeldungen durch Bezugnahme hier integriert wird.
Zur Bildaufnahme wird bei Einsatz der Kartusche I nach durchgeführtem Immuntest die Flex-Leiterplatte 10 durch Andrücken des Stößels 12 elastisch verformt, so dass der aufgeklebte Biochip 6 an die Detektionsfläche drückt (Fig. 3). Um den Luftdruck im Ausgleichsraum zu überwinden, muss eine Kraft Fo aufgewendet werden. Bei einer Fläche von ca. 0,5cm2 benötigt man nur ca. 5N um einen Druck von 1 bar aufzubauen. Zusätzlich muss noch eine bestimmte Kraft Fi aufgewendet werden, um die elastische Flex-LP mit aufgebrachten Biochip 6 mittels eines Stößels 12 so zu verformen, dass der Biochip gleichmäßig an die Detektionsfläche gedrückt wird. Die Summe der Kräfte F0+F1 soll nicht über 3ON liegen. Das vorstehend erwähnte „Stößeln" ist in DE 10 2004 022 263 A1 beschrieben, um den Flüssigkeitsüberstand mit mechanischen Mitteln zu verdrängen, so dass sich zwischen dem Biochip und der Detektionsfläche keine (oder nur wenige) Farbstoffmoleküle befinden. Der Reaktionsraum ist dabei so ausgebildet, dass ein Stößel den Biochip an eine ebene Detektionsfläche 14 drückt und dabei die dazwischenliegende Probenflüssigkeit, der Flüssigkeitsüberstand, verdrängt wird.
Beim Stößeln wird somit die überstehende, Farbstoffmoleküle enthaltende Probenflüssigkeit, der Flüssigkeitsüberstand zwischen Biochip und Detektionsfläche weggedrückt. Sie füllt dabei den Ausgleichskanal und den Ausgleichsraum. Die Beleuchtungseinheit des Optikmoduls 27 regt nur noch die auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle zur Fluoreszenz an. Die Detektionseinheit des Optikmoduls 27 detektiert nach dem Stößeln nur das Fluoreszenzlicht der auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle.
Die Beleuchtung des Biochips erfolgt über eine geeignete Lichtquelle, die dem verwendeten Farbstoff in der Probenlösung angepasst ist. Als Lichtquelle eignen sich vorzugsweise Laser und LED. Eine Funktion des Optikmoduls ist die Realisierung der homogenen Biochipausleuchtung. Diese lässt sich mit einem geeigneten Optikmodul realisieren. Mittels einer rechteckigen Blende, mechanisch aufgebracht auf den Grundkörper über dem Reaktionsraum oder in diesen integriert, mit den geometrischen Abmessungen etwas kleiner als der Biochip , wird die optische Fluoreszenzanregung des Farbstoffes im Reaktionsraum neben dem Biochip verhindert.
Diese Blende kann beim Spritzguss eines transparenten Grundkörpers als optisch absorbierende Blende oder beim Spritzguss eines nichttransparenten Grundkörpers als transparente optische Blende eingebracht werden. Die Blende kann auch nachträglich auf das optische Beobachtungsfenster (Detektionsfläche) aufgebracht werden. Die Transmission der Blendenschicht sollte kleiner als 10"2 sein. Das oben erwähnte Optikmodul wird genauer in der Anmeldung PCT/EP2007/054823 beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird und der Inhalt dieser Anmeldung durch Bezugnahme hier integriert wird.
Beim Einsatz der Kartusche I besteht im Gegensatz zu der Vorrichtung in DE 10 2004 022 263 A1 , bei der die Probenflüssigkeit vor der Bildaufnahme durch den Stößelvorgang irreversibel aus dem Reaktionsraum verdrängt wird, in der erfindungsgemäß eingesetzten Kartusche die Möglichkeit, nach erfolgter Bildaufnahme den Immuntest weiterzuführen. Wird der Stößel zurückgefahren, weicht die Flex-LP infolge des Überdrucks im Reaktionsraum zurück und die Probenflüssigkeit aus dem Ausgleichskanal fließt zurück in den Reaktionsraum, auch zwischen den Biochip und das Deckglas. Damit kann auch nach erfolgter Detektion der ELISA fortgeführt werden. Es ist insbesondere eine Real-Time-Detektion möglich.
Die alternativ zur vorstehend beschriebenen Kartusche I mögliche Kartusche Il umfasst vorzugsweise:
- eine Reaktionskammer und einen in der Reaktionskammer angeordneten Biochip,
- einen Einfüllstutzen der kommunizierend mit der Reaktionskammer verbunden ist, und
- einen Ausgleichsraum, der kommunizierend mit der Reaktionskammer verbunden ist, wobei die Reaktionskammer, der Ausgleichsraum und alle hiermit verbundenen Leitungen einen bis auf am Einfüllstutzen abgeschlossenen Raum bilden, wobei der Einfüllstutzen einen freien Durchgang von außerhalb der Kartusche zur Reaktionskammer bildet, und ein Stöpsel vorgesehen ist, der formschlüssig und dicht derart im Einfüllstutzen aufgenommen wird, dass er beim Eindrücken über einen bestimmten Weg Fluid aus dem Einfüllstutzen in Richtung zur Reaktionskammer verdrängt.
Hierdurch werden folgende Vorteile erzielt: 1. Da der Einfüllstutzen offen ist, kann die Probenlösung z.B. mit einer Standardpipette einfach eingefüllt werden. Es ist keine Spritze nötig, um eine Membran zu durchstechen. Es muss kein Druck aufgebaut werden, um ein Ventil zu durchdringen. Es gibt beim Einfüllen keine Kraft bzw. keinen Gegendruck, der überwunden werden muss, um die Probe in die Kartusche einzubringen. Das Einfüllen erfolgt somit ohne Druck. Es besteht keine Gefahr, dass ein Teil der Proben beim Einfüllen verschüttet wird.
2. Die Probenlösung wird beim Eindrücken des Stöpsels unter Druck gesetzt. Hierdurch steigt der Siedepunkt. Dies hat zur Folge, dass selbst bei einer Erwärmung auf Temperaturen im Bereich von etwa 1000C in der Probenlösung keine Gasblasen entstehen, die die Messungen beeinträchtigen könnten.
3. Die Luft im Ausgleichsraum wirkt auf die Probenlösung wie ein elastisches Federelement, das ein weiteres Verdrängen von Probenlösung erlaubt, wobei die durch die Luft auf die Probenlösung ausgeübte Rückstellkraft klein ist. Somit ist auch die Kraft, mit welcher eine transparente flexible Folie, die eine
Seite der Reaktionskammer begrenzt, beaufschlagt werden muss, um die Probenlösung zu verdrängen, klein im Vergleich zu herkömmlichen Reaktionskammern mit Membranen.
4. Durch das dichte Verschließen der Kartusche mit dem Stöpsel ist eine Kontaminationsgefahr für die Umwelt ausgeschlossen.
Der offene Einfüllstutzen ist über Leitungen kommunizierend mit der Reaktionskammer, einer Füllstandsanzeige und dem Ausgleichsraum verbunden, sodass vor dem Befüllen in allen Hohlräumen der Kartusche Il Umgebungsdruck respektive Normaldruck herrscht. Beim Einfüllen der Probenflüssigkeit füllt sich der Einfüllstutzen auf. Durch das Hineindrücken des Stöpsels wird die Luft in der Kartusche komprimiert. Da Probenraum, Ausgleichsraum und Einfüllstutzen kommunizierend sind, wird der Druck im gesamten Gefäßsystem simultan ausgeglichen. Die Volumina sind dabei so dimensioniert, dass die Reaktionskammer vollständig mit Probenflüssigkeit gefüllt und ein Innenüberdruck von 0,3 - 0,5 bar und vorzugsweise etwa 0,4 bar erzeugt wird. Über eine Bewegung des Stöpsels wird der Druck minimal verändert und sorgt für eine Bewegung der Flüssigkeit im Probenraum, was eine Durchmischung bewirkt. Die Kartusche Il weist einen offenen Einfüllstutzen auf. Hierdurch ist es möglich, die Probenlösung mittels einer Pipette einzufüllen. Es ist nicht notwendig, eine Kanüle zu verwenden, mit welcher, wie es bei herkömmlichen derartigen Vorrichtungen der Fall ist, eine Dichtung durchstochen wird oder die Probenflüssigkeit unter Druck durch ein Ventil zu pressen.
In einer Ausführungsform der Kartusche Il ist der dem Biochip gegenüberliegende Bereich der Kartusche als transparente Folie ausgebildet. Die flexible transparente Folie dient als Fenster für die optischen Messungen der Probenlösung. Bei dieser Ausgestaltung ist vorteilhaft, dass der Biochip selbst nicht in der Reaktionskammer bewegt werden muss.
In einer Ausführungsform der Kartusche Il ist eine Seite der Reaktionskammer von einer Leiterplatte begrenzt. Der Biochip ist unmittelbar auf der Leiterplatte angeordnet. In dieser Leiterplatte können Heiz-/Messstrukturen integriert sein. Eine solche Leiterplatte dient zum Heizen und Messen der Probenlösung.
Die Kartusche Il ist vorzugsweise aus COC (Cycloolefincopolymer) ausgebildet. Dies ist ein inertes Kunststoffmaterial, das keine zusätzliche Passivierung von Oberflächen erfordert, um in der Reaktionskammer temperaturgesteuerte biologische Reaktionen durchzuführen.
Die transparente Kunststofffolie kann an ihrer zum Biochip weisenden Seite mit einer Adhäsions- oder Klebeschicht versehen sein, die aktiviert werden kann, wenn sie mit der Probenlösung in Kontakt kommt. Beim Andrücken der Kunststofffolie an den Biochip haftet diese auf dem Biochip, wodurch ein Eintreten von Probenlösung zwischen dem Biochip und der Kunststofffolie verhindert wird. Diese Adhäsions- oder Klebeschicht ist vorzugsweise an dem Bereich der Folie vorgesehen, der nicht mit den die Spots des Biochips enthaltenden Bereich in Kontakt tritt. Die Adhäsions- oder Klebeschicht ist somit umlaufend um den aktiven Bereich des Biochips angeordnet. Anhand der Figuren 4 - 12 wird die Kartusche Il nachfolgend näher in einer bevorzugten Ausführungsform beschrieben:
Die Kartusche 101 weist ein, z.B. mittels Spritzguss aus Kunststoff hergestelltes längliches in etwa schalen- bzw. wannenartig ausgebildetes Gehäuse 102 auf. Das Gehäuse 102 umfasst eine Basiswandung 103 und eine umlaufende Seitenwandung 104 mit zwei Längsseiten 105 und zwei Stirnseiten 106. Die Seite des Gehäuses 102 an der die Seitenwandung 104 angeordnet ist, wird als Innenseite 107 bezeichnet.
An der von den Seitenwandungen 104 abgewandten Seite der Basiswandung 103 ist an dem Gehäuse 102 eine Leiterplatte 108 befestigt. Diese Seite des Gehäuses 102 wird als Außenseite 109 bezeichnet.
An einer der Stirnseiten 106 der Kartusche 101 ist ein rohrförmig ausgebildeter sich in Längsrichtung erstreckender Abschnitt als Einfüllstutzen 110 ausgebildet. Der
Einfüllstutzen 110 weist einen Einfüllabschnitt 111 und einen Verdichtungsabschnitt 112 auf.. Der Verdichtungsabschnitt 112 ist ein zylindrischer Abschnitt 116 mit kreisförmigem Querschnitt, der in einen trichterförmigen Abschnitt 117 übergeht, an dessen Ende eine Befüllöffnung 118 ausgebildet ist. Die Befüllöffnung 118 ist über einen Befüllleitungsabschnitt 120 mit einer Reaktionskammer 122 verbunden. Im zylindrischen Abschnitt 116 des Verdichtungsabschnitts 112 ist eine Einfüllanzeige 119 vorgesehen. Der Einfüllabschnitt 111 weist eine größere lichte Weite als der Verdichtungsabschnitt 112 auf. Als Übergang zwischen dem Einfüllabschnitt 111 und dem Verdichtungsabschnitt 112 ist eine Fase 113 vorgesehen. Dieser angefaste Abschnitt 112 weist in etwa mittig einen Dichtpunkt 114 auf, ab dem ein Stöpsel 115 den Einfüllstutzen 110 dicht verschließt.
An der in Richtung Einfüllstutzen 110 orientierten Spitze der rautenförmigen Durchgangsöffnung 121 ist ein Ausgleichsleitungsabschnitt 123 angeschlossen und mündet in einer Spitze eines halbkegelförmig ausgebildeten Ausgleichsraums 124.
Benachbart zur Spitze der rautenförmigen Durchgangsöffnung 121 ist eine Durchgangsbohrung 125. Diese Durchgangsbohrung 125 bildet in Verbindung mit einer Halbkugel 126 aus transparentem Kunststoff eine Befüllanzeige 127. An der Innenseite 107 der Basiswandung 103 ist die Reaktionskammer 122 bzw. die Durchgangsöffnung 121 von einer flexiblen transparenten Folie 128 begrenzt. Die Folie 128 ist auf die Basiswandung 103 aufgeklebt. Die Folie 128 ist vorzugsweise aus einem Perfluorethylenpropylen-Copolymer (FEP) oder einem anderen geeigneten Kunststoff ausgebildet. Die flexible transparente Folie 128 dient als Fenster für die optischen Messungen der Probenlösung. Auf der Folie 128 ist im Bereich um die Durchgangsöffnung 121 eine umlaufende Dichtung 129 angeordnet.
Die Leiterplatte 108 bildet im Bereich der rautenförmigen Durchgangsöffnung 121 bzw. der Reaktionskammer 122 eine Begrenzungswand derselben. Im Bereich des Befüllleitungsabschnitts 120, des Ausgleichsleitungsabschnitts 123, der Befüllanzeige 127 und des Ausgleichsraums 124 schließt die Leiterplatte 108 derart dicht mit diesen Aussparungen ab, dass diese nach unten begrenzt werden und eine durchgängig kommunizierende, in sich abgeschlossene Kanalstruktur bilden.
Die Leiterplatte 108 enthält Kontaktflächen, ein digitales Speichermedium (z.B. ein EEPROM) und eine interne Heiz-/Messstruktur 132 die unten noch näher erläutert werden. Anstelle der Leiterplatte 108 kann zum Heizen und Kühlen auch eine Platte aus einem gut wärmeleitenden Material mit einem darauf angeordneten Mikro- Peltierelement vorgesehen sein.
In etwa mittig in der Durchgangsausnehmung ist auf der Leiterplatte 108 ein Biochip 130 angeordnet. Der Biochip 130 weist eine Höhe von in etwa 0,7 mm und eine Anzahl MxN Spots auf. Zur Vermeidung von optischen Rückreflexen und unerwünschter Fluoreszenzstrahlung von der Leiterplatte 108 ist der Biochip 130 auf der Rückseite optisch undurchlässig und nicht fluoreszierend, z.B. mit Schwarzchrom beschichtet.
Zwischen der Leiterplatte 108 und der Folie 128 und durch den Rand der rautenförmigen Durchgangsöffnung 121 ist die Reaktionskammer 122 begrenzt. Die Leiterplatte 108 ist mit der Heiz-/Messstruktur versehen, um den Biochip 130 auf eine vorbestimmte Temperatur zu erwärmen und die Temperatur zu messen. Die Folie 128 dient als Sichtfenster für eine optische Detektionseinrichtung, die durch die Folie 128 hindurch auf dem Biochip 130 befindliche Spots optisch abtasten kann. Da die Folie 128 flexibel ausgebildet ist, kann sie zum Abtasten des Biochips 130 an dessen Oberfläche angelegt werden.
Zum Verschließen des Einfüllstutzens 110 und zum Erzeugen des Überdrucks in der Reaktionskammer 122 ist ein Stöpsel 115 vorgesehen. Der Stöpsel ist vorzugsweise aus einem thermoplastischen Elastomer (TPE) ausgebildet. Der Stöpsel 115 ist zylindrisch mit kreisförmigen Querschnitt ausgebildet. Der Außendurchmesser des Stöpsels 115 ist derart ausgebildet, dass er nahezu spielfrei im Verdichtungsabschnitt 112 des Einfüllstutzen 110 aufnehmbar ist. Der zylindrische Verdichtungsabschnitt 112 des Einfüllstutzen 110 und der Stöpsel 115 bilden eine Art Zylinder-Kolben- System aus. Der Stöpsel 115 ist mit einem Dichtungsring 131 aus vorzugsweise demselben Material wie der Stöpsel versehen. Der Stöpsel 115 kann auch mit einer umlaufenden Nut versehen sein, in der ein Dichtungsring 131 angeordnet ist. Der Stöpsel 115 dichtet die Hohlräume der Kartusche 101 fluiddicht ab, nachdem er ca. ein Drittel seiner Länge in den Einfüllstutzen 110 eingeführt ist.
Im Bereich der in Richtung Ausgleichsraum 124 orientierten Spitze der Reaktionskammer 122 ist senkrecht ein kreisförmiger Zentrierstift 144 angeformt. Der Zentrierstift 144 dient als Zentrierung beim Aufsetzen der Abtastkammer.
Die Befüll- und Ausgleichsleitungsabschnitte 120, 123 sind möglichst kurz und mit einem möglichst kleinen Querschnitt ausgebildet, damit das Totvolumen klein und der notwendige Überschuss an Probenflüssigkeit gering gehalten wird. Die Leitungsabschnitte 120, 123 sind dennoch um die Reaktionskammer 122 herumgeführt, damit beim Befüllen, bei dem der Einfüllstutzen 110 oben angeordnet ist, sich die Reaktionskammer 122 von unten füllt. Hierdurch wird eine blasenfreie Befüllung der Reaktionskammer 122 sichergestellt. Im Betrieb ist der Einfüllstutzen 110 unten und der Ausgleichsraum 124 oben angeordnet, so dass Probenflüssigkeit reversibel in den Ausgleichsraum 124 verdrängt werden kann, wobei die Luftblase sich im Ausgleichsraum 124 immer über der Probenflüssigkeit befindet.
Der Ablauf einer temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion erfordert die Einstellung genauer Temperaturen der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum. Dabei werden bei der Durchführung eines ELISA z.B. Temperaturen zwischen 2O C und 50°C , bevorzugt zwischen 30 und 400C, ganz bevorzugt zwischen 35°C und 39°C angesteuert. Die Temperaturverteilung der Probenflüssigkeit muss im Reaktionsraum homogen sein und Temperaturänderungen (Heizen, Kühlen) sollen schnell erfolgen. Für die optimale Durchführung eines Immuntests stellt die Temperatur eine wichtige Komponente dar. Sie ist im weitesten Sinn als die treibende Kraft, die die nötigen Aktivierungsenergien liefert, anzusehen. Durch Wechseln der Temperatur mit nur kleiner Temperaturdifferenz kann im Reaktionsraum Konvektion erzeugt werden, die die Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle beschleunigt, was sich für die Reaktionszeit positiv auswirkt. Vorteilhafterweise wird der Ansatz mit zyklierender Temperatur gesteuert, wobei abwechselnd für bis zu 30 Minuten zwischen 3O0C und 400C gewechselt wird mit Haltezeiten zu je 30 Sekunden und anschließend bei 37°C ein Bild erzeugt wird.
Auf der Leiterplatte 108 befindet sich eine Heiz-/Messstruktur 132, die bei Stromführung durch den ohmschen Widerstand als Heizer wirkt. Damit wird die Probenflüssigkeit in der Reaktionskammer 122 auf die erforderliche Temperatur T erwärmt. Die Heiz-/Messstruktur 132 kann gleichzeitig als Temperaturdetektor eingesetzt werden, indem die Widerstandskennlinie R(T) zur Bestimmung der Temperatur verwendet wird.
Die Leiterplatte 108 kann mit einer Temperaturhomogenisierungsschicht versehen sein, die eine Homogenisierung der Temperaturverteilung auf der Oberseite der Leiterplatte 108 bewirkt.
Die elektrische Ansteuerung der Heiz-/Messstruktur 132 ist ausführlich in der WO 2008/064865 A2 beschrieben. Auf dieses Dokument wird bzgl. der Ansteuerung der Heiz-/Messstruktur 132 Bezug genommen.
Die Leiterplatte 108 weist Leiterbahnen 137 und entsprechende Kontaktstellen 138, 139 zum Anschließen eines elektrischen Halbleiterspeichers auf. Dieser
Halbleiterspeicher dient zum Speichern von Kalibrierdaten für die Heizeinrichtung und der Daten der biologischen Experimente, die mit dem Biochip der Kartusche durchzuführen sind. Diese Daten sind somit verwechslungssicher abgespeichert. Im nachfolgenden wird die Kopplung der Kartusche 101 in eine Vorrichtung zum immunologischen Nachweis biologischer Proben beschrieben. Diese Vorrichtung umfasst eine Abtastkammer 140, eine Detektionseinrichtung 149 und eine Druckluftversorgungsquelle 150.
Die tubusförmige Abtastkammer 140 wird mit einer offenen Probenseite 141 auf die die Reaktionskammer 122 begrenzende Folie 128 bzw. auf die darauf angeordnete Dichtung 129 aufgesetzt.
Der Durchmesser des Tubus 140 auf der Probenseite 141 entspricht dem
Durchmesser der auf der Folie 128 angeordneten Dichtung 129. Die Probenseite 141 ist stirnseitig von einer scharfkantigen umlaufenden Klinge 142 begrenzt. Die Klinge 142 ist derart ausgebildet, dass sie beim Aufsetzen der Abtastkammer 140 auf die Kartusche 101 in die Dichtung 129 der Kartusche 101 eindringt und eine druckdichte Verbindung bereitstellt.
An der Probenseite 141 des Tubus 140 sind Aussparungen 143 vorgesehen um den Zentrierstift 144 und die beiden Anschläge 145 der Kartusche 101 aufzunehmen. Auf diese Weise wird die Abtastkammer 140 exakt auf der Kartusche 101 bzw. deren Dichtung 129 und über der Reaktionskammer 122 positioniert. Durch die Anschläge 145 wird der exakte Anpressdruck eingestellt mit welchem die Abtastkammer 140 druckdicht auf der Kartusche 101 aufliegt.
In etwa mittig im Tubus 140 ist eine Druckluftleitung 148 angeschlossen, die mit einer Druckluftversorgungsquelle 150 verbunden ist. Über die Druckluftversorgungsquelle 150 und die Druckluftleitung 148 ist die Abtastkammer 140 im Bereich zwischen den Linsen 147 und der Kartusche 101 mit Druckluft beaufschlagbar. Auf diese Weise wird die Folie 128 flächig an den Biochip 130 angelegt.
Hinter den beiden Linsen 147 ist eine Detektionseinrichtung 149 zum Abtasten des Biochips 130 angeordnet.
Die Detektionseinrichtung 149 zum Auslesen des Biochips 130 ist in der WO 2007/135 091 A2 ausführlich beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird. Die optische Detektionseinrichtung 149 umfasst eine LED mit angegossener Kunststoffoptik (vorzugsweise Lambert-LED), eine LED-Optik, eine Beleuchtungsoptik, einen Anregungsfilter, einen dichroitischen Spiegel, eine NA- Blende, einen Emissionsfilter, eine Ausleseoptik und eine Kamera.
Als Lichtquelle wird vorzugsweise eine einzige Hochleistungs-LED mit hoher optischer Leistungsdichte und einer LED-Optik mit hoher numerischer Apertur (NA) verwendet. Hochleistungsleuchtdioden sind Leuchtdioden mit einem Lichtstrom von zumindest 35 Im. Vorzugsweise werden Leuchtdioden mit einer Lichtstrom von mindestens 40 Im, mindestens 50 Im oder mindestens 100 Im verwendet. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die Leuchtdiode Luxeon Star (Rot, 1 W elektrische Leistungsaufnahme, 42 Im Lichtstrom) verwendet.
Ein Vorteil einer LED zur Ausleuchtung von Biochips liegt auch in der Variabilität der Wellenlänge. LEDs sind im gesamten sichtbaren Spektrum mit hoher Effizienz verfügbar.
Für die typischen nachzuweisenden Farbstoffe in den Spots auf dem Biochip kann eine spektral gut angepasste LED als Lichtquelle eingesetzt werden. Zum Beispiel:
Farbstoff Cy5 Absorptionsmaximum bei 649nm
- Anregen mit LED LUXEON LD3 (Farbe rot, max. bei 630nm) Farbstoff Cy3 Absorptionsmaximum bei 514nm
Anregen mit LED LUXEON LM3 (Farbe grün, max. bei 530nm) Farbstoff Alexa Fluor 532 Absorptionsmaximum bei 532
- Anregen mit LED LUXEON LM3 (Farbe grün, max. bei 530nm)
Die Auswahl einer LED erfolgt für einen Wellenlängenbereich ΔλE der für Fluoreszenzmessungen (z.B. für Farbstoffe Cy5, Cy3, Alexa, ...) benötigt wird.
Die Kamera weist ein flächiges CCD-Element als Detektor auf, so dass ein rechteckförmiges, insbesondere quadratisches Bild erfasst werden kann. Die Kamera ist derart ausgebildet, dass mit ihr Belichtungszeiten von bis zu 20 Sekunden ausgeführt werden können. Je länger die Belichtungszeit ist, desto schwächere Fluoreszenzsignale können erfasst werden. Die Stärke der Fluoreszenzsignale hängt stark von der Anzahl der auf dem Biochip 130 ausgeführten Immunreaktionen. Diese relativ langen Belichtungszeiten stellen auch einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Scannern dar, die die einzelnen Spots der Reihe nach abtasten, da bei diesem Verfahren die Belichtungszeit nicht frei variierbar ist.
Im nachfolgenden wird die Anwendung der Kartusche Il zur Durchführung und Untersuchung biologischer Proben mit temperaturgesteuerten biologischen Reaktionen beschrieben.
Die Abtastkammer 140 wird mit Ihrer Probenseite 141 auf die Folie der Kartusche 101 aufgesetzt. Dabei greifen die Ausnehmungen 143 der Abtastkammer 140 in den Zentrierstift 144 und die beiden Anschläge 145 ein, wodurch die Abtastkammer 140 positioniert und der Anpressdruck auf die Dichtung 129 begrenzt wird. Die Klinge 142 dringt dabei in die Dichtung 129 ein und stellt eine druckdichte Verbindung sicher.
Über die Druckluftleitung wird die Abtastkammer mit Luft gefüllt. Auf diese Weise wird in dem zwischen Optik 146 und transparenter Folie 128 abgedichteten Raum ein Überdruck zwischen 2 bar und 4 bar erzeugt. Die transparente Folie 128 legt sich durch den Überdruck an den Biochip 130 an und verdrängt den Fluoreszenzüberstand der Probenflüssigkeit über dem Biochip 130. Die Fluoreszenz im übrigen Probenraum wird abgeblendet. Somit kann ein Fluoreszenzbild des Biochips 130 aufgenommen werden.
Eine Durchmischung (Zwangskonvektion) der Probe wirkt sich positiv auf die
Reaktionsgeschwindigkeit der Hybridisierung/Inkubation aus, deshalb verkürzt sich die Inkubationszeit bzw. sind höhere Signalintensitäten möglich. Eine solche Zwangskonvektion kann daher nicht nur durch Variieren der Temperatur, sondern auch durch Variieren des außen an der Folie anliegenden Überdrucks erzielt werden.
Durch den Innenüberdruck der Kartusche 101 von 0,4 bar wird die „Fenster"-Folie 128 insbesondere beim Aufheizen mechanisch belastet und würde sich plastisch verformen. Durch einen Außenüberdruck von ebenfalls 0,4 bar kann diese Belastung neutralisiert werden. Dies ist z.B. während der immunologischen Reaktion von Vorteil, bei dem die Folie erheblich thermisch belastet wird.
Bei der vorstehend beschriebenen Vorrichtung ist von Vorteil, dass großflächige Oberflächenunebenheiten auf dem Biochip 130 bleiben, anders als bei starren aus dem Stand der Technik bekannten Deckgläschen, ohne Einfluss auf das Fluoreszenzsignal.
Die optische Qualität der Folie 128 hat aufgrund ihrer geringen Dicke und der Nähe der Folie 128 zum Biochip 130 nur geringen Einfluss auf die Auswertbarkeit der Fluoreszenzsignale
Das Anlegen der Folie 128 an den Biochip 130 ist reversibel, somit ist eine realtime- Detektion möglich
Bei dem Einsatz von Kartusche I oder Il kann prinzipiell zu jedem Zeitpunkt der biologischen Reaktion eine Detektion der Spots auf dem Biochip vorgenommen werden.
Die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der Kartusche I oder Il sind als vorteilhafte Ausführungsformen zu verstehen und keineswegs als Beschränkungen für die Durchführung des Immuntests auszulegen. Funktionale Modifikationen liegen im Können eines Fachmanns und sollen nicht ausgeschlossen werden.
Unabhängig davon welche Kartusche (I oder II) zum Einsatz kommt, erfolgt das Auslesen und Einschreiben von Daten nach dem gleichen Prinzip:
Alle Informationen über die Kartusche, einschließlich Biochip, müssen vom Biochipreader ausgelesen werden. Zum Ansteuern exakter Temperaturen werden Daten des Heizers auf der Leiterplatte benötigt. Auch die Informationen über die auf den Biochip aufgebrachten Reaktionsfelder (Spots), ID-Nummern, Belichtungszeiten für die Bildaufnahme, usw., müssen vom Reader ausgelesen werden, um die temperaturgesteuerte biologische Reaktion zu steuern und eine Protokollierung und Archivierung zu ermöglichen. Die notwendigen Informationen können als Dot-Code oder als Bar-Code auf die Kartusche aufgebracht werden. Zum Auslesen dieser Codes benötigt man einen Dot- Code-Reader (oder Bar-Code-Reader). Flexibler ist der Einsatz von beschreibbaren und auslesbaren manipulationssicheren Speichermedien die vorteilhafterweise auf der Leiterplatte integriert sind.
Neben den Kontaktflächen der Heizstruktur kann auch die Kontaktierung eines elektrisch programmierbaren nicht-flüchtigen Speichers auf der Leiterplatte erfolgen. Damit können Informationen digital abgespeichert und zu jedem Zeitpunkt abgefragt werden. Die speicherbare Datenmenge ist dabei deutlich größer als bei aufgebrachten Bar- oder Dotcodes.
Die erhaltenen Informationen werden von einer geeigneten Software verarbeitet, wobei die räumliche Anordnung der FAK-Spots (Array Layout) über das Layout in der Software bereits hinterlegt ist.
Bei einem kontaktierten elektrisch programmierbaren nicht-flüchtigen Speicher können auch Informationen während der Immunreaktion beim Auslesen des Biochips gespeichert werden. Außerdem können die Daten manipulationssicher gespeichert werden. Nach einer erfolgten Prozessierung kann die Kartusche auch als „prozessiert" markiert werden.
Zusammengefaßt sind die Vorteile des erfindungsgemäßen Vorgehens:
• Hochintegriertes System mit minimierter Anzahl an manuellen Schritten
• Keine Waschschritte, deshalb optimale Korrelation von Bindungspartnermenge und Signal • Multiplexfähiges Nachweissystem: o Eine Kartuschensorte für den Nachweis mehrerer Substanzen o Nachweis mehrerer Substanzen oder mehrerer Merkmale auf einer Substanz gleichzeitig in einer „einzigen" Reaktion
• Einflussmöglichkeiten auf den Assay-Ablauf sehr hoch, durch Zeit-/ Temperatursteuerung. Deshalb einfache Optimierung der Parameter für unterschiedliche Nachweise möglich, und:
• Einfache Umsetzung neuer Nachweise auf der Systemplattform. Es müssen nur die entsprechenden Bindungspartner eingesetzt werden.
Es gibt mehrere systembedingte Besonderheiten, die das beschriebene erfindungsgemäße System von bekannten Verfahren unterscheiden:
> Mehr als 2 Bindungspartner
> Ohne Waschen
> Alle biochemischen Reaktionen zwischen den beteiligten Bindungspartner die z.B. im Standard-Sandwich-ELISA nacheinander (mit Waschschritten dazwischen) erfolgen, finden im Einschritt Immuntest gleichzeitig/zusammen statt. Diffusion ist hier die treibende Kraft. Die Diffusionsgeschwindigkeit wird z.B. durch Temperatur, Viskosität und Molekülgröße bestimmt; Konvektion kann die Diffusion beschleunigen.
Bei dem erfindungsgemäßen Einschritt-Sandwich-ELISA für einen Antigennachweis sind dies z.B. die folgenden Reaktionen: o Fängerantikörper-Antigen o Antigen - biotinylierter Detektionsantikörper o Biotinylierter Detektionsantikörper - Streptavidin-Cy5
Die Detektion kann erst dann stattfinden, wenn alle Reaktionen stattgefunden haben.
Damit die Bindungspartner in den verschiedenen Reaktionen nicht untereinander konkurrieren, müssen die Reaktionsbedingungen optimal eingestellt sein. Ansonsten würde der zuverlässige immunologische
Nachweis verhindert. Diese einzustellenden Reaktionsbedingungen sind insbesondere:
1. Biochip/Microarrav > Fixieren der Proteinspots mit einem Stabilisator (ganz bevorzugt:
Trehalose), um die Tertiärsturktur der Proteine zu erhalten; außerdem Erhöhung der Haltbarkeit.
> Eintrocknen der mit Trehalose behandelten Proteinbiochips und Auflösen während der Einschritt Immunoreaktion durch das im Biomix enthaltene Detergenz (ganz bevorzugt: Triton-X)
> Keine Blockierung des Biochips nach dem Spotting, das Abreagieren der funktionalen Epoxygruppen zwischen den Spots findet während der Reaktion durch den Biomixpuffer statt.
2. Biotestmix
> Zusammensetzung des Biotestmixes, insb. Triton X, als Detergenz und dessen Konzentration (Viskosität des Biotestmix beeinflusst die Diffusion)
> lonenstärke des Biotestmixpuffers
> Konzentration der Detektionsantikörper
3.Prozessierunqsparameter
> Temperatur (beeinflusst die Diffusion): Bester Temperaturbereich 37°C ± 2°C.
> Konvektion im Probenraum kann die Diffusion beschleunigen und damit die Reaktionen beschleunigen und so die Prozessierungszeit erheblich verringern. Die Konvektion wird z.B. durch Zyklieren der Temperatur, z.B. Wechsel zwischen 32 0C und 400C je 30 Sek oder durch minimale Druckveränderungen im Probenraum erreicht
> Probenvolumen beeinflusst die Diffusion, insb. die Diffusionszeiten
4. Kartusche > Detektion: Verdrängung der fluoreszierenden Flüssigkeit ersetzt das Waschen!
Durch die mechanische Verdrängung wird der Hintergrund bei der Detektion niedriger und gleichmässiger als dies durch Waschschritte erreicht werden kann. Dies führt zu einem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis und damit zu einer sensitiveren Meßmethode, die ausserdem niedrige Assay- Varianzen zeigt. Der Grund liegt darin, dass die spezifischen Bindungen am Substrat nicht durch das Waschen beeinträchtigt werden und damit kein Signalverlust durch Wegwaschen stattfindet. Außerdem bleibt der Hintergrund durch das „Nichtwaschen" schwach und zudem gleichmäßig.
Dies ist ein riesiger Vorteil, der bei immunologischen Nachweisen noch ausgeprägter ist als z.B. bei DNA-Nachweisen.
Die Erfindung wird weiter anhand der Abbildungen (Figuren) beschrieben, welche zeigen:
Fig. 1 Grundkörper der Kartusche I
Fig. 2 eine Ausführung der Reaktionsfelder (Spots) auf dem Biochip mit optisch undurchlässiger und nicht fluoreszierender Rückseite
Fig. 3 Anordnung des Inlays mit dem zugehörigen Optikmodul
Fig. 4 perspektivische Ansicht eines Gehäuses einer Kartusche II,
Fig. 5 Ansicht des Gehäuses aus Fig. 4 in einer Seitenansicht im Teilschnitt zusammen mit einem Stöpsel,
Fig. 6 einen Längsschnitt durch einen Bereich der Kartusche II,
Fig. 7 Schnitt durch die Kartusche Il und einer Abtastkammer, Fig. 8 Befüllvorgang der Kartusche Il mit nicht aufgesetztem Stöpsel,
Fig. 9 Befüllvorgang der Kartusche Il mit eingedrücktem Stöpsel,
Fig. 10 Leiterplatte der Kartusche Il mit einer Heiz-/Messstruktur,
Fig. 11 die Abtastkammer aus Figur 7 und eine daran angeschlossen Druckluftversorgungsquelle in einer Schnittdarstellung.
Fig. 12 Schnitt durch den Stöpsel und einen Einfüllstutzen der Kartusche Il
Fig. 13 Entwicklung eines Multiplex-Sandwich-Assay
Fig. 14 Array-Layout
Fig. 15 Bezeichnungen der Antikörper
Fig. 16 Scan-Bild nach Spotting
Fig. 17 Reaktionsmechanismus der Epoxy-Kopplung
Fig. 18 Konstruktionszeichung Biochip-Slide
Fig. 19 In Software hinterlegtes Array Layout
Fig. 20 Alignment des Arrays
Fig. 21 Bild des Biochips im Gerät, Auswertung der Intensitäten
Fig. 22: Zeitkinetik der Rizin-Detektion (Single Plex)
Fig. 23: „4-Plex-Assay"
- Spotten verschiedener Fänger-Antikörper (mono- und polyklonal) pro Toxin - ein Detektionsantikörper pro Toxin (mAb)
- gleichzeitige Detektion von Rizin, BoNT/A, BoNT/B und SEB innerhalb von 30 Minuten
- Detektion gereinigter Toxine oder Rohpräparationen/Kulturüberstände möglich
Fig. 24 , Darstellung der Endergebnisse nach automatischer Auswertung durch die Software: positiver Nachweis für BONT A/B und Rizin, negativer Nachweis für SEB
Fig. 25 LOD-Bestimmung für SEB-Toxin
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele beschreiben, die eine beispielhafte Ausführung der Erfindung darstellen sollen, aber als nicht beschränkend für den Schutzumfang auszulegen sind.
Beispiel 1 : Toxin-Nachweis
Mit dem Toxin-Assay ist der simultane Nachweis von drei biowaffenfähigen Toxinen möglich. Es handelt sich dabei um Rizin, Staphylococcus-Enterotoxin B (SEB) und die Botulismus-Toxine A und B (BoNT A/B). Die Toxine können in ihrer aktiven Form als Rohextrakt oder gereinigt vorliegen, als Probenmatrix ist Mineralwasser etabliert.
1. Biochip • Der Glasträger für den Biochip besteht aus Floatglas (SCHOTT Borofloat 33,
0,7mm dick). Dieses wird auf der Rückseite antireflektiv beschichtet. Die Reflektivität ist bei der Anregungswellenlänge (630nm) minimiert.
• Der beschichtete Glasträger wird auf der Vorderseite in einem quadratischen Raster 0,55mm tief angesägt (Rastermaß: 3,3mm). Die Sägerillen dienen später als Sollbruchstellen beim „Vereinzeln" der Biochips vor der Montage in die Kartusche (Fig. 18).
• Der gesägte Glasträger (Außenabmessungen im Slide-Format 25x75,6mm) wird mit einem Epoxysilan funktionalisiert (nach Ultraschall-Reinigung mit 3- Glycidyloxypropyltrimethoxysilan in Toluol für 3h bei 800C) • Jede einzelne Biochip-Position des Südes wird mit einer identischen Anordnung von Antikörpern (Array Layout) bespottet. Die Spottinglösung besteht aus dem jeweiligen Antikörper in einer Konzentration von 0,5 mg/ml, in IxPBS und 20 mM Trehalose, sowie eventuell 0,025% BSA. Das Spotting geschieht mit einem kontaktfreien Piezo-Nanodispenser (Spotter). Die immobilisierten Antikörper befinden sich nach dem Spotting jeweils in einem runden Bereich von etwa
130μm Durchmesser (Spot), die Spots sind in einem Abstand von 200 oder 240μm aufgebracht. Durch Reaktion der Aminogruppen von Lysin- Aminosäuren an der Oberfläche der Antikörper mit den Epoxy-Gruppen der Silan-Beschichtung findet eine kovalente, irreversible Kopplung der Fängerantikörper an den Glasträger statt (Fig. 17).
2. Array Layout
Es gibt 4 Kategorien von Spots (83 Stück) im Array Layout (Abb. 14, 15, 16).
• Marker (11 Spots): Hier werden aminomodifizierte Cy5-gelabelte Oligonukleotide gespottet, die dauerhaft leuchtende Spots ergeben. Diese
Marker-Spots werden von der Software automatisch erkannt (Alignment) (Abb. 19) und dienen zusammen mit dem in der Software hinterlegten Array Layout (Abb. 18) der Zuordnung der ausgewerteten Signalintensitäten der Spots zu den entsprechenden Antikörper-Sorten. • Fängerantikörper (7 Stück als Θfach-Replikate): Hier sind die für das jeweilige Toxin spezifischen Fängerantikörper gespottet. Ist ein entsprechendes Toxin vorhanden, leuchten nach der Prozessierung alle Spots dieser Sorte (Replikate). Es gibt jeweils 2 verschiedene Fänger-Antikörper für Ricin und SEB, sowie 1 Fängerantikörper für BoNT/A, 1 Fängerantikörper für BONT/B und 1 Fängerantikörper der BONT/A und BONT/B erkennt.
• Positiv-Kontrolle(1 als 6fach-Replikat): Hier ist ein Interleukin-Antikörper (anti-IL-12 rat) gespottet, der zusammen mit dem im Biomix vorhandenen Interleukin IL12 (mouse) und einem weiterem Ratten-Interleukin-Antikörper (verschiedene Klone) einen Sandwich aufbaut. Da dieser Sandwich bei jedem Nachweis aufgebaut werden kann, dient dies als Funktionalitäts-Kontrolle.
Liefert die Positivkontrolle kein Signal, darf ein negatives Testresultat nicht bewertet werden. Somit können beim Nachweis falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen werden.
• Negativ-Kontrolle (4 Stück als 6fach-Replikat): Hier sind die aus Serum issolierten IgGs gespottet, die aus den für die Antikörper-Produktion immunisierten Tierspezies stammen. Bindet ein in der zu untersuchenden Probe vorhandenes Agens etwa unspezifisch an alle Antikörper einer bestimmten Tierspezies, würde auch die entsprechende Negativ-Kontrolle ein Signal ergeben. Somit können beim Nachweis falsch positive Ergebnisse ausgeschlossen werden.
Die Biochip-Slides werden gekühlt unter Stickstoff-Atmosphäre gelagert.
3. Kartusche
• Zentraler Teil ist ein Spritzguß-Körper („Inlay") aus einem Cycloolefincopolymer (Zeonex, Zeonor oder Topas). Das Material ist sehr hydrophob mit einer niedrigen Oberflächenenergie, deshalb gibt es keine Probleme mit der Adsorption der biologischen Bestandteile an die Oberfläche des Reaktionsgefäßes. Eingelassen in die Oberfläche sind Strukturen, die einen Probenraum (mit optischem Fenster), einen Druckausgleichsraum, eine Befüllöffnung und Kanäle als Verbindung zwischen diesen Kompartimenten definieren.
• Zweiter Bestandteil ist eine flexible Leiterplatte, die eine Heizstruktur enthält, sowie einen Speicherbaustein für Kartuschen-relevante Daten und Kontaktinseln zum elektronischen Ansteuern und Auslesen der Flex-Leiterplatte im Gerät.
• Diese flexible Leiterplatte wird mit einem doppelseitigen biologisch verträglichen Klebeband („ARcare 8932" von Adhesives Research) verklebt, der Biochip auf der Heizstruktur platziert und die Flex-Leiterplatte mit dem Inlay verklebt. Die Strukturen im Inlay ergeben somit einen hermetisch abgeschlos- senen, den Biochip enthaltenden Innenraum, der über die Flex-Heizstruktur temperierbar ist.
• Das Inlay wird in zwei Halbschalen aus Kunststoff-Spritzguss aufgenommen, dies ergibt zusammen die Kartusche. In die optikseitige Halbschale ist eine quadratische Blendenöffnung eingelassen, die zu dem im Probenraum befindlichen Biochip zentriert ausgerichtet ist. Auf der Außenseite der
Halbschalen befinden sich Strukturen, die eine einfache und genaue automatische Positionierung der Kartusche beim Einlegen in das Gerät gewährleisten. 4. Biomix-Tube
Der Biomix enthält die fluoreszenzmarkierten Detektionsantikörper, die PBS- Pufferbestandteile und Trehalose. Eine Mischung von 40μl Wasser, das 1OmM PBS, 10OmM Trehalose und 0,5% BSA enthält, mit 4 Cy5-gelabelten Detektionsantikörpem (2 - 15μg/ml), dem Cy5-gelabelten Interleukin-12-Antikörper (2μg/ml) und Interleukin- 12 (400ng/ml) wird direkt in Eppendorf-Tubes lyophilisiert.
Figure imgf000039_0001
Auch hier ist wiederum Trehalose enthalten, um die Belastung der Antikörper durch den Lyophilisierungsvorgang zu minimieren sowie die Haltbarkeit des Lyophilisats zu gewährleisten.
5. Assay-Puffer
Der Assay-Puffer besteht aus Wasser und 0,5% Triton-X 100 . Er wird gebraucht, um das Lyophilisat vor der Probenzugabe zu rekonstituieren. Das Triton-X als nichtionisches Detergenz bewirkt die rasche Auflösung des Lyophilisats (Trehalose = ungeladenes Disaccharid) und in der befüllten Kartusche ebenfalls die rasche Auflösung der eingetrockneten Spots. 6. Gerät
Das Gerät wird über einen externen PC mit einer Software, welche vollautomatisch alle Komponenten des Gerätes steuert und die über den eingebauten Bildschirm bedienbar ist, betrieben.
Hinter einer Frontklappe befindet sich eine Öffnung, um die Kartusche aufzunehmen. Um diese Kartuschenaufnahme herum ist ein opto-elektromechanisches Modul aufgebaut, welches die Temperierung des Probenraumes während der Prozessierung, das Andrücken des Biochips an das optische Fenster und die Bildaufnahme im Fluoreszenzkanal bewerkstelligt.
Bei Benutzung der auf dem Gerät laufenden Endanwendersoftware beschränkt sich die Benutzerinteraktion auf das Einlegen der Kartusche und das Starten der Prozessierung per Knopfdruck. Bis zur Anzeige des Endergebnisses ist keine weitere Interaktion erforderlich. Für Assayentwicklung und Service kann das Gerät per TCP/IP extern angesteuert werden.
Ein geeignetes Gerät ist bespielsweise von der Firma Zenteris GmbH käuflich erhältlich.
7. Ablauf der Anwendung im Detail (Untersuchung einer Probe)
• Bereitstellung von Reagenzien (Biomix-Tube, Assay-Puffer), Gilson Microman- Pipette 100μl, Pipettenspitze, Kartusche, Start des Gerätes
• Rekonstitution des lyophilisierten Biomixes mit 20μl Assay-Puffer.
• Zugabe von 20μl Probe (Probenmatrix: Wasser) zum Biomix, =>Mischen • Applikation der 40μl mit der Pipette in die Kartusche
• Frontklappe öffnen, einlegen der Kartusche ins Gerät, Frontklappe schließen
• Start der Prozessierung, typische Prozessparameter sind: Inkubation für 30min bei 37°C. • Nach abgeschlossener Inkubation wird der Biochip ans optische Fenster gedrückt, und ein Bild im Fluoreszenzkanal aufgenommen. Typische Belichtungszeit: 10sec.
• Hat das Gerät ein Bild erzeugt, beginnt die automatisierte Auswertung durch die Software. (Fig. , 19, 20) o Auffinden der Markerspots. o Alignment des Array Layouts anhand der Markerspots. o Auffinden der Antikörperspots anhand des platzierten Array Layouts. o Berechnung der Signalintensitäten jedes Spots (Medianwert). o Berechnung der Signalintensitäten des lokalen Hintergrunds jedes Spots
(Median). o Differenzbildung Signal - Hintergrund. o Klassifizierung der Spotqualität. „Zweifelhafte" Spots werden von der weiteren Auswertung ausgeschlossen. o Zusammenfassung aller Replikate einer Antikörpersorte durch
Mittelwertbildung o Zusammenfassung aller Antikörper eines nachzuweisenden Antigens durch Mittelwertbildung o Bewertung der Positiv- und Negativkontrollen für eine Aussage über die Validität des Nachweises: werden Toxine detektiert, muss die
Negativkontrolle negativ sein, werden keine Toxine detektiert, muss die Positivkontrolle aktiv sein. o Die Signalhöhe des nachzuweisenden Antigens muss einen bestimmten Schwellenwert (assay-spezifisch, bei der Entwicklung eruiert) überschreiten und statistische Kriterien erfüllen, um als Positivnachweis zu gelten. o Dann wird dieses Ergebnis auf dem Bildschirm angezeigt (Fig 24). o Auswertung der Ergebnisse (Fig. 21 ) Der Vorteil des angewendeten Verfahrens gegenüber allen anderen bekannten Verfahren besteht darin, dass nach dem Start der Prozessierung keine weitere Interaktion durch den Anwender mehr notwendig ist.
Beispiel 2: Zeitkinetik Rizindetektion
Die Durchführung des Experiments ist prinzipiell wie in Beispiel 1 beschrieben. Die gewählten Versuchsbedingungen sind:
Für alle 3 Experimente gleich:
• Detektionsantikörperansatz (lyophilisiert):
1 (Endkonzentration 9 μg/ml)
2 (Endkonzentration 1 ,5 μg/ml) 3 (Endkonzentration 7,5 μg/ml
4 (Endkonzentration 1 ,9 μg/ml)
5 (Endkonzentration 3 μg/ml) Interleukin 12 (Endkonzentration 400 ng/ml)
• Lyophilisat in 0,5% Triton-X in dest. Wasser • Zugabe von Rizin RCA 60 (Endkonzentration 100ng/ml)
• 40 μl in Kartusche, Inkubation bei 37°C. Variation der Inkubationszeit: 10, 20, 30 Minuten
• Bildaufnahme und Ermitteln der Signalintenstität der Rizin-Fängerantikörper. Mitteln der Intensität (Median).
Die Ergebnisse sind in Fig. 22 gezeigt.
Beispiel 3: 4-Plex Assay Leer Experiment:
• Detektionsantikörper-Ansatz (frische Lösungen, keine Lyophilisat)
1 (Endkonzentration 9 μg/ml)
2 (Endkonzentration 3 μg/ml) 3 (Endkonzentration 8,25 μg/ml
4 (Endkonzentration 1 ,2 μg/ml)
• Zugabe von PBS/0,5%BSA, Triton X-100 (0,25%)
• 40 μl in Kartusche, Inkubation bei 37°C, Inkubationszeit: 30 Minuten
• Bildaufnahme
4-Plex Assay:
• Detektionsantikörper-Ansatz (frische Lösungen, keine Lyophilisat)
1 (Endkonzentration 9 μg/ml)
2 (Endkonzentration 3 μg/ml) 3 (Endkonzentration 8,25 μg/ml
4 (Endkonzentration 1 ,2 μg/ml)
5 (Endkonzentration 1 ,25 μg/ml) Interleukin 12 (Endkonzentration 400 ng/ml)
• Zugabe von PBS/0,5%BSA, Triton X-100 (0,25%) • Zugabe von RCA 60 (Endkonzentration 1 μg/ml), SEB (Endkonzentration
1 μg/ml), BONT A Komplex (Endkonzentration 1 μg/ml),BONT B Komplex (Endkonzentration 1 μg/ml)
• 40 μl in Kartusche, Inkubation bei 37°C, Inkubationszeit: 30 Minuten
• Bildaufnahme
Der 4-Plex Nachweis liefert vergleichbare Ergebnisse mit Rizin Rohextrakt, SEB, BONT A und BONT B Kulturüberständen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 23 gezeigt. Beispiel 4: LOD-Bestimmung für SEB-Toxin (LOD= Limit of Detection=Nachweisgrenze)
Anhand einer Konzentrationsreihe des SEB-Toxins wird die Nachweisgrenze dieses Toxins bestimmt.
Die Durchführung der Experimente ist prinzipiell wie in Beispiel 1 beschrieben.
• Detektionskörper-Ansatz (lyophilisiert) : 1 (Endkonzentration 13,5 μg/ml)
2 (Endkonzentration 4,5 μg/ml)
3 (Endkonzentration 8,25 μg/ml)
4 (Endkonzentration 1 ,9 μg/ml)
5 (Endkonzentration 1 ,9 μg/ml) Interieukin 12 (Endkonzentration 50 ng/ml)
BSA (Endkonzentration 0,5%)
D(+)-Trehalose (Endkonzentration 10 mM)
PBS (Endkonzentration 10 mM)
• Lyophilisat in 20 μl Wasser mit 0,5% Triton-X + 20 μl Reinstwasser rekonstituiert
• Zugabe verschiedener SEB-Konzentrationen zwischen 8 ng und 165 μg (gelöst in 10 mM PBS mit 0.1 % BSA)
• 40 μl in Kartusche, Inkubation bei 37°C für 30 min
• Bildaufnahme, Auswertung • Bestimmung des LOD-Wertes aus sigmoidalem Fit der Intensitätwerte
• Ergebnis: Nachweisgrenze ist 4 ng/ml für SEB
Das Ergebnis der Messwerte inkl. sigmoidalem Fit wird in Fig. 25 graphisch dargestellt. [Bezugszeichenliste]
1 Grundkörper bzw. Grundplatte 2 Ausgleichsraum
3 Kontrollfenster bzw. Sichtfenster
4 Ausgleichskanal bzw. Verbindungskanal
5 Reaktionsraum bzw. Probenraum
6 Biochip 6.1 - Reaktionsfelder (Spots)
6.2 - Rückbeschichtung
7 Befüllkanal
8 Rückschlagventil
9 Befüllöffnung bzw. Befüllstutzen 10 Flex-LP
10.3 Heizstruktur Flex-LP
12 Stößel
14 Detektionsebene
15 Beobachtungsfenster 27. Optikmodul
101 Kartusche
102 Gehäuse
103 Basiswandung 104 Seitenwandung
105 Längsseite
106 Stirnseite
107 Innenseite
108 Leiterplatte 109 Außenseite
110 Einfüllstutzen
111 Einfüllabschnitt
112 Verdichtungsabschnitt
113 Fase 114 Dichtpunkt
115 Stöpsel
116 zylindrischer Abschnitt
117 trichterförmiger Abschnitt 118 Befüllöffnung
119 Befüllanzeige
120 Befüllleitungsabschnitt
121 Durchgangsöffnung
122 Reaktionskammer 123 Ausgleichsleitungsabschnitt
124 Ausgleichsraum
125 Durchgangsbohrung
126 Halbkugel
127 Befüllanzeige 128 Folie
129 Dichtung
130 Biochip
131 Dichtungsring
132 Heiz-/Messstruktur 137 Leiterbahn
138 Kontaktstelle
139 Kontaktstelle
140 Abtastkammer
141 Probenseite 142 Klinge
143 Aussparung
144 Zentrierstift
145 Anschlag
146 Optik 147 Linse
148 Druckluftleitung
149 Detektionseinrichtung
150 Druckluftversorgungsquelle
151 Blende

Claims

Patentansprüche:
1. System zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen und/oder mehrerer Merkmale nebeneinander, das folgendes aufweist:
Biotestmix-Tube enthaltend einen für den Nachweis notwendigen Detektions-Bindungspartner, Pufferbestandteile, mindestens ein Detergenz und mindestens einen Stabilisator,
Einmal-Kartusche aufweisend
- einen Reaktionskammer in der sich ein Biochip (Microarray) auf dem Fänger-Bindungspartner in Form von definierten Reaktionsfeldern (Spots) aufgebracht sind, befindet,
- eine Temperiervorrichtung zur Einstellung unterschiedlicher Temperaturen und deren Änderung in der Reaktionskammer,
- ein Detektionsfenster durch das eine optische Detektion der Spots auf dem Biochip, nach erfolgter Immunreaktion, mit einem Optikmodul erfolgt.
2. System nach Anspruch 1 , wobei der Biotestmix-Tube weiter mindestens ein Protein und/oder eine Positivkontrolle enthält.
3. System nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Detergenz Triton-X50 oder Triton- X100 ist.
4. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Stabilisator Trehalose ist.
5. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Detektions- Bindungspartner mindestens ein gegen die nachzuweisende(n) Substanz(en) oder das/die nachzuweisende(n) Merkmal(e) gerichteter Antikörper oder ein Antigen ist.
6. System nach Anspruch 5, wobei der Antikörper oder das Antigen mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert ist.
7. System nach Anspruch 5, wobei der Antikörper biotinyliert ist und der Biotest- Mix weiter ein mit einer Markierung versehenes Streptavidin enthält.
8. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fänger- Bindungspartner ein Antikörper oder Antigen ist.
9. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die nachzuweisenden Substanzen Proteine, Liganden, Rezeptoren, Viren, Bakterien, Medikamente, chemische Substanzen, Mykotoxine oder Toxine sind.
10. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kartusche weiter aufweist:
- einen Einfüllstutzen, der kommunizierend mit der Reaktionskammer verbunden ist, und
- einen Ausgleichsraum, der kommunizierend mit der Reaktionskammer verbunden ist, wobei die Reaktionskammer, der Ausgleichsraum und alle hiermit verbundenen Leitungen einen bis auf am Einfüllstutzen abgeschlossenen Raum bilden, wobei der Einfüllstutzen einen freien Durchgang von außerhalb der Kartusche zur Reaktionskammer bildet, und ein Stöpsel vorgesehen ist, der formschlüssig und dicht derart im Einfüllstutzen aufgenommen wird, dass er beim Eindrücken über einen bestimmten Weg Fluid aus dem Einfüllstutzen in Richtung zur Reaktionskammer verdrängt.
11. System nach Anspruch 10, wobei die Reaktionskammer an einer ersten Seite durch eine transparente, flexible Folie begrenzt ist, die ein Sichtfenster bildet.
12. Verfahren zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen oder mehrerer Merkmale nebeneinander unter Verwendung des Systems gemäß einem der Ansprüche 1-11 , aufweisend die folgenden Schritte:
- eine Probe, die die nachzuweisenden Substanzen oder Merkmale enthält, wird in das Biotestmix-Tube gegeben,
- diese Mischung wird in den Reaktionsraum einer Kartusche eingebracht,
- die Kartusche wird in ein geeignetes Gerät eingelegt und der Inkubations- Prozess gestartet, - nach abgeschlossener Inkubation wird über dem Biochip anstehende Flüssigkeit mechanisch verdrängt, und ein Bild mittels Optikmodul aufgenommen,
- eine in dem Gerät vorhandene Software wertet unter Anwendung des Biochip-Layouts die Spotintensitäten aus und liefert eine Aussage über die Anwesenheit der nachzuweisenden Substanzen bzw. Merkmale in der Probe.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Inkubation zwischen 300C und 40°C stattfindet.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei zum Durchführen einer optischen Abtastung der Reaktionskammer in der Kartusche weiter eine Abtastkammer vorgesehen ist, in der während der optischen Abtastung ein Überdruck von vorzugsweise 1 bar bis 4 bar derart erzeugt wird, dass sich die Folie an den Biochip anlegt und die Probenflüssigkeit aus der Reaktionskammer in Richtung zum Ausgleichraum verdrängt wird, wobei eine Luftblase über der Probenflüssigkeit im Ausgleichsraum verbleibt.
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Priority Applications (2)

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US12/740,569 US9229000B2 (en) 2007-11-02 2008-11-03 Single-step multiplex immunoassay
DE112008002776T DE112008002776A5 (de) 2007-11-02 2008-11-03 Einschritt-Multiplex-Immuntest

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DE102007052281A DE102007052281A1 (de) 2007-11-02 2007-11-02 Einschritt-Multiplex-Immuntest
DE102007052281.0 2007-11-02

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DE (2) DE102007052281A1 (de)
WO (1) WO2009056350A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130029349A1 (en) * 2011-07-26 2013-01-31 Indicator Systems International, Inc. Assays for the detection of microbes
CN107619886A (zh) * 2017-11-06 2018-01-23 厦门华侨亚热带植物引种园 一种提高ic‑rt‑pcr技术检测能力的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2661625A4 (de) * 2011-01-05 2014-10-29 Zeus Scientific Inc Diagnoseverfahren
EP3401665A1 (de) * 2017-05-12 2018-11-14 University College Dublin National University Of Ireland, Dublin System und vorrichtung zur analyse eines bestimmten materials in flüssigen proben durch optische mikroskopie
CN110716046B (zh) * 2018-07-11 2023-03-28 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于温差的加速固相免疫反应技术
CN110736844A (zh) * 2019-12-07 2020-01-31 南京岚煜生物科技有限公司 一种心肌肌钙蛋白的检测方法
CN113720818B (zh) * 2021-08-27 2023-11-14 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种荧光免疫检测系统
CN115356479B (zh) * 2022-08-24 2023-11-28 厦门宇昊软件有限公司 一种金免疫层析检测方法和系统
CN117065816B (zh) * 2023-09-22 2024-01-30 北京芯迈微生物技术有限公司 一种微流控芯片及其检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005108604A2 (de) * 2004-05-06 2005-11-17 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und verfahren zum nachweis von molekularen wechselwirkungen
WO2006132666A1 (en) * 2005-06-06 2006-12-14 Decision Biomarkers, Inc. Assays based on liquid flow over arrays
WO2008064865A2 (de) * 2006-11-28 2008-06-05 Zenteris Gmbh Vorrichtung zur durchführung und untersuchung biologischer proben mit temperaturgesteuerten biologischen reaktionen

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4584268A (en) * 1981-10-13 1986-04-22 Ceriani Roberto Luis Method and compositions for carcinoma diagnosis
ATE264718T1 (de) * 1999-07-02 2004-05-15 Clondiag Chip Tech Gmbh Microchip-matrix-vorrichtung zur vervielfältigung und charakterisierung von nukleinsäuren
US6653062B1 (en) * 2000-07-26 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Preservation and storage medium for biological materials
AT5044U1 (de) 2001-05-10 2002-02-25 Medsystems Diagnostics Gmbh Quantitativer einschritt immuntest in lyophilisierter form
US7723123B1 (en) * 2001-06-05 2010-05-25 Caliper Life Sciences, Inc. Western blot by incorporating an affinity purification zone
WO2003065146A2 (en) * 2002-01-25 2003-08-07 Applera Corporation Methods for placing, accepting, and filling orders for products and services
US20040137607A1 (en) * 2003-01-09 2004-07-15 Yokogawa Electric Corporation Biochip cartridge
CN102993306B (zh) * 2003-02-01 2015-01-28 唐纳士公司 高亲和力抗人类IgE抗体
DE10315074A1 (de) * 2003-04-02 2004-10-14 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren
US8916348B2 (en) 2004-05-06 2014-12-23 Clondiag Gmbh Method and device for the detection of molecular interactions
DE102005052752A1 (de) * 2005-11-04 2007-05-10 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
DE102005052713A1 (de) * 2005-11-04 2007-05-16 Clondiag Chip Tech Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
DE102006023945A1 (de) 2006-05-18 2007-11-22 Jenoptik Instruments Gmbh Verfahren und optisches Modul zum Auslesen von Biochips

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005108604A2 (de) * 2004-05-06 2005-11-17 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und verfahren zum nachweis von molekularen wechselwirkungen
WO2006132666A1 (en) * 2005-06-06 2006-12-14 Decision Biomarkers, Inc. Assays based on liquid flow over arrays
WO2008064865A2 (de) * 2006-11-28 2008-06-05 Zenteris Gmbh Vorrichtung zur durchführung und untersuchung biologischer proben mit temperaturgesteuerten biologischen reaktionen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F.S. LIGLER ET ALTHE ARRAY BIOSENSOR: PORTABLE AUTOMATED SYSTEMS, ANALYTICAL SCIENCES, vol. 23, 10 January 2007 (2007-01-10), pages 5 - 10, XP002515013 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130029349A1 (en) * 2011-07-26 2013-01-31 Indicator Systems International, Inc. Assays for the detection of microbes
US8609355B2 (en) * 2011-07-26 2013-12-17 Indicator Systems International, Inc. Assays for the detection of microbes
CN107619886A (zh) * 2017-11-06 2018-01-23 厦门华侨亚热带植物引种园 一种提高ic‑rt‑pcr技术检测能力的方法

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