WO2013186359A1 - Analyseverfahren auf basis eines arrays - Google Patents

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Günter Roth
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Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • Proteins are known as alanine scans, where each amino acid position on the protein is replaced by alanine, and if a biochemically important substitution takes place for a mostly inactive alanine, the protein loses its activity find important positions, especially in the case of enzymes, but there are 19 other natural ones in addition to alanine
  • the screening can be divided into three main areas:
  • Interaction by adjusting environmental conditions such as salinity, temperature, pH, additives, co-enzymes etc ..
  • Molecules now generate a signal. This means that subsequently a structure elucidation of the found molecule must be operated.
  • combinatorial production and propagation or display methods is a special biochemical process management.
  • a substance library based on DNA or RNA is built by combinatorial production. This DNA or RNA is then converted into biologically active "components" (e.g.
  • Phages, E. coli, yeast cells, ribosomes, etc. By activation of a multiplication pulse, these molecules can be multiplied and thus amplified.
  • the amplification may be carried out in a biologically natural manner, e.g.
  • microarrays Single production of 10 and more molecules have proven themselves microarrays. Here is It is possible by means of printing techniques or lithography to produce up to 10 A 6 different DNA strands. Thus, the microarrays represent the state of the art for the
  • a disadvantage is that the accidental feeling prevents more a priori can be determined on which particle which substance was built up.
  • the particles are separated from each other and, separately, they separate the molecules from the particle.
  • a purest solution of the molecule can then in classic manner e.g. In a microtiter plate, examine parts of this solution. If the molecule has the desired properties, the purest solution is analyzed, thereby elucidating the structure of the molecule.
  • There is an effort to label the particles for synthesis so that the path of each individual particle can be traced during the synthesis.
  • these methods require a labeling system of the bead and monitoring of the location of the bead between the spreading steps. For reasons of synthesis efficiency, it must nevertheless be checked again whether the particle produced was also processed correctly.
  • these methods have the advantage that measurements of 10 components and more based on chemical
  • the mixture produced is then subjected to a selection process, ie a process that ensures that molecules with the desired property accumulate and molecules with undesired properties are depleted. If necessary, selections are carried out several times in succession, thus enriching the desired molecules more and more.If the enrichment is high enough, a detection and identification of the molecules can take place.However, a direct identification of the molecules is not possible, only in the case of DNA, RNA and in special cases for proteins, it is also possible to insert an amplification step that allows further enrichment until identification can take place.
  • Selection step to produce a final pool of molecules In the case of the display methods, this can be 3 to 5 repetitions (phage display) up to 10 to 20 repetitions (SELEX). This is time consuming and costly.
  • the invention relates to a method for analyzing molecular properties and / or reaction conditions, comprising the following steps a) providing a first memory comprising a first surface, wherein a selection of sample molecules to the surface in a defined arrangement directly or b) producing at least two transfer stores comprising the provision of at least two further surfaces, and a reaction step selected from the group transfer reaction, amplification reaction and / or derivatization reaction, whereby
  • Product molecules can arise and bind these product molecules and / or the sample molecules to the surfaces, wherein a one-to-one spatial association between the sample molecules of the first memory and the product molecules and / or sample molecules of the transfer memory is c) analysis step, comprising analyzing the first memory , of the
  • Sample molecules, on a first memory an original generated.
  • a first memory can therefore also be referred to as original within the meaning of the invention.
  • This memory shows a spatially fixed arrangement of the sample molecules. Each position on the original is uniquely linked to one or more sample molecules.
  • On the basis of this original at least two, preferably a plurality, transfer memory are then produced. Different "copies" are possible, ie the manufactured ones
  • Transfer storage may differ. Subsequently, both the first memory and the prepared transfer memories or the copying process itself can be analyzed.
  • This method according to the invention therefore offers a multiplicity of copy and analysis possibilities which can be used for numerous applications and questions. It is particularly preferred that the selection (ii) of sample molecules is carried out by a targeted selection. By clever combination of the sample molecules, a higher throughput can thus be achieved than is possible in the prior art.
  • the selection of sample molecules can be done in different ways. On the one hand, it is possible to perform a targeted selection from a large pool of sample molecules. On the other hand, it is also within the meaning of the invention that, starting from a small pool of molecules by mutations, a pool of molecules is generated, which can be investigated by the method according to the invention.
  • the sample molecules are selected from a mutation library. This is preferably a molecular library, but all molecules are derived from a starting molecule. That All molecules of the library are almost identical to the starting molecule and are only varied at defined positions. The number of total variations is the product of
  • a copy also means an amplificate of a sample molecule, a derivative of a sample molecule or a transferred sample molecule.
  • a copy in the sense of the invention is above all a product molecule or the entirety of the According to this, not only identical molecules are referred to as copies, but any type of product molecule which can be formed by step iv).
  • a copy may therefore also be an amplificate or a derivative.
  • the copy of a DNA template molecule may be a DNA product molecule, but also an RNA or protein product molecule.
  • reaction step takes place in a cell-free reaction system, more preferably in a cell-free expression system.
  • An amplicon of a molecule is preferably formed by the amplification of a
  • the amplificate may be identical to the original molecule, or may be uniquely derived from the molecule (e.g., DNA
  • a derivative of a molecule is preferably the molecule or molecules that are formed when an origin molecule is converted or when amplicons of a molecule have been generated and converted, or molecules have been generated which are derived directly or indirectly from the original molecule (eg, DNA which was first amplified by PCR and then generated from it RNA or protein).
  • the invention thus represents a unique application as a novel combination of selection, microarray copying, screening and process management of single molecules or particles, so that it is possible to spatially separate a pool of sample molecules and particles in high parallel, to make multiple copies of the molecules from the separation pattern and to make sure by means of these copies or the copying process that a) the molecules are sorted (possibly existing contaminants are detected in the analysis process), b) the molecules can be copied at least once, preferably several times onto another surface, c) the molecules can be analyzed and identified in terms of their molecular structure by analyzing the original or one of the copies, and / or d) determining the properties of the molecules during the copying process or by analyzing the copy or the original.
  • An advantage of the invention lies in the copying step.
  • Obstacles can be overcome, so that copying an array can now be used for many different analysis methods, preferably simultaneous analysis methods.
  • the system has the potential over several orders of magnitude, from 10 A 2 to 10 A 6 and more, to detect and analyze different sample molecules. Further advantages of the process are the high purity with which the product molecules after the
  • the core steps of the method can also be called
  • a particular advantage of the invention is that it is possible by the inventive method, particularly long sample molecules such as nucleic acid sections, for example genomic DNA to be used as a sample molecules.
  • This is an enormous advantage over the prior art.
  • Monya Baker “Microarrays, megasynthesis", Nature Method, 2011, vol. 8, p. 457) it is stated that scientists are independent of the use of a sample molecules.
  • Oligonucleotide libraries are always striving to use or investigate more and longer oligonucleotides at a lower error rate ("No matter how researchers intend to use libraries of oligonucleotides, they usually want more oligonucleotides, longer oligonucleotides and lower error rates.") Article of the
  • first memory and transfer memory can be produced with DNA lengths of up to 1500 base pairs and also significantly more easily without loss of quality.
  • first memory may preferably various microarrays or microarray-like
  • Embodiments of the individual steps can now be combined freely and thus allow a large number of producible copies and / or applications.
  • the following describes the different embodiments of the steps.
  • a pool derived therefrom or else a mixture of molecules can be used.
  • the molecules can be free in solution, or bound to particles or surfaces.
  • Molecules can already be separated and are then transferred to the original.
  • the molecules may be single or two and more species of molecules may be coupled together. If at least two types of molecules are coupled to each other, the presence or analysis of one type of molecule can be used be concluded on the presence and structure of the second type of molecule (molecular tagging).
  • a molecular library preferably represents a mixture of up to 10 A 15 or more different molecules, which were generated, for example, by combinatorial chemistry. Most of the molecules in a library have similar basic structures or structural patterns that were randomly combined. The number of possible molecules is calculated as the product of the individual variation possibilities. For example, one DNA strand per position may contain 4 natural building blocks. This means that a combinatorial
  • sample molecules are bound to particles.
  • a better and especially targeted "loading" of the first memory can be done.
  • the sample molecules or particles are separated from each other by means of suitable restrictions and placed spatially resolved on the surface of the memory.
  • the sample molecules are attached in such a way that they can no longer leave their location in the following in a simple manner.
  • the original thus represents a spatially resolved molecular memory.
  • the storage is created by depositing particles on the surface.
  • Each particle carries exactly one or more types of molecules.
  • the support surface can be structured and the particles can be positioned differently on the structuring. If at least two types of molecules are present on one particle, it is possible to deduce the presence and the structure of the second type of molecule from the presence or analysis of one type of molecule (molecular tagging).
  • the first memory is a particle transfer memory.
  • the particles are deposited on the surface.
  • Each particle carries one or more types of molecules.
  • the support surface can be structured and the particles can be positioned differently on the structuring.
  • At least one sort of molecules is released from the particle or derivatives or amplified products of at least one sort of molecule of the particle are generated and then transferred to the surface of the transfer store transfer.
  • the transfer memory is a self-copy, since some molecules of the particles are copied into the memory.
  • the location information of the sample molecules to the particle remain, that is, the position of the particle and the position of the sample molecules can be assigned to each other.
  • the particle can be removed or for later molecule transfer or production of
  • the first memory is a molecule memory.
  • molecules are optionally deposited individually, in coupled form or as a mixture on the surface.
  • the support surface can be structured, offer preferred positions for the attachment of the molecules and the attachment can be positioned differently on the structuring.
  • the molecules initially remain in the molecule store.
  • Molecule memory with amplificates or derivatives of the molecule or molecules, which are initially contained in the first memory to occupy Thus, the molecule memory represents, so to speak, a self-copy of the original molecules and thus allows signal amplification. It remains the location information of the molecules obtained.
  • the first memory is a property memory.
  • Property stores as original are preferably attached to identical molecules or particles on the surface.
  • the support surface can be structured and the attachment can be positioned differently on the structuring.
  • the property memory may be inherent or due to external influence in each memory location
  • the property memory is preferably used for the optimization of a biochemical or chemical reaction and is intended to be different
  • All of the aforementioned first memories may contain a mechanism that allows the molecules to be released selectively at a position within the memory. This can be done by releasing the molecules by means of chemical, electrochemical, photochemical or purely electrical / magnetic, thermal mechanisms. In the case of particle stores, the entire particle or parts of it can be released. The molecules thus obtained are then ready for further investigation or modification. Optionally, a copy of the memory can be made and the copy of the molecules released targeted.
  • Embodiments for generating a copy the preferred embodiment of the first memory is shown in the form of the memory with cavities. The generation of the copy for other memory happens in a similar way.
  • the sample molecules may be released from the storage and transferred, or the containing molecules amplified and transferred or amplified and derivatized, and certain generated derivatives or amplificates are transferred to the copy.
  • the derivatives may be identical to the original molecules, or derived therefrom in direct or indirect form, and are thus unambiguously assignable to the original molecule.
  • an identical DNA can first be generated by a DNA, which can then be exchanged for a base by means of an enzyme system at a specific sequence position and then this modified DNA can be derivatized into RNA or even protein. Since the original sequence of the DNA is known, the sequence of the altered DNA is known and thus also of the resulting RNA or the protein.
  • a copy has the following characteristics:
  • One-to-one molecular relationships can be assigned so that, from the analysis of a molecule on one of the copies or the original, one can deduce what molecule it is on each of the copies and the original.
  • the surface of a copy can be planar or structured and itself again represent an original from which further copies can be made.
  • the transfer memory be created by a transfer copy.
  • a transfer copy the molecules of the first memory are transferred directly to the surface of the transfer memory. This requires that the molecules be released from the surface of the original, transferred and tethered to the copy.
  • the transfer memory be created by a derivatization copy.
  • the sample molecules of the original are derivatized and these derivatives are then transferred to the copy.
  • Derivatives may for example be a
  • the transfer memory be created by a self-generation copy.
  • the molecules of the original have a catalytic, enzymatic and / or chemical activity that causes added molecules to be amplified and / or derivatized. These self-generated molecules are then optionally transferred directly or by further derivatization or amplification to the copy.
  • the transfer memory be created by a combination copy. In the combination copy represents a parallel or serial chain of derivatization, amplification or self-generation to produce the copy. There are interconnected at least two processes, the optional amplification or derivatization or
  • amplification is carried out first, since then the original molecules are retained, and then a derivatization of the amplificates or a further amplification of the amplificates. These can then be in the
  • the transfer memory be created by a multi-molecule copy.
  • the multi-molecule copy at least two sorts of molecules are copied from one position.
  • at least one of the aforementioned copy generations directly transfer, amplification, derivatization, self-generation, combination are used or combined.
  • the transfer memory is formed by a liquid copy.
  • the liquid copy is given to the first reservoir a convertible molecule which is derivatized or amplified by or in the presence of suitable molecules on the original itself. That This results in a spatial association between the emergence of the derivatives or amplificates and the underlying molecules.
  • These derivatives and amplificates of the added molecules do not necessarily have to be transferred to a copy.
  • the transfer memory be created by a DNA to DNA copy.
  • the DNA to DNA copy corresponds to an amplification copy. This is in the original DNA, which is amplified by a DNA polymerase again to DNA. The resulting amplificates can then be bound directly to the copy, or amplified again by means of a solid-phase polymerase reaction on the surface.
  • DNA molecules were selected as sample molecules.
  • the reaction steps should produce a protein "copy". It was surprising that the product molecules (here proteins) in the miniaturized system ran much faster than expected. In particular, in comparison to the DAPA system, a 3 to 10-fold faster reaction time was achieved, so that in the future a protein copy can no longer be stopped after about 90 minutes, but already after about 15 minutes.
  • a DNA microarray could be generated as a transfer memory of previously unknown purity. The purity is so high that it is unlikely to be one with one Sequencing process can be detected, as this is more error-prone than the copy process used.
  • the method allows in a first section a faster, synthetically cleaner, less material and labor intensive production of Mirkoarrays (in the form of transfer memories), which leads to a drastic cost savings and also allows the generation of microarrays, as they do not with previous methods can be produced, or would be realized only with high time, cost and effort, which is not profitable.
  • analyzes become possible which can not be realized in the prior art.
  • the transfer memory be created by a DNA-to-RNA copy.
  • the DNA-to-RNA copy in a preferred embodiment corresponds to a
  • the original DNA is amplified directly into RNA by means of an RNA polymerase.
  • the resulting amplicons can then be bound directly to the copy.
  • the DNA to RNA copy may take place as a combination copy.
  • the DNA of the original is first amplified as DNA by means of a DNA polymerase and then in a solid phase reaction, the DNA again by means of an RNA polymerase to
  • the transfer memory be created by a DNA-to-protein copy.
  • the DNA-to-protein copy in a preferred embodiment corresponds to a
  • RNA is prepared from the DNA of the original by means of an RNA polymerase, which is then added to the
  • Copy surface is tied.
  • the copy may remain until an enzyme mixture is added, which uses the RNA as a template and then generates a corresponding protein, which precipitates in the direct environment of the RNA.
  • the transfer store be formed by an RNA-to-protein copy.
  • the RNA-to-protein copy corresponds in a preferred embodiment to a
  • RNA to DNA copy corresponds in a preferred embodiment to a
  • the DNA can optionally be transferred directly to the copy or additionally amplified by means of a DNA polymerase and then transferred first.
  • the RNA as well as the resulting DNA can be analyzed.
  • the transfer memory is created by an RNA-to-RNA copy.
  • the RNA-to-RNA copy in a preferred embodiment corresponds to a
  • RNA since the RNA is derivatized by reverse transcriptase to DNA. Then the DNA can then be amplified again into RNA by means of an RNA polymerase, or first amplified by means of a DNA polymerase in DNA, which is then amplified by an RNA polymerase in RNA. The RNA is then transferred to the copy.
  • the first memory can already be analyzed before copying.
  • Transfer memory and first memory can be analyzed during the copying process.
  • Transfer memory and first memory can be analyzed after the copying process.
  • the analysis depends very much on the purpose of the application.
  • Conventional analytical methods of the prior art can be used. Preference is given to established methods such as fluorescence, luminescence, label-free detection, generation of dyes which can be detected optically, or redox-reactive species which can be detected electronically. Due to the spatial assignability of the copies and the original, this assignment of all analyzes can also be achieved, so that each molecule, its derivatives and amplificates, the respective structure and properties of the analysis of the copies and the original can be assigned.
  • each method of the invention preferably requires the following 4 components ⁇
  • Various specifically selected sample molecules are used as a source for generating the first memory, also called original
  • the method of the invention is used for random library or pool copy.
  • This is any collection (a pool) of molecules that either belong to the group of DNA or RNA, or carry RNA or DNA, and are of either artificial or natural origin or have been generated by a selection or mutation process. These molecules can also be derived from chemical libraries or display pools. A targeted selection of these sample molecules can be introduced and copied in any method described.
  • a copy can be made in the form of DNA, RNA or protein. After that, each of the copies be used to selectively investigate a binding, an interaction, an enzymatic activity or a change of one of the mentioned properties.
  • a display copy is preferred.
  • an enrichment is initially made with respect to a molecular target (binding partner, substrate, antibody, antigen, etc.).
  • This step corresponds to the state of the art in the respective display method.
  • the generated pool can be completely converted into an original according to the methods described, and this original can then be copied several times in the form of DNA, RNA or protein, thus enriching the molecules that were enriched in the first step of the display represent full number as a microarray.
  • these copied microarrays can then take place again a measurement against the target. This then allows, compared to conventional displays, a significantly higher throughput of investigated molecules and above all covers the entire pool. If necessary, an enrichment can be carried out again.
  • ribosome copy is preferred.
  • This application (see also Fig. 13) is derived from the ribosome display.
  • a bond is first generated against the desired target and the binder is enriched.
  • the enriched binders are then converted to an original by one of the methods described.
  • the preferred embodiment here is the molecule storage, so that initially in each storage position exactly one ribosome is attached to the attached RNA strand or only the RNA strand or the DNA or cDNA strand derived therefrom.
  • an amplification is then carried out so that the memory is preferably occupied by DNA. This ensures that the original is long-term stable, and the degradation of individual strands does not entail any loss of molecular information. After that, that can
  • Original optionally be copied into DNA, RNA or protein arrays.
  • a protein copy is generated, which is then examined again against binding to the target.
  • the original or a DNA copy is sequenced so that each binding on the protein copy can be uniquely assigned a DNA sequence.
  • the method in the phage copy This application (see also Figure 14) is derived from the phage display. Analogous to the ribosome copy, the phage pool is enriched once against the desired target and the phages are then directly transferred to an original. Thereafter, the steps are carried out as in the ribosomal Copy. Preferably, an amplification is then carried out so that the memory is preferably occupied by DNA.
  • the original can optionally be copied into DNA, RNA or protein arrays.
  • a protein copy is generated, which is then examined again against binding to the target.
  • the original or a DNA copy is sequenced so that each binding on the protein copy can be uniquely assigned a DNA sequence.
  • the phage or ribosomes carry not simple proteins but antibodies or parts of antibodies or artificial antibody-like constructs such as e.g. ScFv (single chain antibodies). These are handled as in phage copy.
  • the generated protein arrays then carry antibodies, antibody parts or ScFv and thus represent binders against a target. This method can be used to optimize antibody binding.
  • a population copy is preferred.
  • a population of organisms cell, virus, bacterium
  • macromolecules vector, plasmid
  • each memory cell contains at least one molecule that has an origin
  • copies in the form of DNA, RNA or protein can be generated and sequencing of the original or a DNA copy performed.
  • the initial pool of sample molecules is examined for the number and type of mutations contained in one or more genes •
  • the initial pool of sample molecules contains B or T cells and the variations and combinations of the light and heavy chains of B and T cell receptors are investigated
  • the initial pool of sample molecules contains polyploid organisms and the genetic variance of one or more gene segments is investigated
  • the initial pool of sample molecules contains interaction partners (each provided with a DNA tag) and from the joint analysis of two DNA sequences it is possible to deduce the molecular structure of the binding partners (eg the mixture of two antibody and antigenic ribosome displays described above). displays)
  • the initial pool of sample molecules contains a type of organism and the
  • the initial pool of sample molecules contains a type of organism and the analysis provides information about the enzymatic or binding properties of one or more RNA or DNA segments.
  • genomic DNA is recovered, fragmented and then introduced into the original. This is also preferably done in the molecule memory.
  • upstream amplification e.g. an emulsion PCR, which amplifies the DNA on particles
  • a particle storage is used.
  • the original DNA is then used to generate DNA copies.
  • the resulting array thus represents a genome array of the filled organism. Such arrays are not directly from the
  • the transcriptome copy is also preferred. From one or more organisms, the RNA, preferably mRNA, recovered and then introduced into the original. This is also preferably done in the molecule memory. In the case of an upstream amplification, for example an emulsion PCR, which first converts the RNA into cDNA and then amplifies it onto particles, a particle store is used. The RNA is preferably first stored in cDNA in the original. This has a much higher stability than the RNA. Thereafter, copies are made in the form of RNA or cDNA. Set the resulting arrays thus transcriptome arrays of the filled organism dar. Such arrays are not yet to produce directly from the original organism.
  • the generated cDNA arrays allow an application in the field of expression analysis, whereas the generated RNA arrays for binding analyzes of promoters or transcription factors.
  • the proteome copy is also preferred. From one or more organisms here the RNA, preferably mRNA, or the DNA is recovered and then introduced into the original.
  • the molecules stored there then preferably consist of DNA or RNA derived from cDNA.
  • the preferred embodiment is a molecule store.
  • an upstream amplification for example an emulsion PCR, which initially converts the RNA into cDNA or leaves DNA as such, and then amplified on particles, a
  • Particle storage used. Thereafter, copies are made in the form of protein, which are then assayed for activity in the form of binding, interaction or enzymatic reactivity. Furthermore, this array represents the proteome of the introduced organisms, if mRNA was used. If DNA was used directly, the copy copies more proteins than are contained in the proto-mouse. A complete proteome array has not been readily manufacturable so far. For example, Invitrogen's ProtoArray 5.0 covers only 9,000 human proteins with more than 100,000 proteins.
  • the protein copy is also preferred. From a pool of sample molecules, DNA encoding the protein or mutations of the protein is introduced into the original. The molecules stored there then preferably consist of DNA. The preferred
  • Embodiment is the molecule memory. In case of an upstream
  • Amplification e.g. an emulsion PCR, which then amplifies the DNA on particles, a particle storage is used. Thereafter, copies are made in the form of protein, which are then assayed for activity in the form of binding, interaction or enzymatic reactivity.
  • the generated array represents a general amino acid "scan" of the original protein.
  • scanning is preferably understood to mean the systematic variation of individual molecular building blocks.
  • Proteins and peptides is used, one amino acid is selectively replaced in each case against the most inactive alanine and tested the resulting product. If a biochemically important amino acid has been replaced, the biomolecule shows markedly reduced activity. By means of the scan, important and unimportant positions for the activity or
  • Properties of a molecule can be determined or estimated. It can e.g. No statement is made as to whether, instead of alanine, another amino acid has a higher activity or improved property than the original molecule.
  • the preferred application in the field of combinatorial chemistry copy represents a very special combination (see also FIG. 15).
  • the information molecule is constructed in the form of DNA or RNA, whereby the sequence of the DNA or RNA clearly correlates with the built-up molecule, and after the production of this combinatorial library, the particles are subjected to an enrichment against a target, ie a pool of particles remains
  • These selected particles are then preferably introduced into a particle store or particle transfer store as original and optionally the DNA or the molecules can optionally be transferred into the particle transfer store
  • the DNA can be amplified for this purpose.
  • the molecules are released from the particle in the usual case.
  • a particle carries significantly more molecules than necessary to produce a copy, so that multiple copies of the
  • Molecules can be generated.
  • the molecular microarrays On the basis of the molecular microarrays, the
  • Binding against the target or the target similar structures are validated, whereas the DNA copy is used to decode the sequence. Due to the
  • sample molecules are bound to a particle.
  • the surface of the first memory and / or the transfer memory is structured. It is preferred that the sample molecules and / or product molecules are selected from the group comprising proteins, enzymes, aptamers, antibodies or parts thereof, receptors or parts thereof, ligands or parts thereof, nucleic acids, nucleic acid-like derivatives, Transcription factors and / or parts thereof, molecules produced by combinatorial chemistry.
  • reaction step is carried out by means of DNA polymerase, RNA polymerase and / or a cell-free reaction mixture. It is preferred that the structuring of the surfaces is selected from the group comprising cavities, elevations, cavities containing particles and / or elevations comprising the particles.
  • the cavities have approximately the size of a biological cell. Particularly preferred are cavities with a diameter of 5 to 250 ⁇ , most preferably 10 to 50 ⁇ . It has been shown that the reaction step proceeds particularly well in cavities of this size. Surprisingly, the smaller the cavities, the better the yield.
  • the first memory in different areas
  • Wettability differences in electrical charge, differences in electrical, magnetic and / or dielectric properties, differences in osmotic pressures, different additives, different biochemical ingredients. It is preferred that during the reaction step at least one kind of
  • Sample molecules are released from the particles and / or the surface
  • the analysis step e) comprises a label-free method, preferably RIfS detection, iRiFS detection, biacore detection, surface plasome resonance detection, ellipsometry, mass spectroscopy, mass gain detection, refractive index change detection , Detection of the change of optical, magnetic, electrical and / or electromagnetic properties.
  • a label-free method preferably RIfS detection, iRiFS detection, biacore detection, surface plasome resonance detection, ellipsometry, mass spectroscopy, mass gain detection, refractive index change detection , Detection of the change of optical, magnetic, electrical and / or electromagnetic properties.
  • the analysis step e) comprises a method which uses a label, preferably fluorescence measurement, detection via an absorbing and / or scattering dye, mass spectroscopy via the detection of an isotope label, Detection via a molecule which alters the refractive index and / or the optical properties of the surface and / or the solution.
  • a label preferably fluorescence measurement, detection via an absorbing and / or scattering dye, mass spectroscopy via the detection of an isotope label, Detection via a molecule which alters the refractive index and / or the optical properties of the surface and / or the solution.
  • the analysis step e) comprises a method that analyzes the solution above the surface of the first memory and / or one of the transfer memory, preferably turbidity measurement, fluorescence measurement, detection of an absorbent
  • the invention relates to a use of one of the methods mentioned, in a screening method for the identification of
  • Total Genome Interaction Screening allows the identification of interactions at the genome level, producing a genome copy of an organism, and now that all the DNA of this organism is displayed, any interaction partners or molecules can be placed on this first reservoir as sample molecules.
  • DNA is added to a closely related organism or mutant.
  • RNA or cDNA of the same organism is added.
  • the intensity of each spot indicates that it is a gene and how much it is expressed.
  • ⁇ Mix cDNA of Reference 1 with a fluorescent dye 1 and a treated sample with a fluorescent dye 2 and then place on the array.
  • Proteins are added to the array. If an interaction or a binding takes place, then this can be assigned to the DNA sequence. This protein can be identified as a DNA binder. Also, use for genome-level transcription factor screening is preferred. This method allows the identification of transcriptional factors at the level of the complete genome. An overall genome array is given a transcription factor. By binding to individual spots, the sequence dependence of the transcription factor can be determined. In addition, additional parameters such as
  • Transcription factor to determine a genome-wide profile of its interactions.
  • Transcription factors are closed. Sequences can be identified that are addressed by only one, none or both transcription factors. Also, a variation of temperature, pH, salinity, etc. is possible, so that specifically a transcription factor can be enhanced or attenuated.
  • Transcription factor a mutation is known. Then the wild type and the mutation with different labein are also used on the array. Out
  • genome-level amplification screening is preferred.
  • This method allows a deeper understanding of amplification systems for DNA and RNA.
  • An entire genome array is given individual molecules or molecular complexes of amplification systems (e.g., DNA amplification such as DNA polymerase, gyrase, helicase, or RNA amplification). These molecules then preferentially bind to the positions necessary in the amplification.
  • DNA amplification such as DNA polymerase, gyrase, helicase, or RNA amplification.
  • These molecules then preferentially bind to the positions necessary in the amplification.
  • TATAA box for RNA polymerase or replication forks for DNA polymerase are, for example, the TATAA box for RNA polymerase or replication forks for DNA polymerase as well
  • genome-level antibiotic screening is preferred.
  • This is a special form of amplification screening designed to identify new antibiotics and more accurately characterize previously known ones.
  • the identified antibiotics serve as DNA or RNA amplification inhibitors and are therefore classified as bacteriostats.
  • a human genome or a bacterial genome is generated in the form of DNA.
  • the DNA is preferably very long, or at its ends so connected that a "Unroll" of the DNA is only possible with difficulty.A lot of DNA copies are produced.Each DNA copy is now mixed with another antibiotic, which is the assembly of the DNA or RNA amplification complex or binding of a cofactor for the DNA or RNA polymerase inhibited or restricted.
  • nalidixic acid and ciprofloxacin against topoisomerase II becomes the bacterial
  • Topoisomerase labeled with one color and the human counterpart with another are mixed, mixed with the antibiotic and added to the array. From color differences one recognizes immediately, where the bacterial and where the human amplification is limited. On the basis of the sequences can be concluded on the disturbance of the amplification or the subsequent expression of the proteins. Thus, various antibiotics can be coordinated with each other in order to minimize as much as possible the humane system and maximally the bacterial system.
  • Subunit then no longer binds to the DNA.
  • RNA-level splicosome screening allows the identification of splice variants.
  • An entire genome array is mapped as RNA.
  • This RNA corresponds to the pre-mRNA.
  • individual components or complete splicosome complexes will be added to the RNA copy.
  • single sequences can be identified which are recognized by the splicosome.
  • assign each genome-wide interaction to each splicosome. If a DNA copy is made of the RNA copy after treatment with the splicosomes, further sequencing is also possible. Knowing the original DNA and DNA after treatment with the splicosome provides deeper knowledge of sequence dependency and splice variants. Furthermore, it is possible by targeted mutations or addition of cofactors certain
  • Splice variants to be preferred This realization can then be e.g. used in the cultivation of organisms or the differentiation of stem cells targeted to realize or favor preferred splice variants. ⁇
  • total transcriptome interaction screening allows the identification of transcriptional interactions, produces a transcriptome copy of an organism, and produces copies in the form of DNA, cDNA, and RNA Since all cDNA as well as RNA of this organism is shown, any interaction partners or molecules can now be added to this array.
  • cDNA and DNA / RNA copy Add DNA from a closely related organism or mutant. Areas with binding, indicate identical DNA, areas without binding indicate clear differences between these species. These differences can then be used as markers for species discrimination. In addition, it is known that these species possess identical or related genes.
  • cDNA and DNA / RNA copy RNA or cDNA of the same organism is added. The intensity of each spot indicates that it is a gene and how much it is expressed.
  • cDNA and DNA / RNA copy It becomes RNA or cDNA of another organism added. Bindings indicate related genes and thus proteins, spots without bonds mean that the other organism does not have the corresponding genes, or these are currently inactivated.
  • DNA / RNA copy cDNA of a reference in with a fluorescence color 1 and a treated sample with a fluorescence color 2 is mixed and then transferred to the array. Based on the staining can be determined which gene was how strong activated.
  • DNA copy proteins are added to the array. If an interaction or a binding takes place, then this can be assigned to the DNA sequence. Thus, protein can be identified as a DNA binder and is potentially involved as an interaction partner in a form of signaling by interacting with it
  • RNA copy proteins are added to the array. If interactions
  • RNA-interacting proteins These are RNA-interacting proteins. These proteins may e.g. Memory for RNA, which is initially attached and released when needed or take a control role in the signaling.
  • RNA copy siRNA is added to the array. Interacting points point to siRNA-based regulatory mechanisms. By adding single siRNAs or a 2-color-labeled sample of siRNA from stimulated cells (color 1) and unstimulated cells (color 2) can be seen by the differences
  • total proteome interaction screening This method allows for the identification of proteome-level interactions, producing a proteome copy of an organism, and, if mRNA was used to generate the original, the protein copy reflects that If the DNA was used to make the original, more proteins are displayed than are present in the proteome, since all the proteins of this organism are now displayed Now, any interaction partners or molecules can be added to this array.
  • the following applications are preferred:
  • histones for example, histones, transcription factors or DNA-repairing proteins, etc.
  • DNA, RNA or the protein of the organism in one color and the DNA, RNA or protein of another organism or a mutant of this organism of a different color are added. Based on the color pattern can be
  • the use of the method for drug screening by adding the drug is preferred.
  • This method allows the identification of drugs by binding.
  • genome, transcriptome and proteome copies are generated in the form of DNA, RNA and protein microarrays.
  • a new or already known drug is now added to these arrays. Spots to which this drug binds, are potential interaction partners of this drug.
  • a measuring method which includes a kinetics measurement e.g. iRIfS or Biacore can also be concluded on the binding strength.
  • Promoter screening This application is unique. So far, only statements are possible in the prior art as to whether a promoter is strong or weak. A true quantification is now possible for the first time by the invention.
  • This method allows to study the effect of the promoter sequence on the amount of protein produced.
  • a DNA pool is created. Each DNA contains a promoter sequence and also encodes a protein.
  • there is variability in the promoter sequence This variability may correspond to the natural promoters of one or more organisms, be artificial or randomized. All DNA strands carry identical sequences with respect to the encoded protein, i. When creating a protein copy of each sequence, the identical protein is formed.
  • the rate of protein production depends solely on the rate of initiation of the RNA polymerase and not on the ribosomes.
  • This can preferably be carried out as a molecular store which is designed as a sequencing chip or as a classical DNA microarray.
  • a protein copy is now initiated and the amount of resulting proteins analyzed directly in real time (e.g., by iRIfS or Biacore). From these
  • Real-time data can now be deduced how fast the individual promoters allow a start of the RNA polymerase.
  • Induction rate can be determined depending on the promoter sequence.
  • a sequencing chip is preferably a surface with which sequencing is performed. Particularly preferred is the use of the FLX 454 chip from Roche, since it already has avticianen due to its structure, which are advantageous for the copying technique.
  • a DNA pool is used which differs not in the region of the protein-encoding DNA, but in the region of the promoter and the region in which transcription factors can bind. That it always produces the identical protein. Since the protein coding sequence is identical, this means that the
  • the rate of protein production depends solely on the rate of initiation of the RNA polymerase and not on the ribosomes.
  • an original is created in the form of a DNA array. This can preferably be carried out as a molecular store which is designed as a sequencing chip or as a classical DNA microarray.
  • a protein copy is now initiated and the amount of resulting proteins analyzed directly in real-time (e.g., by iRIfS or Biacore). From this real-time data, it is possible to deduce how fast the individual promoters allow a start of the RNA polymerase.
  • transcription factors from other species it is also possible to use transcription factors from other species to study the interspecies compatibility of individual biochemical mechanisms in vitro. This is particularly of interest for the generation of cell-free mixing systems, which in turn are used for cell-free production of proteins from DNA (including for the production of protein copy).
  • the use according to the invention serves to optimize a DNA sequence for improved biosynthesis. Analogous to promoter screening and transcription factor efficiency screening, a DNA pool is constructed in which each DNA strand carries an identical promoter sequence. The differences between the DNA strands exist in the protein coding sequence. Although they encode the same amino acid sequence, they differed in the codons.
  • an original is created in the form of a DNA array. This can preferably be carried out as a molecular store which is designed as a sequencing chip or as a classical DNA microarray.
  • a protein copy is now initiated and the amount of resulting proteins analyzed directly in real-time (e.g., by iRIfS or Biacore). From this real-time data can now be deduced which
  • Codon selection for a fast synthesis are optimal. These results are of particular interest when it comes to optimization of codon usage in the production of recombinant proteins in cells.
  • the method of the invention for global antibiotic screening by direct inhibition.
  • This method also serves to identify antibiotics. Instead of examining the assembly of the human and bacterial amplification complexes in the presence of the antibiotics as described in the described genome-level antibiotic screening, an original containing human and bacterial DNA (including binding sites for transcription factors and DNA) is used
  • Promoter sequences From this DNA original first identical DNA copies are produced. Then, cell-free expression systems (human and bacterial) are each spiked with an active agent and a protein copy of the DNA copy is generated. It is quantitatively analyzed how much of which protein is produced. If one of the active ingredients in any way interferes with the production of protein or the upstream amplification of RNA, this will be noticeable by reducing or missing the corresponding protein spot. Agents that inhibit or inhibit protein production dependent on sequence and / or expression system show up by absence or Weakening of individual spots or absence or weakening of the complete protein copy. Agents that inhibit the bacterial system and do not affect the human are thus potential antibiotics that directly inhibit protein production in bacteria. The active ingredients thus identified can then be detailed in one
  • the use of the method for global antibiotic screening by substrate inhibition also serves to identify antibiotics. Instead of studying the assembly of human and bacterial amplification complexes in the presence of antibiotics, as in genomic antibiotics screening, an original containing human and bacterial DNA (including binding sites for transcription factors and promoter sequences) is used. Now, optionally, DNA, RNA and protein copies are generated. For the generation of the respective copy, substituting molecules are "added" into the respective enzyme mixes for the original monomers, These substituents are then potentially incorporated in the DNA, RNA or proteins instead of the original monomers If one of the substituents used a
  • Inhibition intensified in the bacterial system occurs, they are potential antibiotics. Particular preference is furthermore given to the use of the method for the substituent
  • Binding partner encodes the corresponding molecular domains at the level of DNA and presented these DNA sequences in the form of a DNA array as the first memory.
  • a molecule store Preferably as a molecule store. Then copies of this original are made in the form of DNA, RNA or protein. In the corresponding enzyme systems are Monomers preferably fully substituted. This means that instead of the original monomer only the substitution is incorporated. Several copies are generated, each with different substituents. Thereafter, the receptor is placed on the individual copies and measured both the binding, as well as its activation. Spots that no longer have any binding have no effect. Spots with binding but no change in activity include a molecule that can be used as a surrogate. Spots with increased or decreased activity contain molecules that can be used as activators or inhibitors. The following applications of substitution are preferred:
  • growth factor-substituent screening Also preferred is use in growth factor-substituent screening. This method is a special case of substituent screening.
  • EGF and VEFG are usually highly active in the case of tumor cells.
  • the receptor may even be activated initially since another enzyme system deactivates a longer time active receptor. If, due to the retention of the binder in or on the receptor, no renewed activation takes place, it remains permanently deactivated. This means that the growth of the tumor slows down and in combination with a therapy the
  • Phosphorylation reaction can be detected.
  • radioactive ATP is added to the copy to which the receptor is already bound. Active receptors transpose this and bind the radioactivity itself.
  • Autoradiography application of a photo film, subsequent development and analysis of the blackening of the film
  • the corresponding artificial amino acid can be determined.
  • substituent has an activating or inhibiting effect and can potentially be used as a tumor drug or growth agent.
  • enzyme screening also showed particular advantages and is therefore preferred.
  • This application allows from a variety of enzymes to select those which have the most advantageous properties.
  • all suitable enzymes are encoded at the level of DNA and a DNA array, preferably as
  • Molecule memory produced as an original. This corresponds to a pool copy as described above. However, it is also possible to selectively cultivate cell cultures or microorganisms with a substrate, which must be reacted so that they survive. For this, one usually knows the original enzyme and imposes a combined mutation selection pressure on the organisms. The DNA sequence of the enzyme in question is thus changed by mutations. However, these mutations are usually only minor and the DNA remains accessible to a targeted PCR, so that a DNA original according to the Population copy of a population of organisms can be generated which have mutations in the protein / enzyme in question. By means of a protein copy, the enzymes are now generated as an array. By adding the desired substrate of the enzyme and under
  • the activity of each enzyme can be determined.
  • the method of the invention for stability screening.
  • This method is used for improved "durability" of molecules or higher resistance to external influences as well as decomposing environmental conditions as well as enzymatic activity.There are four strategies to follow: ⁇ The original molecule is systematically or randomly assigned to individual or
  • a chemical component of the monomers is altered to stabilize the entire molecule.
  • the original molecule is truncated or flanked with sequences
  • RNA or protein all three strategies can be used separately or together. If stability can be demonstrated by binding, a pool of up to 10 A 15 or more diverse molecules can be used to enrich for binding molecules. It can be assumed that more stable molecules can maintain their binding capacity for a longer time. The remaining pool should contain enough molecules to make a pool copy. This is first realized at the DNA level. Depending on the desired molecule then DNA, RNA or protein ⁇ copies are produced. These copies can then be exposed to different degradative influences such as high / low pH, harsh chemicals, high temperatures, enzymatic activities, etc. Each spot of the copied microarray is analyzed and its decomposition measured in real time. Stable molecules are characterized by a much slower decomposition.
  • DNase / RNase stabilization is also preferred. This method serves to increase the durability of DNA and RNA.
  • the following strategies can be used for this:
  • flanking sequences form secondary and tertiary structures that are no longer vulnerable to RNases and DNases.
  • Some of the natural monomers are selectively replaced by artificial monomers.
  • one of the four building blocks can be replaced by an artificial DNA or RNA base.
  • a chemical component of the monomers is altered to stabilize the entire molecule.
  • PNAs are very known.
  • the phosphate can be exchanged for an amino acid. This exchange protects against decomposition by racenes and DNases, but still allows full functionality. But other modifications of sugars, phosphates or bases are applicable.
  • the original DNA sequence or RNA sequence is provided with flanking sequences. These are generated systematically or by a random process. The resulting variants are generated as a pool copy in the form of a DNA array as an original. Then multiple copies are generated in the form of DNA or RNA microarrays.
  • RNA strands of low stability decompose, which in the case of incorporated fluorophores by a fluorescence decrease noticeable (in the case of a fluorophore-quencher pair by fluorescence increase).
  • the stability of the individual flanking sequences can be determined in a sequence-specific manner. If spots with the same sequence are compared with one another on different arrays, a statement can be made about the stabilizing effect of the individual monomers or chemical modifications. From the combination of sequence dependence, substitution of individual monomers and chemical modification, the most stable possible DNA or RNA strand can be derived.
  • Protein stabilization is also a preferred field of application. This method serves to increase the shelf life of proteins.
  • the following strategies can be used with preference:
  • flanking sequences form secondary and tertiary structures that are no longer vulnerable to proteases or cover areas of the protein that are otherwise vulnerable.
  • the original protein sequence is prepared in the form of coding DNA and provided with flanking sequences if necessary, or exchanged for single or multiple amino acids. These variations are generated systematically or by a random process.
  • the resulting variants are generated as a pool copy in the form of a DNA array as an original.
  • several copies are produced in the form of protein microarrays.
  • Artificial amino acids may be added as early as the production of the copies, or chemical modifications may be made after the copy has been produced.
  • a label can still be introduced which detects the integrity of the protein (for example, fluorophores or a fluorophore-quencher pair).
  • the stability of the individual flanking sequences or amino acid exchange positions can be determined in a sequence-specific manner. If spots with the same sequence are compared with one another on different arrays, a statement can be made about the stabilizing effect of the individual monomers or chemical modifications. From the combination of sequence dependence, substitution of individual amino acids and chemical modification, the most stable possible protein can be derived.
  • antibody stabilization is preferred. This method allows the stabilization of antibodies.
  • Antibodies are increasingly being used in the therapeutic and diagnostic fields. For this purpose, a long-term storage of advantage. Therefore, the original DNA sequence encoding the antibody will vary in positions that are not critical to the binding ability of the antibody to the antigen. The variations can be inserted deliberately or randomly. Thereafter, the DNA pool thus generated is generated as a DNA original. Of these then protein copies are made. These protein microarrays represent a mutation library of the original antibody. One of the copies is used for binding analysis to demonstrate that the mutations used have no influence on the binding capacity of the antibody. The copies are then stored and tested for binding at regular intervals, one set at a time.
  • the antibody array can also be exposed to various proteases to determine how stable which variant is against degradation by proteases. From the results, an optimized long-term stable antibody sequence can be deduced.
  • the use of the method for substrate screening is also particularly preferred.
  • it can be determined for a given enzyme which kind of substrate it can implement on the level of DNA, RNA or protein.
  • all known substrates are first coded at the DNA level and, in addition, mutations are introduced into these substrates.
  • the resulting DNA pool made as a DNA original.
  • copies are made in the form of DNA, RNA or protein arrays.
  • fluorophores can be incorporated randomly or terminally or a pair of fluorophore quencher pairs can be produced. This can be achieved, for example, by applying a fluorophore to the surface over the entire surface.
  • the generated molecules then carry the quencher terminally, as far as possible from the surface.
  • the enzyme can then be added to the generated copy.
  • a corresponding signal can be generated which detects the enzyme activity by changing the respective spot of the microarray.
  • a fluorophore or a quencher can be cleaved, in a redox reaction, a dye can be changed or in a ligation can
  • Fluorophore or a quencher inserted and thus the fluorescence can be changed. Spots that change are thus a substrate of the respective enzyme. Since the sequence can be determined by means of the original or a DNA copy, one can infer the respective DNA, RNA or protein sequence. Thus, the bandwidth of the substrates for an enzyme can be determined.
  • protease screening is also preferred. With this method can be found for different proteases, the corresponding proteins that are cut by them. In particular, the sequence dependence of flanking sequences can be determined. This can optionally be a DNA pool
  • Substrate-encoding DNA can be generated, or a total genome, a total transcriptome or a total proteome array can be used for this purpose.
  • an original is initially available at the DNA level. From this protein copies are then produced corresponding copies in the form of protein. The copy is then incubated with the protease. If a spot contains a protein that is decomposed by the protease, a signal is generated there. This can be done for example by increasing the fluorescence, when a quencher is cleaved off or by fluorescence decrease, when built-in or terminal fluorophores are cleaved, as the protein chain is broken down.
  • the use of the method for kinase substrate screening is preferred. This method can be used to make a substrate profile for kinases. especially the
  • Sequence dependence can be determined.
  • a DNA pool of protein-encoding DNA can be generated for this, or a whole genome, an overall transcriptome or an overall proteome array can be used for this purpose.
  • an original is initially available at the DNA level. From this protein copies are then produced corresponding copies in the form of protein. The copy is then spiked with kinase and in a preferred embodiment radioactively labeled ATP. In other preferred embodiments, other signal generations are conceivable (for example, by fluorescence labeling, or electrical detection of the pH change during phosphorylation). If a spot serves as a substrate of the kinase used, the radioactive phosphate is bound directly to the protein. Autoradiography can then be used to quantify the radioactivity in each spot.
  • Particularly well accepted substrates of the kinase have a particularly high radioactivity. Thus, for the pool of selected proteins or proteome-wide, all substrates of the kinase can be detected. If additional artificial amino acids were used in the production of the protein copies, a statement can also be made here about the acceptance of the kinase for such substrates. Thus, an assignment of protein sequence and kinase activity can be made for the kinase.
  • This method can be used to prepare a substrate profile for phosphatases.
  • the sequence dependence can be determined.
  • this method represents a reversal of kinase substrate screening.
  • a DNA pool of protein-encoding DNA is generated, or it can be a total genome, a total transcriptome or a total proteome array used for this purpose. In any case, it is first of all Level an original ago. From this protein copies are then produced corresponding copies in the form of protein. The copy is labeled in a preferred embodiment with radioactive phosphate. In another embodiment, other signal generations are conceivable (for example, by fluorescence labeling, or electrical detection of the pH change during dephosphorylation).
  • each spot carries an initially high level of radioactivity. If a spot serves as a substrate for the phosphatase used, the radioactive phosphate is split off from the protein. Autoradiography can then be used to quantify the radioactivity in each spot. Particularly well accepted substrates of phosphatase have a particularly low radioactivity. Thus, for the pool of selected proteins or proteome-wide, all substrates of the phosphatase can be detected. If additional artificial amino acids were used in the production of the protein copies, a statement can also be made here about the acceptance of the phosphatase for such substrates. Thus, an assignment of protein sequence and phasphatase activity can be made for the phosphatase. Also, restriction-substrate screening is a preferred application. This method can be used to screen over a genome where a restriction enzyme
  • isoenzyme differentiation If there are several isoenzymes of an enzyme, a differentiation of the substrate dependence can take place in that identical methods are described by means of the methods described for substrate screening, protease screening, kinase substrate screening, phosphatase substrate screening and / or restriction substrate screening Microarray copies are incubated with one of the isoenzymes and a substrate profile is created. A comparison of these profiles allows one another to find those spots that are particularly well implemented by one of the isoenzymes and particularly bad by another. This DNA sequence is then again selectively or randomly changed at individual positions. The resulting DNA pool is then in turn deposited as a DNA original and corresponding Made microarray copies. These are once again exposed individually to the isoenzymes.
  • the ribozyme copy method can be used. This method allows the detection of catalytic activities of RNA. Ribozymes have catalytic activity and possess properties such as enzymes, but consist of RNA. First, a DNA pool is generated which encodes potential ribozymes. This DNA pool is converted into a DNA original and then made RNA copies. Now each of these arrays can be given a substrate. Spots that show a catalytic activity towards the substrate generate a signal, which is due to the reaction of the substrate. This can e.g. the cleavage of a chemical group that changes the color of the molecule. Based on the sequencing of the DNA original or a DNA copy, the sequence of the RNA can be derived and from it also which sequence has which catalytic activity.
  • Display screening A particular advantage is that this screening can be used as a "final stage" for all standard displays, which is an extension of the throughput of analyzed molecules for any display, selection or enrichment methodology for DNA, RNA or proteins , which usually starts with a pool of molecules containing 10 ⁇ 9 and more diverse molecules, can generate an enriched pool of 10 ⁇ 6 or fewer molecules containing the desired properties, turning this pool of molecules with enriched properties into a DNA Transformed into RNA (reverse transcriptase RNA to DNA, proteins of a display are always associated with the genomic DNA, this can be arranged by PCR to a DNA pool). Pool is then generated as a pool copy according to or display copy and / or its subvariants as a DNA original.
  • DNA original corresponding copies are then produced in the form of the required molecules.
  • These can be DNA, RNA or protein.
  • Each copy can then be examined for another molecular property. From the assignment of each point of each copy to the original DNA sequence, the respective set of properties can be assigned for each individual of the DNA pool or the originally enriched pool. From this amount, the molecule can be determined which has the best combination of desired properties. Since many diverse properties can be detected by means of the copies and since one copy carries many individual individual molecules, this method will generate a significantly higher turnover of investigated molecules than is possible with previous methods.
  • This method facilitates the display screening of antibody libraries, especially the phage display with antibodies. From a phage display library with artificial randomized antibodies or antibody fragments, an enrichment of the phage against the antigen is first made, so that of the initially often up to 10 A 15 different antibodies only less than 10 A 6
  • Enriched DNA pool creates a DNA original.
  • the DNA original is then displayed in the form of DNA, RNA or protein copies.
  • transfection methods it is now possible to transfect the DNA or RNA into cells and thus to
  • the protein copy containing the antibodies can be tested for binding to the antigen. Spots that show a particularly strong signal have a particularly strong binding to the antigen. Due to the sequencing of the DNA original or a DNA copy, the amino acid sequence of the antibody can be deduced. If DNA or RNA was recovered, it can be used directly for transfection. Thus, it is then possible to directly generate the identified, well-binding antibodies back into cells. This method makes it possible, as with all display methods, to improve the throughput of the analyzed molecules. In this case, it is antibodies.
  • only a single enrichment against the antigen must be made, instead of the usual 3 to 4 rounds a phage displays.
  • Organisms can be used to identify specific antibodies against antigens using this method. From an organism exposed to an antigen, B cells are recovered. Each B cell carries a different antibody encoded in it. For this it is necessary to connect the variable sequence part of the mRNA of the light chain and the heavy chain of each cell. The B cell population can be generated directly as a population copy as a DNA original. The DNA is then the cDNA derived from the mRNA of the antibody. However, it is also conceivable that the cells are first physically separated and worked up, e.g.
  • the mRNA is transcribed into cDNA and then each of the light and heavy chain cDNA is linked together to form a DNA strand.
  • the DNA pool thus generated can then be converted into a DNA original.
  • either the light and heavy chains are present in full length (design 1) or the construct produced corresponds to a ScFv (design 2) in which the light and heavy chain variable regions are interconnected via a short spacer , In both cases, the DNA original or a DNA copy is sequenced and protein copies made.
  • the generated protein arrays contain the
  • Antibodies to this antigen will then bind to the antigen.
  • the particular sequence of the binding antibodies can be identified for this antigen and even a ScFv library can be obtained.
  • Antigens are incubated and checked whether there are other binding activities.
  • a lysate can be applied to the infecting antigen or organism
  • Antibody arrays are brought and thus all antibodies are determined against the antigen. This method is particularly advantageous because it systematically allows a variety of
  • a DNA pool is generated which contains mutations or exchanges at specific or random positions.
  • This DNA pool can then be enriched according to a display method with regard to the desired properties of the antibody (higher solubility, better stability with changed pH or salinity, etc.) and is then processed into a DNA original, which in turn is purified by means of the protein Copy into antibody arrays.
  • the antibody arrays thus produced are then incubated with the antigen under the desired conditions (concentrated solution, veined pH or salinity, etc.) and detected. The spot with the strongest
  • Binding represents the antibody with the best desired property. Based on the sequencing can be the DNA sequence and thus the amino acid sequence of the
  • Decode antibody With this method it is then possible to compare a large number of antibodies directly with each other and thus to select the best from a large selection. Previous display methods are particularly limited in the number of characterized antibodies, which often means that the best antibody is not detected. Higher throughput significantly improves your chances of capturing the best antibody. This method allows the optimization of antibodies, antibody components or artificial antibodies.
  • ScFv antibody optimization method
  • This method can be used to optimize an existing ScFv (single chain antibody) with respect to its connection chain.
  • ScFv single chain antibody
  • only the two variable binding regions of an antibody are present, which are connected to one another via a very short connection chain. Without this linking chain, the affinity of the short variable chains is too low, which simply breaks up the complex.
  • the connection chain thus serves to
  • the DNA pool can be enriched by means of a display method, so that as possible affine ScFv are encoded, or used directly.
  • a DNA original is created and used to make protein copies.
  • the ScFv arrays thus obtained then contain all the mutations.
  • the antigen is then added to these arrays and the binding measured. Spots with a particularly high binding are particularly sensitive to the antigen. Due to the
  • Similarity comparisons allow us to derive a systematics that associates the respective sequence with an affinity.
  • This scheme can be used for predicting binding affinities of ScFv against other antigens.
  • the method allows an optimization of the connection chain by examining a variety of variants and a systematics derived.
  • the method of the invention for epitope screening for vaccine development.
  • the method can be used to recover all peptide vaccines. This makes it possible for the first time
  • epitopes can be derived on the level of DNA, RNA or proteins, which served as immunogens and are therefore suitable for use as vaccines.
  • an organism is needed, which has an immune system. This organism is exposed to a parasite, bacterium, virus (immunogen). In case the organism survives, are
  • Organism is now a tissue sample and a blood sample won. From the blood sample, the antibodies and B cells are purified. The tissue sample is in a
  • Tissue sample is then harvested and used to make a total genome, total transcriptome and total proteome.
  • the arrays also contain the molecules formed by infection.
  • the purified antibodies are then added to these infection arrays. If, at the level of DNA, RNA or protein, immunogens are present, the antibodies will bind to them. Thus, every spot to which the antibodies bind constitutes a potential epitope of one
  • Immunogens By sequencing the DNA original, the DNA, RNA or protein sequence of the immunogen can be elucidated. In addition, it is possible to selectively release the identified immunogens or their DNA from the DNA original or one of the copies. From this, the immunogens can then be purified or generated. These immunogens can then be added to the resulting B cells. B cells that use the Immunogen bind, become activated and begin to divide. Thus, a cell culture can be created which specifically produces the antibodies that repel the immunogen. Thus, for a vaccine development, both the immunogen itself for active immunization, as well as appropriate antibodies for passive immunization, are available. This combination is unique and allows vaccine development within a week.
  • epitope screening for autoimmune detection. With this method, it can be clarified whether there are epitopes at the level of DNA, RNA or proteins, which trigger an autoimmune response.
  • the procedure is largely similar to epitope screening for vaccines.
  • the organism which has an immune system is the organism to be examined itself, which suffers from an autoimmune reaction. In any case, the organism has appropriate antibodies in its bloodstream, which were generated by an immune defense and induce the organism to autoimmunity. From this organism now a tissue sample and a blood sample are obtained. From the blood sample, the antibodies and B cells are purified. The tissue sample is in a
  • Immuno genes from the copies can be tested as to whether the B cells can be activated and thus an autoimmunity against these autoimmunogens is present. Provided that these auto-immunogens are identified, appropriate therapy can be developed so that the autoimmunity is attenuated, slowed, or even abolished. However, this method only serves to identify the auto-immunogens and not to
  • the procedure is largely similar to epitope screening for vaccines.
  • the organism which has an immune system is the organism to be examined itself, suffering from an allergy. In any case, the organism has appropriate antibodies in his bloodstream, which were generated by means of an immune defense and now make the organism reactive against the allergen. From this organism a blood sample is obtained. From the blood sample, the antibodies and B cells are purified. Furthermore, a DNA pool is generated which encodes known epitopes at the level of DNA, RNA or protein. This pool is used to create a DNA original and copies of it are made in the form of DNA, RNA and protein. Since the pool contains known allergens in coded form, the arrays consist of known allergens. The purified antibodies are then added to these allergen arrays. If, at the level of DNA, RNA or protein,
  • the antibodies will bind to them. Due to the position to which the antibodies can bind then a sequence and thus the triggering species of the allergy can be assigned. Then, to the B cells, both the allergens and the species itself can be added and tested to see if the B cells are responding to the presence of the species. Thus, it can be tested with this method with a very high number of molecular antigens, if there is an allergy and then again by means of the B cells is made a cross check. However, escape this method
  • the method for epitope screening for allergen elucidation it is also preferable to use the method for epitope screening for allergen elucidation. With this method, it can be clarified whether there are epitopes at the level of DNA, RNA or proteins that trigger an allergy.
  • the procedure is largely similar to epitope screening for vaccines. This requires an organism that has an immune system and is known to have developed an allergy to a particular species. The organism takes a blood sample and uses it to obtain antibodies and B-cells. Samples are taken from the species against which the allergy is present and used to generate total genome, total transcriptome and total proteome arrays. If allergens exist on the DNA, RNA or protein level, these are contained in the generated arrays. The purified antibodies are now added to the arrays. If an allergen is present, the antibodies bind to it.
  • the sequence of the allergen can be deduced. Recovered allergens are then added to the B cells. If the B cells show a reaction and thus confirm the allergen, this method can be used to identify unknown allergens at the level of DNA, RNA or proteins.
  • the method for binding optimization by means of displays.
  • This method allows the optimization and derivation of a system for Optimization of an interaction between a molecule and its binder.
  • a DNA, RNA or protein binder is known for a molecule, this can be varied in the form of a combinatorial DNA library.
  • This DNA pool can contain up to 10 ⁇ 15 different molecules and is therefore restricted to less than 10 A 6 binders with high affinity by a display method.
  • This DNA pool can then be used to generate a DNA original. Appropriate copies in the form of DNA, RNA or protein are then generated and the molecule placed on these arrays. Spot, which carry a particularly strong binder, will bind a lot of molecules and thus generate a very high signal. Since all spots of the array Binder mutants are contained, it can be expected that a very high number of binders will be detected. Based on the sequencing of the DNA original or a DNA copy can then be the
  • the method of binding optimization by scan allows the optimization and derivation of a system to optimize an interaction between a molecule and its binder.
  • a DNA, RNA or protein binder is known to be a molecule, it can be systematically or randomly varied in DNA in coding form in one or more positions at the DNA level. The number of different binder mutants is kept below 10 A 6, so that all generated mutants of the DNA pool can be transferred directly into a DNA original according to 2.2.1. The DNA original will then depending on the binder in
  • DNA, RNA or protein are copied and the resulting binding mutant arrays are then incubated with the molecule. It can be assumed that many bonds will take place.
  • the sequences of the respective spots are assigned to the affinities and derived therefrom a systematics. This procedure corresponds to the alanine scan for proteins, but in this case can be carried out with every possible replacement. Thus, a significantly larger number of mutations is covered and the derived system has thus a much higher significance.
  • a protein is known to have a function in the form of a bond or an activity, this is varied in the form of coding DNA. Variations are systematically or randomly inserted in one or more positions at the DNA level. The number of different mutations is kept below 10 A 6, so that all generated mutants of the DNA pool can be transferred directly into a DNA original. The DNA original is then copied to protein. The resulting protein mutations are then tested for binding or activity and characterized. It can be assumed that all mutants show a binding or activity, which, however, can vary greatly. The sequences of the respective spots are assigned to the respective activity of the mutant and derived from this a systematics. This procedure corresponds to the alanine scan for proteins, but in this case can be carried out with every possible replacement.
  • Reaction conditions and cofactors are adjusted. For this, the surface of a property store is completely coated with a single enzyme and then substrate added. Across the entire memory, the amount of substrate produced is analyzed for each position. Based on the position in the memory can then be the optimal
  • Reaction condition can be determined.
  • This system is preferably used for optimizing concentrations of substrate as well as known cofactors such as salts, substrate, pH and temperature.
  • a screening with unknown cofactors or mutations of the cofactors can take place.
  • a particle transfer memory is filled with particles, each containing a mutant of a co-factor.
  • These co-factors are generated as a combinatorial chemical library Service. It now generates a DNA copy, which allows a decryption of the molecular structure of the co-factor based on their sequence information. Then the reservoir is filled with the enzyme and substrate under optimized conditions. It will now measure which cofactor leads to an improved sales. Based on the sequencing then this cofactor can be determined.
  • This system therefore initially allows one
  • the reaction can be optimized again.
  • Interaction partner This method allows finding an active ingredient to a given molecule with which the drug is to interact.
  • particles of a chemical library are already provided in the synthesis with a molecular tag, which allows each particle after sequencing to assign the molecular structure of the synthesized thereon drug.
  • the particles are now transferred to a particle transfer storage and some copies are made. The generated
  • Microarrays carry either the active substances or the coding DNA or RNA.
  • a single binder is added to individual drug arrays and the interaction is measured. Spots with a particularly strong signal interact particularly strongly and thus potentially potent-acting agents. After identifying such a strong interaction, the drug is recovered or re-synthesized, and then the interaction with classical methods is validated. However, the interaction partner can also be previously with his natural
  • Interaction partners can now generate a signal. Thus, particularly potent drugs can be identified.
  • This method corresponds in principle to the already described discovery of active ingredients according to the drug screening by adding the interaction partner.
  • the active substance is already known here and a combinatorial chemical library is produced which has very similarities to the previously identified active substance.
  • the particles of the chemical library are provided according to 2.2.8 with a molecular tag, which allows each particle after sequencing to assign the molecular structure of the synthesized thereon drug.
  • the particles are now transferred to a particle transfer memory and some copies are made.
  • the generated microarrays carry either the active ingredients or the coding DNA or RNA. By means of sequencing, the DNA sequence is determined for each spot of the array and thus the molecular structure of the active ingredients is calculated.
  • a binding agent is added to the active agent array and the interaction is measured. Spots with a particularly strong signal interact particularly strongly and thus represent potent active ingredients. ⁇ However, the interaction partner can also interact with his natural
  • Interaction partners can now generate a signal. Thus, particularly potent drugs can be identified.
  • the method be used for viral attack screening.
  • the host, the DNA and mRNA are recovered to produce a total genome, total transcriptome, and a total proteome.
  • the DNA, RNA and protein are recovered.
  • the respective samples are marked with different colors, mixed and given in each case to the individual arrays. Since a parasite must somehow dominate the host molecule in some way, there must be spots where DNA, RNA, or protein bind better (high affinity) than is the case with the host itself. These are, so to speak, the molecular targets of the parasite. This is especially true if it is a virus. Corresponding spots at the level of DNA, RNA or protein arrays then show an increased coloration of the parasite.
  • Parasite-host interactions are the initial interactions that allow viruses, especially viruses, to take over a cell by invading it or by adopting or replacing molecular functions. If these target points are known exactly, one can look for these interactions for agents that prevent or at least interfere with the interaction between parasitic DNA, RNA or protein with the DNA, RNA or the proteins of the host. Such agents can then be used as "anti-parasitism.” In particular, for antiviral agents can thus be associated with the effectiveness of a molecular interaction by using this system, the interaction pairs for the first time genome, proteome and transcriptome-wide can be identified in one approach.
  • a screening method for the identification of antibiotics, inhibitors of antibiotics, antibody optimization, antibody stabilization, antibody isolation, epitopes for autoimmune diseases, epitopes for allergies, epitopes for allergens, epitopes for vaccines, drugs, interaction partners for Active ingredients, optimizations for active ingredients, growth factors, substituents for growth factors, optimization of growth factors and / or virus attack points takes place.
  • reaction step preferably the reaction step, application-oriented generation of the first memory and production of one or more similar or different copies and assignment of the analyzes of individual copies and / or the original allow a structural elucidation of original molecules as well as their derivatives and amplicons, as well as the assignment of their properties.
  • reaction step preferably the reaction step, application-oriented generation of the first memory and production of one or more similar or different copies and assignment of the analyzes of individual copies and / or the original allow a structural elucidation of original molecules as well as their derivatives and amplicons, as well as the assignment of their properties.
  • the invention has surprisingly provided a process which can be used for the analysis of molecular properties and / or reaction conditions
  • volumes of reaction solutions must be used. Thus, time and costs can be saved. It is also possible through the process, an automated process which additionally saves money and increases efficiency.
  • FIG. 1 shows a preferred embodiment of the invention.
  • the first memory 8 is then generated from this copy pool 7 (step 1)
  • the original is a spatially fixed arrangement of the molecules of the copy pool, each position on the original being uniquely associated with one or more
  • This original is "copied" in a suitable form (step 2). Different copies 9a, 9b, 9c, ... are possible.
  • both original and copy or the copying process itself can be analyzed (step 3).
  • FIG. 2 shows a particle store 10 a-d as the first store 8.
  • Particles 4 with molecules 11 are attached to the surface and remain there.
  • the particles can be deposited on a planar surface 10a, in a structure 10b, between structures 10c or on structures 10d.
  • FIG. 3 shows the schematic drawing of a particle transfer store. It is shown how particles 9 with molecules 11 are deposited on the surface and remain there. In this case, the particles can be deposited on a planar surface 12a, in a structure 12b, between structures 12c or on structures 12d. Then at least one sort of molecules is transferred to the surface of the reservoir by means of cleavage, amplification or derivatization.
  • Figure 4 shows the schematic drawing of a preferred molecular memory.
  • Molecules 11 are spent on the storage. This can be done by a dispensing process and thus lead to a spatial arrangement of the molecules 13a-c.
  • a Liquid contact or filling the molecules are placed on the surface 14a, in structures 14b or on structures 14c, especially when binding regions 17 of the surfaces are preferred binding sites for the molecules. In the preferred embodiment shown, one molecule is located on such a binding region 17.
  • the original molecule 11 can be multiplied spatially resolved, especially when the areas 17 of the surface for the amplification or
  • Derivatization are conducive or essential.
  • identical molecules 11 at 13a-c, 14a-c and 15a-c) or derivatives 18 at 16a-c are then anchored on the surface.
  • Each of these embodiments 13 to 16 can serve as a molecular store and release or generate molecules for the generation of a copy in a later amplification and / or derivatization reaction.
  • FIG. 5 shows a schematic drawing of the property memory.
  • Each location of the property store has different properties. These differences can be generated by geometry 19a & 19b, material choice 20, surface coating 21, integrated microfluidics 22 or microelectronics 23, by differences in the liquid that may arise through the filling process 24 itself or by additionally filled particles / molecules 25/26 the chemical or physical
  • FIG. 6 shows a schematic drawing of the transmission copy. From the original 8, molecules 11 are released and transferred to the copy surface 9. This reduces the number of molecules in the original.
  • FIG. 7 shows a schematic drawing of the amplification copy. Of the molecules 11 of the original, amplificates 20a are generated and then transferred to the copy.
  • FIG. 8 shows a schematic drawing of the derivatization copy. The molecules 11 of the original are derivatized 18 and then transferred to the copy surface 9.
  • Figure 9 is a schematic drawing of the self-generation copy.
  • the molecules 11 of the original exhibit reactivity under suitable conditions that can be used to generate amplified products 22b or derivatives 22c of added molecules 22a.
  • the generated molecules can then be transferred.
  • Figure 10a shows a schematic drawing of the combination copy (preserving the original first memory).
  • amplificates 20a are first generated, which are then optionally directly transmitted or derivatized 18 and then transmitted.
  • Figure 10b shows a schematic drawing of the combination copy (using up the original sample molecules). However, derivatives 18 may first be generated, which are then amplified 21b and transmitted.
  • Figure 11 shows a schematic drawing of the multi-molecule copy.
  • FIG. 12 shows the schematic sequence of the liquid copy.
  • FIG. 13 shows the schematic sequence of the ribsome copy.
  • the ribosome display is performed according to the prior art.
  • the RNA (30) is brought together with ribosomes 31, these produce the corresponding proteins 32.
  • the desired target 33 is added and the ribosomes are selected, whose attached protein has bound the target.
  • This selection allows an enrichment of ribosomes or RNA, which are coupled with an interacting protein.
  • This RNA 30a which encodes a binding protein, can then be introduced as an original, according to 2.1.1, so that an RNA original 34 or a DNA original 35 is generated.
  • a preferred embodiment is a DNA master in which the DNA is amplified 36. Microarray copies are made with which DNA; RNA and protein is generated. The DNA copy 37 or the original itself can be sequenced, giving the
  • FIG. 14 shows the schematic sequence of the phage copy.
  • the page display is performed according to the prior art.
  • the phages 40 carry proteins 41 which correlate with the DNA 42 in their interior.
  • targeted selection can enrich the phage 40a carrying a protein which binds to the target.
  • the DNA 42a encoding a binding protein may then be introduced into an original and will preferably consist of DNA 34 or amplified DNA 35. However, it is also an RNA original conceivable 36.
  • microarray copies in the form of DNA, RNA and protein.
  • the DNA copy 37 or the original itself can be sequenced to obtain the sequence information.
  • the RNA copy 38 can be used for a ribosome display and the protein copy 39 can be tested for binding to the target again to validate interaction with the target.
  • Figure 15 shows the synthesis and application of the combinatorial chemistry copy.
  • a DNA or optionally an RNA
  • Each particle 4 thus carries DNA 52 in addition to the molecules 11.
  • the synthetic strategy makes it possible to unambiguously deduce from the sequence of the DNA in which the "splits" of the particle were found a target 33 and particles with binding molecules 51a
  • binding particles 50a are inserted into an original.
  • this is a particle store 10a.
  • both DNA copies 37 and molecule copies can now be produced by derivatization 56 or amplification 57. Based on the DNA copy, the sequence and thus the chemical structure of the molecules are determined on the molecular copy. With the molecule copies can again a binding measurement against the target

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von molekularen Eigenschaften und/oder Reaktionsbedingungen, umfassend die Bereitstellung eines ersten Speichers, umfassend eine erste Oberfläche, wobei eine gezielte Auswahl von Probemolekülen an die Oberfläche in einer definierten Anordnung direkt oder indirekt gebunden wird, die Herstellung von mindestens zwei Transferspeicher, wobei mindestens zwei weitere Oberflächen bereitgestellt werden, einen Reaktionsschritt, ausgewählt aus der Gruppe Übertragungsreaktion, Amplifikationsreaktion und/oder Derivatisierungsreaktion, wodurch Produktmoleküle entstehen können und diese Produktmoleküle und/oder die Probemoleküle an die Oberflächen binden, wobei eine ein-eindeutige räumliche Zuordnung zwischen den Probemolekülen des ersten Speichers und den Produktmolekülen und/oder Probemolekülen der Transferspeicher besteht und die Analyse des ersten Speichers, der Transferspeicher, der Probemoleküle, der Produktmoleküle, der Übertragungsreaktion, Amplifikationsreaktion und/oder Derivatisierungsreaktion erfolgt.

Description

STAND DER TECHNIK
Die Optimierung biochemischer Prozesse, das Auffinden eines Moleküls mit gewünschten Eigenschaften oder die Ableitung eines modifizierten Moleküls mit verbesserten
Eigenschaften werden oft in einem als„Screening" bezeichneten Ansatz realisiert.
„Screening" bedeutet das sehr umfangreiche, mehr oder weniger systematische Austesten einer Vielzahl von Reaktionsbedingungen mit einer Vielzahl von Reaktanden und
Interaktionspartnern. Ebenso fällt die Verbesserung einer biochemischen Prozessführung, beispielsweise die Konzentration des Enzyms, des Substrates, die Auswahl von Cofaktoren, deren Konzentration, Einstellen des pH-Wertes etc. ebenfalls unter das„Screening". Die Optimierung von Moleküleigenschaften durch geringfügige Modifikation wird oft auch als „Scan" oder„Lead Optimisation" bezeichnet.
Nahezu sämtliche Screening- Verfahren starten mit einem umfangreichen Pool an
unterschiedlichen Molekülen. Diese Pools werden oft als„molekulare Bibliothek" bezeichnet und können bis zu 10A15 und mehr unterschiedliche Moleküle enthalten. Bei solch einer hohen Anzahl ist es verständlich, dass nicht jedes Molekül einzeln untersucht wird, sondern über der Pool mehr und mehr eingeschränkt wird, bis eine handhabbare Anzahl, meist einige Zehn bis Tausend, Moleküle verbleiben. Diese Kandidaten besitzen aufgrund der
vorangegangenen Selektion meist die gewünschten Eigenschaften. Dies kann nun in einzelnen Tests validiert und eine Rangliste erstellt werden, die angibt, wie gut die einzelnen Moleküle den gewünschten Eigenschaften entsprechen. Die am höchsten gelisteten Kandidaten werden dann detailliert untersucht und im Erfolgsfall weiter optimiert oder direkt verwendet.
Insgesamt sind die Screeningverfahren sehr zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Sie starten zwar mit bis zu 10Λ 15 Molekülen, aufgrund der umfangreichen Nachuntersuchungen der
Kandidaten, werden oft nur einige Dutzend bis Hundert ausgewählte Moleküle (meist die mit der höchsten Listung) final im Detail untersucht. Da viele der Selektionsmethoden einen Bias aufweisen, der neben der gewünschten molekularen Eigenschaft noch weitere andere
Nebeneigenschaften bevorzugt oder statistisch ausselektiert, kommt es vor, dass auch interessante Moleküle mit gewünschten Eigenschaften (aber ohne die Nebeneigenschaften), diesem Bias zum Opfer fallen und daher nicht mehr im finalen Pool enthalten sind.
Dieser Bias wird umso größer je öfter eine Selektion wiederholt wird, oder je stärker eine Selektionsbedingung gesetzt ist, da nun sowohl die Eigenschaft als auf die Neben-Eigenschaft für das Weiterkommen des Moleküls stärker ausschlaggebend ist. Eine Selektion mit einem schwachen Selektionsdruck wiederum, lässt sehr viele Moleküle weiter kommen, was wiederum bedingt, dass man mehr Kandidaten untersuchen muss.
Es wäre generell wünschenswert final mehr Kandidaten gleichzeitig und vor allem einfach untersuchen zu können, insbesondere, wenn durch eine schwache Selektion 10A4 bis 10A6 Moleküle im finalen Pool verbleiben. Sofern ein oder mehrere Moleküle mit den gewünschten Eigenschaften identifiziert wurden, kann die Molekülstruktur zufällig oder gezielt an einzelnen oder mehreren Positionen variiert werden. Diese neu erzeugte Mutations-Bibliothek wird dann nochmals nach dem Molekül mit der besten Übereinstimmung zu gewünschten Eigenschaften selektiert. Auch hier unterliegt man dem Bias der Selektion und der geringen Anzahl der final analysierten Kandidaten. Um hier ein besseres Verständnis für die Abhängigkeit von Eigenschaften von den
Änderungen am Molekül zu bekommen, werden oft sogenannte„Scans" durchgeführt. Hierbei wird stets eine Position des Moleküls gezielt verändert und die
Eigenschaftsänderungen vermessen. Dies findet insbesondere bei DNA, RNA und Proteinen Anwendung. Besonders bekannt ist bei Proteinen der sogenannte„Alanin-Scan". Hierbei wird jede Aminosäureposition des Proteins jeweils durch Alanin ersetzt. Findet an einer biochemisch wichtigen Stelle eine Substitution gegen ein meist unwirksames Alanin statt, so besitzt das Protein keine Aktivität mehr. So lassen sich insbesondere bei Enzymen wichtige Positionen feststellen. Allerdings gibt es neben Alanin noch 19 weitere natürliche
Aminosäuren. Sofern man zwei Aminosäure-Positionen verändern will, müssen bereits 400 unterschiedliche Proteine erzeugt werden, für eine Änderung in n Positionen erhält man für alle 20 Aminosäuren 20An unterschiedliche Varianten eines Proteins. Bereits bei 5
Aminosäurepositionen bedeutet dies 3,2 Millionen unterschiedlicher Proteine. Diese Zahl wiederum ist weder einzeln herstellbar, noch vermessbar. Daher begnügt man sich meist mit dem reinen Alanin-Scan, und versucht daraus eine optimierte Molekülsequenz und
Molekülstruktur abzuleiten.
Auch hier wäre es wünschenswert, final mehr Kandidaten gleichzeitig und einfach
untersuchen zu können. Insbesondere bei Mutations-Bibliotheken mit 10A4 bis 10A6
Mutanten ist es von hohem Interesse alle Mutanten zu analysieren, da dies dann zum einen den Alanin-Scan überflüssig macht und zum anderen einen umfassenden Datensatz liefert, da man alle möglichen Varianten untersucht hat. Dies würde eine breitere Anwendung einer nachfolgenden Simulation oder einer systematischen Analyse von Wirkgruppen erlauben.
Zusammenfassend lässt sich das Screening in drei große Bereiche aufteilen:
1. Die gezielte Optimierung eines biochemischen Prozesses oder einer molekularen
Interaktion, durch Anpassung von Umgebungsbedingung wie Salzgehalt, Temperatur, pH, Zusatzstoffe, Co-Enzyme etc..
2. Das Auffinden eines Moleküls mittels Selektion aus einer molekularen Bibliothek mit bis zu 10A15 Individuen aufgrund von gewünschten Eigenschaften, die durch die Selektion bevorzugt werden.
3. Das Optimieren eines Moleküls oder einer molekularen Grundstruktur mittels einer Selektion aus einer molekularen Bibliothek aufgrund von gewünschten Eigenschaften, die durch die Selektion bevorzugt werden, oder mittels einer systematischen
Untersuchung von Varianten der molekularen Grundstruktur (Scans). Screeningverfahren sind vor allem für die Pharmazie von extrem hohem Interesse, weshalb es in diesem Bereich eine Vielzahl von Techniken gibt, um eine möglichst hohe Anzahl von Molekülen herzustellen und zu untersuchen.
Im Stand der Technik lass sich drei Hauptstrategien unterscheiden. In der sogenannten Einzelherstellung wird jede Substanz jeweils einzeln hergestellt und vermessen. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass man von Beginn an weiß, um welches Molekül es sich handelt und die genaue Molekülstruktur bekannt ist. Der große Nachteil ist darin zu sehen, dass es technisch nahezu unmöglich und außerdem extrem teuer ist mehr als 10A6 verschiedene Moleküle zu erzeugen oder zu vermessen. In der sogenannten kombinatorischen beziehungsweise randomisierten Herstellung werden die Substanzen nicht einzeln, sondern in Gemischen hergestellt. Dies hat den Vorteil, dass so hochparallel Millionen von Substanzen hergestellt werden können. Ein Nachteil ist jedoch, dass eine Mischung der Moleküle erzeugt wird und somit unbekannt ist, welches der
Moleküle nun ein Signal erzeugt. Das heißt es muss nachträglich eine Strukturaufklärung des gefundenen Moleküls betrieben werden.
In der kombinatorische Herstellung und Vermehrung beziehungsweise Display-Methoden handelt es sich um eine spezielle biochemische Prozessführung. Zunächst wird mittels kombinatorischer Herstellung eine Substanzbibliothek auf Basis von DNA oder RNA aufgebaut. Diese DNA oder RNA wird dann in biologisch aktive„Komponenten" (z.B.
Phagen, E.coli, Hefezellen, Ribsomen und so weiter) verpackt beziehungsweise angelagert. , Durch Aktivierung eines Vermehrungsimpulses lassen sich dann diese Moleküle vermehren und somit amplifizieren. Die Amplifikation kann in biologisch natürlicher Weise, z.B.
Wachstum oder Infektion von Bakterien und Pilzen, oder durch artifizielle Systeme, z.B. DNA-Polymerase, RNA-Poylmerase, Enzymsysteme, erfolgen. Vorteil dieser
Substanzbibliotheken ist, dass sie einmalig herzustellen sind und dann„weitergezüchtet" werden können. Diese Verfahren sind aber zumeist auf DNA, RNA und Proteine limitiert, da synthetische Wirkstoffe einer Biosynthese nicht in diesem Maße zugänglich sind wie DNA, RNA oder Proteine.
Ist eine hohe Anzahl an Molekülen erwünscht, so besitzt die Synthese in Mikrotiterplatten oft nur eine geringe Kapazität und scheidet daher als Mittel der Wahl aus. Für die
Einzelherstellung von 10 und mehr Molekülen haben sich Mikroarrays bewährt. Hierbei ist es möglich mittels Drucktechniken oder Lithografie bis zu 10A6 unterschiedliche DNA- Stränge zu erzeugen. Somit stellen die Mikroarrays den Stand der Technik für die
Einzelherstellung von Molekülen dar. Allerdings besitzen diese Systeme nur eine begrenzte Synthese-Effizienz (für DNA -99% pro Base, für Proteine -96-98,5% pro Aminosäure), was dazu führt, dass bei langen oder komplexen Molekülen mit hohen Verunreinigungen zu rechnen ist beziehungsweise die maximale Länge der erzeugbaren Moleküle ist durch diese Verunreinigungen limitiert wird.
Für die kombinatorische Herstellung hat sich im Stand der Technik die kombinatorische Festphasensynthese bewährt. Hierbei werden die Moleküle auf Partikel gebunden. Der als „Split and mix" oder„Split and recombine" bezeichneten Prozess sorgt durch die
Reaktionsführung dafür, dass auf jedem Partikel genau eine einzige Molekülsorte aufgebaut wird. Ein Nachteil ist, dass das zufällige Spürten verhindert, dass mehr a priori festgestellt werden kann, auf welchem Partikel welche Substanz aufgebaut wurde.
Im Folgenden bedient man sich dann wahlweise dreier unterschiedlicher Strategien. In der ersten Strategie trennt man die Partikel voneinander und spaltet, jeweils separat, die Moleküle von dem Partikel ab. So erhält man eine Reinst-Lösung des Moleküls und kann dann in klassischer Weise z.B. einer Mikrotiterplatte Teile dieser Lösung untersuchen. Sofern das Molekül die gewünschten Eigenschaften aufweist, wird die Reinst-Lösung analysiert und damit die Struktur des Moleküls aufgeklärt. Es gibt Bestrebungen die Partikel für die Synthese zu markieren, so dass der Weg jedes einzelnen Partikels während der Synthese verfolgt werden kann. Diese Verfahren bedingen jedoch ein Markierungssystems des Beads und eine Überwachung des Aufenthaltsortes des Beads zwischen den Verteilungsschritten. Aus Gründen der Syntheseeffizienz muss trotzdem nochmals nachgeprüft werden, ob der erzeugte Partikel auch korrekt prozessiert wurde. Diese Verfahren haben jedoch den Vorteil, dass man bei Messungen von 10 Komponenten und mehr anhand von chemischen
Ähnlichkeiten auf funktionelle Strukturen zurück schließen kann, da davon auszugehen ist, das die Synthese in der Mehrheit alle Fälle korrekt ist.
Bei der zweiten Strategie werden sämtliche Partikel einer Messung unterzogen und die Signalgenerierung so ausgelegt, dass die Partikel mit den Molekülen, welche die. gewünschte Eigenschaft besitzen aussortiert werden können. Dann werden diese Partikel vereinzelt, die Moleküle abgespalten und die Reinst-Lösung dann analysiert. Auch hier werden Verfahren angestrebt, welche die einzelnen Partikel während ihres Syntheseweges aufzeichnen und so ohne eine nachfolgende Analyse eine Strukturbestimmung zulassen.
Bei der dritten Strategie spaltet man sämtliche Moleküle von allen Partikeln ab und erzeugt so ein Gemisch mit Teils bis zu 10A15 unterschiedlichen Molekülen. Diese Gemische können auch über andere Reaktionsführungen erzeugt werden, bei denen die Festphase dann nicht
„sortenrein" nur eine Art an Molekül trägt, sondern ein Gemisch an Molekülen. Das erzeugte Gemisch wird dann einer Selektion unterworfen, das heißt einer Prozessführung, die dafür sorgt, dass sich Moleküle mit der gewünschten Eigenschaft anreichern und Moleküle mit unerwünschten Eigenschaften abgereichert werden. Gegebenenfalls werden mehrfach hintereinander Selektionen durchgeführt und so die gewünschten Moleküle mehr und mehr angereichert. Sofern die Anreicherung hoch genug ist, kann eine Detektion und Identifikation der Moleküle erfolgen. Oft ist jedoch eine direkte Identifikation der Moleküle nicht möglich. Einzig im Falle von DNA, RNA und in speziellen Fällen für Proteinen ist es ebenfalls möglich einen Amplifikationsschritt einzufügen, der eine weitere Anreicherung zulässt bis eine Identifikation stattfinden kann.
Mit den aktuellen Methoden aus dem Stand der Technik ist es nicht möglich in einfacher Art und Weise viele, z.B. 10A2 bis 10A6 und mehr, Moleküle hochparallel gekoppelt sowohl in Bezug auf ihrer molekulare Struktur als auch in ihren Eigenschaften zu charakterisieren. Meist findet zunächst eine Selektion statt und aus dem finalen Pool werden dann einzelne Moleküle in ihrer Struktur aufgeklärt, da man davon ausgeht, dass die besten Moleküle am häufigsten im Pool vorkommen sollten. Um den Pool vollständig auszuschöpfen, ist es daher notwendig, alle Moleküle des Pools zu analysieren und möglichst direkt auf ihre Eigenschaft hin zu charakterisieren.
Weiterhin ist es bei den Methoden im Stand der Technik nötig mehr als einen
Selektionsschritt durchzuführen, um einen finalen Pool an Molekülen zu erzeugen. Im Falle der Displaymethoden kann es sich dabei um 3 bis 5 Wiederholungen (Phage-Display) bis hin zu 10 bis 20 Wiederholungen (SELEX) handeln. Dies ist zeit- und kostenintensiv. Das Hauptproblem liegt jedoch in dem Bias der Selektion, der dafür sorgt, dass auch optimale Moleküle wegen unpassender Nebeneigenschaften wie z.B. schlechter Amplifizierbarkeit im SELEX unterdrückt werden, auch wenn diese die besten Eigenschaften aufweisen. Daher war es Aufgabe der Erfindung eine Methode bereitzustellen, welche es erlaubt einen großen Pool von 10A2 bis 10A6 und mehr Molekülen gleichzeitig zu prozessieren und dabei deren Struktur als auch Eigenschaften gekoppelt zu analysieren.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gelöst wird die Aufgabe durch die unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte
Ausführungsformen finden sich in den abhängigen Ansprüchen.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von molekularen Eigenschaften und/oder Reaktionsbedingungen, umfassend die folgenden Schritte a) Bereitstellung eines ersten Speichers, umfassend eine erste Oberfläche, wobei eine Auswahl von Probemolekülen an die Oberfläche in einer definierten Anordnung direkt oder indirekt gebunden wird, b) Herstellung von mindestens zwei Transferspeicher umfassend die Bereitstellung von mindestens zwei weiteren Oberflächen, und einen Reaktionsschritt, ausgewählt aus der Gruppe Übertragungsreaktion, Arnplifikationsreaktion und/oder Derivatisierungsreaktion, wodurch
Produktmoleküle entstehen können und diese Produktmoleküle und/oder die Probemoleküle an die Oberflächen binden, wobei eine ein-eindeutige räumliche Zuordnung zwischen den Probemolekülen des ersten Speichers und den Produktmolekülen und/oder Probemolekülen der Transferspeicher besteht, c) Analyseschritt, umfassend das Analysieren des ersten Speichers, der
Transferspeicher, der Probemoleküle, der Produktmoleküle, der Übertragungsreaktion, Arnplifikationsreaktion und/oder
Derivatisierungsreaktion.
Bei dem beschriebenen Verfahren wird mit einem gezielt ausgewählten Pool von
Probemolekülen, auf einem ersten Speicher ein Original erzeugt. Ein erster Speicher kann daher im Sinne der Erfindung auch als Original bezeichnet werden. Dieser Speicher zeigt eine räumlich feste Anordnung der Probemoleküle. Jede Position auf dem Original ist dabei in eindeutiger Weise mit einem oder mehreren Probemolekülen verknüpft. Anhand dieses Originals werden dann mindestens zwei, bevorzugt eine Vielzahl, Transferspeicher hergestellt. Dabei sind verschiedene„Kopien" möglich. Das heißt die hergestellten
Transferspeicher können sich unterscheiden. Anschließend können sowohl der erste Speicher als auch die hergestellten Transferspeicher beziehungsweise der Kopierprozess selbst analysiert werden. Dieses erfindungsgemäße Verfahren bietet daher eine Vielzahl von Kopie- und Analysemöglichkeiten die für zahlreiche Anwendungen und Fragestellungen eingesetzt werden können. Es ist dabei besonders bevorzugt, dass die Auswahl (ii) von Probemolekülen durch eine gezielte Selektion erfolgt. Durch geschickte Kombination der Probemoleküle kann somit ein höherer Durchsatz erreicht werden, als es im Stand der Technik möglich ist. Die Auswahl von Probemolekülen kann auf unterschiedliche Art erfolgen. Zum einen ist es mögliche eine gezielte Selektion aus einem großen Pool an Probemolekülen durchzuführen. Zum anderen ist es aber auch im Sinne der Erfindung, dass ausgehend von einem kleinen Pool von Molekülen durch Mutationen ein Pool von Molekülen erzeugt wird, der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden kann. Dies kann zum einem durch Mutation oder auch durch Permutationen von einzelnen bis hin zu wenigen Molekülen erzielt werden. Im Stand der Technik ist es unüblich, dass eine Selektion vor den Mikroarray durchgeführt wird, weshalb es nicht zu erwarten war, dass die erfindungsgemäßen Vorteile unter anderem durch diesen
Schritt erzielt werden konnten. Es ist dabei auch bevorzugt, dass die Probemoleküle aus einer Mutations-Bibliothek ausgewählt werden. Hierbei handelt es sich bevorzugt um eine molekulare Bibliothek, allerdings leiten sich alle Moleküle von einem Startmolekül ab. D.h. alle Moleküle der Bibliothek sind mit dem Startmolekül nahezu identisch und sind nur an definierten Positionen variiert. Die Anzahl der Gesamtvariationen ist das Produkt der
Variationen pro variierter Position. Wird also ein DNA-Strang mit 100 Basen Länge nur an 20 Positionen variiert und an jede der variierten Stellen 4 verschiedene Basen eingebaut, so existieren 4A20 Varianten. Je zwei Moleküle dieser DNA-Mutations-Bibliothek stimmen somit in mindestens 80 DNA-Basen miteinander überein.
Als Kopie wird im Sinne der Erfindung auch ein Amplifikat eines Probemoleküls, ein Derivat eines Probemoleküls oder ein transferiertes Probemolekül verstanden. Eine Kopie ist im Sinne der Erfindung stellt vor allem ein Produktmolekül beziehungsweise die Gesamtheit der Produktmoleküle dar. Demnach werden als Kopie nicht nur identische Moleküle bezeichnet, sondern jede Art des Produktmoleküls die durch Schritt iv) entstehen können. Eine Kopie kann daher auch ein Amplifikat oder ein Derivat sein. Somit kann die Kopie eines DNA- Vorlagemoleküls zum Beispiel ein DNA-Produktmolekül aber auch en RNA- oder ein Protein-Produktmolekül sein.
Es ist besonders bevorzugt, dass der Reaktionsschritt in einem zellfreien Reaktionssystem, besonders bevorzugt in einem zellfreien Expressionssystem stattfindet.
Ein Amplifikat eines Moleküls entsteht bevorzugt durch die Amplifikation eines
ursprünglichen Moleküls. Das Amplifikat kann dabei identisch zum ursprünglichen Molekül sein, oder sich in eindeutiger Weise vom Molekül ableiten (z.B. wenn aus DNA
entsprechende cDNA erzeugt wird).
Ein Derivat eines Moleküls, ist bevorzugt das oder diejenigen Moleküle, welche entstehen wenn ein Ursprungsmolekül umgewandelt wird oder wenn Amplifikate eines Moleküles erzeugt wurden und diese umgewandelt werden, oder Moleküle erzeugt wurden, die sich in direkter oder indirekter Weise vom ursprünglichen Molekül ableiten (z.B. DNA, die zunächst mittels PCR amplifiziert wurde und dann daraus RNA oder Protein erzeugt wird).
Die Erfindung stellt somit eine einzigartige Anwendung als neuartige Kombination aus Selektion, Mikroarray-Kopiertechnik, Screening und Prozessführung von Einzelmolekülen beziehungsweise Partikeln dar, so dass es möglich ist einen Pool aus Probemolekülen und Partikeln hochparallel räumlich zu separieren, vom Separationsmuster mehrfach Kopien der Moleküle anzufertigen und anhand dieser Kopien beziehungsweise des Kopierprozesses selbst sicher zu stellen, dass a) die Moleküle sortenrein vorliegen (eventuell vorliegende Kontaminationen werden im Analyseprozess mit detektiert), b) die Moleküle mindestens einmalig, vorzugsweise mehrfach auf eine andere Oberfläche kopiert werden können, c) die Moleküle bezüglich ihrer Molekularstruktur analysiert und identifiziert werden können, indem das Original oder eine der Kopien analysiert wird, und/oder d) die Eigenschaften der Moleküle während des Kopierprozesses oder durch Analyse der Kopie oder des Originals ermittelt werden. Ein Vorteil der Erfindung liegt in dem Kopierschritt. Dieser Schritt liefert eine besonders gutes Ergebnis, da die Transferspeichers, bevorzugt„kopierten Mikroarrays" in einer hohen Qualität bereitgestellt werden. Das heißt, dass unter anderem eine nicht zu erwartende Reinheit erzielt werden konnte. Außerdem ist der Vorgang selbst überraschend schnell. Im Stand der Technik ist das Kopieren von Arrays noch nicht etabliert, da diese Technik mit
Schwierigkeiten, einem hohen Zeitaufwand und vor allem hohen Kosten verbunden ist. Durch die Erfindung wird hiermit erstmals ein Verfahren bereitgestellt, mit welchem diese
Hindernisse überwunden werden können, sodass das Kopieren eines Arrays nun zu vielen verschiedenen Analyseverfahren, bevorzugt gleichzeitigen Analyseverfahren, eingesetzt werden kann.
Das System besitzt das Potential über mehrere Größenordnungen hinweg, von 10A2 bis 10A6 und mehr, unterschiedliche Probemoleküle zu erfassen und zu analysieren. Weitere Vorteile des Verfahrens sind die hohe Reinheit, mit welcher die Produktmoleküle nach dem
Reaktionsschritt vorliegen. Außerdem können kleinere Volumina verwendet werden, was zu einer Ersparnis an Reaktionskomponenten und somit letztlich einer Gesamtkostenersparnis beiträgt. All diese Vorteile bringen somit zum einen eine Kostenreduktion aber auch einer Reduktion des Arbeitsaufwands mit sich, da die Zuverlässigkeit des Verfahrens besonders hoch ist und daher Tests nicht wiederholt werden müssen.
Besonders vorteilhaft ist die Flexibilität und Vielseitigkeit des Verfahrens. Es gibt zahlreiche Ausführungsformen und Anwendungsbereiche für das erfindungsgemäße Verfahren, sodass viele verschiedene Fragestellungen durch das Verfahren bearbeitet werden können.
Die Kernschritte der Methode können auch als
• Auswahl der Probemoleküle
• Erzeugung des Originals · Erzeugung der Kopie(n)
• Durchführung der Analyse(n) zusammengefasst werden.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich ist, besonders lange Probemoleküle wie Nukleinsäureabschnitte, zum Beispiel genomische DNA, als Probemoleküle einzusetzen. Dies stellt einen enormen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik dar. So wird in einem Artikel über Mikroarrays von Monya Baker („Microarrays, megasynthesis", Nature Methode, 2011, vol. 8, pp. 457) zum Beispiel ausgeführt, dass Wissenschaftler unabhängig von der Verwendung einer
Oligonukleotidbibliothek immer danach streben mehr und längere Oligonukleotide bei einer geringeren Fehlerrate einsetzen oder untersuchen zu können („No matter how researchers intend to use libraries of oligonucleotides, they usually want more oligonucleotides, longer oligonucleotides and lower error rates."). Außerdem wird in diesem Artikel der
Wissenschaftler Jay Shendure zitiert, der erklärt, dass sich bei einer möglichen Länge von 300 Basenpaaren oder sogar 1000 Basenpaaren eine Vielzahl von Möglichkeiten ergeben würden, die derzeit nicht umgesetzt werden können ("If [the achievable length] was 300 base pairs or even a kilobase, there äre a lot of things one could do that one can't do now."). Genau dieses Problem kann durch die Erfindung gelöst werden. So können zum Beispiel erste Speicher und Transferspeicher mit DNA-Längen von bis zu 1500 Basenpaaren und auch deutlich mehr problemlos ohne Qualitätsverlust hergestellt werden. Dies verdeutlicht, dass die Erfindung dazu beiträgt ein Problem zu lösen, welches die Fachwelt bis zum Prioritätszeitpunkt nicht befriedigend lösen konnte. Es bestand demnach ein dringendes Bedürfnis eine geeignete Lösung für diese Problem zu finden.
Als„erste Speicher" können bevorzugt diverse Mikroarrays oder mikroarrayartige
Oberflächen dienen und es können mehrere, teils unterschiedlich geartete Kopien erzeugt und mittels unterschiedlicher Methoden analysiert werden. Die unterschiedlichen
Ausführungsformen der einzelnen Schritte lassen sich nun frei kombinieren und erlauben somit eine Vielzahl von erzeugbaren Kopien und/oder Anwendungen. Im Folgenden werden die unterschiedlichen Ausführungsformen der Schritte beschrieben. Bei der Erzeugung des ersten Speichers - im Sinne der Erfindung auch als Original bezeichnet - kann sowohl eine molekulare Bibliothek, ein davon abgeleiteter Pool oder aber auch eine Mischung aus Molekülen, verwendet werden. Die Moleküle können dabei frei in Lösung vorliegen, oder auch an Partikel oder Oberflächen gebunden sein. Oder die
Molekülsorten können bereits einzeln voneinander getrennt vorliegen und werden dann auf das Original verbracht. In Lösung können die Moleküle einzeln vorliegen oder zwei und mehr Sorten an Moleküle aneinander gekoppelt sein. Sofern mindestens zwei Molekülsorten aneinander gekoppelt sind, kann aus der Anwesenheit bzw. Analyse der einen Molekülsorte auf die Anwesenheit und Struktur der zweiten Molekülsorte geschlossen werden (molekulares Tagging).
Eine Molekulare Bibliothek stellt bevorzugt ein Gemisch aus bis zu 10A15 oder mehr unterschiedlichen Molekülen dar, die z.B. mittels kombinatorischer Chemie erzeugt wurden. Meist haben die Moleküle einer Bibliothek ähnliche Grundstrukturen oder Strukturmuster, die zufällig miteinander kombiniert wurden. Die Anzahl der möglichen Moleküle berechnet sich als Produkt der einzelnen Variationsmöglichkeiten. Beispielsweise kann ein DNA-Strang pro Position 4 natürliche Bausteine enthalten. Dies bedeutet, dass eine kombinatorische
Bibliothek eines 100 Basen langen DNA-Strangs bereits 4A100 unterschiedliche DNA- Moleküle enthält.
Es ist außerdem bevorzugt, dass die Probemoleküle an Partikel gebunden sind. Durch diese Ausführungsform kann eine besser und vor allem gezielte„Beladung" des ersten Speichers erfolgen.
Um nun den ersten Speicher zu erzeugen, werden mittels geeigneter Restriktionen die Probemoleküle oder Partikel voneinander getrennt und ortsaufgelöst an die Oberfläche des Speichers verbracht. Die Probemoleküle werden dabei so angelagert, dass diese ihre Ortspösition im Folgenden nicht mehr in einfacher Art und Weise verlassen können. Das Original stellt somit einen ortsaufgelösten molekularen Speicher dar.
Beim Partikelspeicher wird der Speicher dadurch erzeugt, dass Partikel auf der Oberfläche angelagert werden. Jeder Partikel trägt dabei genau ein oder mehrere Molekülsorten. Die Trägeroberfläche kann dabei strukturiert sein und die Partikel auf der Strukturierung unterschiedlich positioniert werden. Sofern sich mindestens zwei Molekülsorten auf einem Partikel befinden, kann aus der Anwesenheit bzw. Analyse der einen Molekülsorte auf die Anwesenheit und Struktur der zweiten Molekülsorte geschlossen werden (molekulares Tagging).
Es ist auch bevorzugt, dass der erste Speicher ein Partikel-Transferspeicher ist. Bei einem solchen Speicher werden die Partikel auf der Oberfläche angelagert. Jeder Partikel trägt dabei eine oder mehrere Molekülsorten. Die Trägeroberfläche kann dabei strukturiert sein und die Partikel auf der Strukturierung unterschiedlich positioniert werden. Es wird zumindest eine Sorte Moleküle vom Partikel gelöst oder Derivate oder Amplifikate mindestens einer Sorte Moleküle des Partikels erzeugt und diese dann auf die Oberfläche des Transferspeichers übertragen. Somit stellt der Transferspeicher eine Eigenkopie dar, da einige Moleküle der Partikel in den Speicher kopiert werden. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Ortsinformation der Probemoleküle zum Partikel erhalten bleiben, das heißt die Position des Partikels und die Position der Probemoleküle können einander zugeordnet werden. Wahlweise kann der Partikel entfernt oder für einen späteren Molekültransfer oder die Erzeugung von
Amplifikaten oder Derivaten von Molekülen verwendet werden.
Es ist auch bevorzugt, dass der erste Speicher ein Molekülspeicher ist. Beim Molekülspeicher als Original werden Moleküle wahlweise einzeln, in gekoppelter Form oder als Gemisch auf der Oberfläche angelagert. Die Trägeroberfläche kann dabei strukturiert sein, bevorzugte Positionen für die Anlagerung der Moleküle bieten und die Anlagerung auf der Strukturierung unterschiedlich positioniert werden. Die Moleküle verbleiben anfänglich im Molekülspeicher. Mittels einer Ampliflkation und/oder Derivatisierung ist es zudem möglich den
Molekülspeicher mit Amplifikaten oder Derivaten des oder der Moleküle, die anfänglich im ersten Speicher enthalten sind, zu belegen. Somit stellt der Molekülspeicher sozusagen eine Eigenkopie der originalen Moleküle dar und erlaubt damit eine Signalverstärkung. Es bleibt die Ortsinformation der Moleküle erhalten.
Es ist auch bevorzugt, dass der erste Speicher ein Eigenschaftsspeicher ist. Beim
Eigenschaftsspeicher als Original werden bevorzugt identische Moleküle oder Partikel auf der Oberfläche angelagert. Die Trägeroberfläche kann dabei strukturiert sein und die Anlagerung auf der Strukturierung unterschiedlich positioniert werden. Der Eigenschaftsspeicher kann inhärent oder aufgrund eines äußeren Einflusses in jeder Speicherposition über
unterschiedliche Eigenschaften verfügen. Dies kann aufgrund enthaltener Mikrofluidik, Mikroelektronik, der Oberflächen (Struktur, Beschichtung, Material etc.), oder Zugabe von Molekülen oder Partikeln oder einer Kombination dieser Möglichkeiten zu unterschiedlichen Eigenschaften führen. Diese Eigenschaften können Unterschiede diverser Natur sein
(physikalisch, chemisch, biochemisch) und beispielsweise unterschiedliche Volumen, Oberfläche, Benetzbarkeit, pH-Wert, Salzgehalte, biochemische Inhaltsstoffe, elektrische Ladungen, elektrische, magnetische oder dielektrische Eigenschaften, osmotische Drücke oder Zusatzstoffe enthalten. Der Eigenschaftsspeicher wird vorzugsweise für die Optimierung einer biochemischen oder chemischen Reaktion eingesetzt und soll unterschiedliche
Reaktionsbedingungen realisieren. Im üblichen Falle werden alle Speicherpositionen eines Eigenschaftsspeichers mit identischen Molekülen beladen. Ein Fachmann ist in der Lage einen geeigneten ersten Speicher auszuwählen ohne dabei selbst erfinderisch tätig zu werden.
Sämtliche zuvor genannte erste Speicher können einen Mechanismus enthalten, der es erlaubt gezielt an einer Position innerhalb des Speichers die Moleküle freizusetzen. Dies kann über Freisetzen der Moleküle mittels chemischer, elektrochemischer, photochemischer oder rein elektrischer/magnetischer, thermischer Mechanismen erfolgen. Im Falle von Partikelspeichern kann auch der komplette Partikel oder Teile desselben freigesetzt werden. Die so gewonnenen Moleküle stehen dann für eine weitere Untersuchung oder Modifikation bereit. Wahlweise kann auch vom Speicher eine Kopie angefertigt werden und von der Kopie die Moleküle gezielt freigesetzt werden.
Folgende Mechanismen sind dabei bevorzugt:
• Ortsaufgelöste Zugabe von Säure oder Base, die eine molekulare Umlagerung bewirkt, die die Moleküle freisetzt
• Ortsaufgelöste Erzeugung von Säure oder Base mittels Licht oder Elektrizität, durch Elektrolyse oder Photo lyse
• Spaltung einer chemischen Gruppe durch lokales Erzeugen von Ladungen mittels Elektrizität oder Licht
• Umlagerung einer chemischen Gruppe durch Einstrahlung von Licht
• Ablösen von elektrostatisch angebundenen Molekülen an geladenen Oberflächen
durch lokale Änderung des elektrischen Feldes oder des Redoxpotentials mittels Elektrizität oder Licht
• Umlagerung einer chemischen Gruppe durch lokales Erhitzen oder Abkühlen
• Umlagerung der chemischen Gruppen aufgrund von Zusatzstoffen oder einer
Kombination der oben genannten Effekte
• Zersetzung eines Partikels und damit Freisetzung der Moleküle mittels Wärme,
Schmelzen, Zerschneiden durch Laserlicht oder Auslösen eines Zerfallsprozesses mittels Licht, Chemie oder Elektromagnetischer Effekte • Erzeugen von physikalischen Kräften auf einen Partikel mittels elektrischer, magnetischer, elektromagnetischer oder dielektrischer Felder oder durch gezieltes Überhitzen von Flüssigkeit in der Nähe des Partikels um durch entstehende Expansion ein Kraft zu erzeugen
• Mechanisches Abtragen der Oberflächen auf denen die Moleküle aufgebracht sind oder mechanisches Greifen des Partikels, um diesen aus dem Original zu entfernen
Bei der Erzeugung der Kopie können unterschiedliche Reaktionen genutzt werden, um eine molekulare Kopie des Originals zu erzeugen. In allen folgenden beschriebenen
Ausführungsformen zur Erzeugung einer Kopie, wird die bevorzugte Ausführungsform des ersten Speichers in Form des Speichers mit Kavitäten dargestellt. Die Erzeugung der Kopie für andere Speicher geschieht in ähnlicher Art und Weise.
Zur Erzeugung einer Kopie im Sinne der Erfindung können wahlweise die Probemoleküle aus dem Speicher herausgelöst und übertragen werden, oder die beinhaltenden Moleküle werden amplifiziert und übertragen oder amplifiziert und derivatisiert und bestimmte erzeugte Derivate oder Amplifikate werden auf die Kopie übertragen. Die Derivate können dabei identisch zu den ursprünglichen Molekülen sein, oder in direkter oder indirekter Form davon abgeleitet und sind damit dem ursprünglichen Molekül eindeutig zuordenbar. Beispielsweise kann von einer DNA, zunächst eine identische DNA erzeugt werden, diese dann mittels eines Enzymsystems an einer bestimmten Sequenzposition einen Austausch einer Base erfahren und dann diese modifizierte DNA in RNA oder gar Protein derivatisiert werden. Da die ursprüngliche Sequenz der DNA bekannt ist, ist auch die Sequenz der veränderten DNA bekannt und damit auch der entstehenden RNA beziehungsweise des Proteins. Somit hat eine Kopie folgende Eigenschaften:
• Es gibt eine ein-eindeutige räumliche Zuordnung zwischen Original und Kopie, so dass aufgrund der Kenntnis des Ortes auf der Kopie der Ort auf dem Original zugeordnet werden kann und ein Ort auf dem Original kann einem Ort auf der Kopie in eindeutiger Art und Weise zugeordnet werden.
• Es lassen sich ein-eindeutige molekulare Verwandtschaften zuordnen, so dass aus der Analyse eines Moleküls auf einer der Kopien oder dem Original abgeleitet werden kann, um welches Molekül es sich auf jeder der Kopien und dem Original handelt. Des Weiteren kann die Oberfläche einer Kopie planar oder strukturiert sein und selbst wieder ein Original darstellen, von dem weitere Kopien erzeugt werden können. Folgende
Übertragungstechniken für die Originale sind denkbar.
Es ist bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine Übertragungs-Kopie entsteht. Bei einer Übertragungs-Kopie werden die Moleküle des ersten Speichers direkt auf die Oberfläche des Transferspeichers übertragen. Dies bedingt, dass die Moleküle von der Oberfläche des Originals freigesetzt, übertragen und auf der Kopie angebunden werden.
Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine Derivatisierungs-Kopie entsteht. Bei der Derivatisierungs-Kopie werden die Probemoleküle des Originals derivatisiert und diese Derivate dann auf die Kopie übertragen. Derivate können zum Beispiel eine
Umwandlungen der ursprünglichen Moleküle darstellen, weshalb hier eine Verarmung stattfindet, bis keinerlei Derivate mehr erzeugt werden können, da dann alle Moleküle aufgebraucht wurden.
Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine Eigenerzeugungs-Kopie entsteht. Bei der Eigenerzeugungs-Kopie besitzen die Moleküle des Originals eine katalytische, enzymatische und/oder chemische Aktivität, die dafür sorgt, dass zugegebene Moleküle amplifiziert und/oder derivatisiert werden. Diese selbsterzeugten Moleküle werden dann wahlweise direkt, oder mittels einer weiteren Derivatisierung oder Amplifikation auf die Kopie übertragen. Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine Kombinations-Kopie entsteht. Bei der Kombinations-Kopie stellt eine parallele oder serielle Verkettung aus Derivatisierung, Amplifikation oder Selbsterzeugung zur Erzeugung der Kopie dar. Es werden mindestens zwei Prozesse verschaltet, die wahlweise Amplifikation oder Derivatisierung oder
Selbsterzeugung sein können. Im bevorzugten Falle erfolgt zunächst eine Amplifikation, da hier dann die originalen Moleküle erhalten bleiben, und dann eine Derivatisierung der Amplifikate oder eine weitere Amplifikation der Amplifikate. Diese können dann im
Folgenden weiter derivatisiert und/oder amplifiziert werden, um so die gewünschten
Moleküle zu erzeugen. Im Falle einer anfänglichen Derivatisierung und einer folgenden Amplifikation wird das Original langsam aufgebraucht. Dieses Aufbrauchen ist dann jedoch deutlich langsamer als bei der reinen Derivatisierungskopie und erlaubt demgegenüber eine Erzeugung von mehr Kopien bevor das Original aufgebraucht wurde. Prinzipiell lassen sich beliebig viele Amplifikations-, Derivatisierungs- und
Selbsterzeugungsschritte koppeln bevor eine Kopie erzeugt wird.
Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine Mehr-Molekül-Kopie entsteht. Bei der Mehr-Molekül-Kopie werden mindestens zwei Sorten an Molekülen von einer Position kopiert. Dabei wird für jede der Molekülsorten mindestens eine der zuvor genannten Kopieerzeugungen (direkter Transfer, Amplifikation, Derivatisierung, Selbsterzeugung, Kombination) verwendet oder miteinander kombiniert.
Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine Flüssigkeitskopie entsteht. Die Flüssigkeitskopie wird auf den ersten Speicher ein umsetzbares Molekül gegeben, das durch oder im Vorhandensein geeigneter Moleküle auf dem Original selbst derivatisiert oder amplifiziert wird. D.h. es entsteht eine räumliche Zuordnung zwischen Entstehen der Derivate beziehungsweise Amplifikate und den darunterliegenden Molekülen. Diese Derivate und Amplifikate der zugegebenen Moleküle müssen nicht notwendiger Weise auf eine Kopie übertragen werden. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist bereits die Aussage ausreichend, dass die Moleküle des Originals, die erzeugende Eigenschaft für Derivate und Amplifikate für andere Moleküle besitzen. Dieser Fall liegt vor, wenn z.B. verschiedene Enzyme auf dem Original vorliegen.
Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine DNA-zu-DNA-Kopie entsteht. Die Die DNA-zu-DNA-Kopie entspricht einer Amplifikationskopie. Hierbei befindet sich im Original DNA, die mittels einer DNA-Polymerase nochmals zu DNA amplifiziert wird. Die entstandenen Amplifikate können dann direkt auf die Kopie gebunden werden, oder mittels einer Fest-Phasen-Polymerasereaktion auf die Oberfläche nochmals amplifiziert werden.
Bei ersten Versuchen wurden DNA-Moleküle als Probemoleküle ausgewählt. Durch die Reaktionsschritte sollte eine Protein-"Kopie" erzeugt werden. Es zeigte sich überraschend, dass die Produktmoleküle (hier Proteine) im miniaturisierten System deutlich schneller als erwartet ablief. Insbesondere im Vergleich zum DAPA-System wurde eine 3 bis 10-fach schnellere Reaktionszeit erreicht, so dass zukünftig eine Protein-Kopie nicht mehr nach etwa 90 min, sondern schon nach etwa 15 min beendet werden kann.
Bei der DNA-zu-DNA-Kopie (Probemolekül ist DNA und Produktmolekül ist DNA), konnte ein DNA-Mikroarray als Transferspeicher von bisher nicht bekannter Reinheit erzeugt werden. Die Reinheit ist so hoch, dass sie voraussichtlich nicht ein Mal mit einem Sequenzierprozess erfasst werden kann, da dieser starker fehlerbehaftet ist, als der verwendete Kopierprozess.
Somit erlaubt der das Verfahren in einem ersten Teilabschnitt eine schnellere, synthetisch reinere, weniger material- und arbeitsintensive Herstellung von Mirkoarrays (in Form von Transferspeichern), die zu einer drastischen Kostenersparnis führt und zudem die Erzeugung von Mikroarrays erlaubt, wie sie mit bisherigen Verfahren nicht herstellbar sind, oder nur unter hohem Zeit-, Kosten- und Arbeitsaufwand zu realisieren wären, der jedoch nicht rentable ist. Dadurch werden im zweiten Teilabschnitts des Verfahrens Analysen möglich, welche im Stand der Technik so nicht realisiert werden können. Weiterhin reichte vorteilhafterweise bereits eine DNA aus, um eine Kopie einer kompletten Volumeneinheit zu erreichen.
Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine DNA-zu-RNA-Kopie entsteht. Die DNA-zu-RNA-Kopie entspricht in einer bevorzugten Ausführungsform einer
Amplifikationskopie. Hierbei befindet sich im Original DNA, die mittels einer RNA- Polymerase direkt zu RNA amplifiziert wird. Die entstandenen Amplifikate können dann direkt auf die Kopie gebunden werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die DNA-zu-RNA-Kopie als Kombinationskopie stattfinden. Hierbei wird die DNA des Originals zunächst als DNA mittels einer DNA-Polymerase amplifiziert und dann in einer Festphasenreaktion die DNA nochmals mittels einer RNA-Polymerase zu
oberflächengebundener RNA amplifiziert.
Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine DNA-zu-Protein-Kopie entsteht. Die DNA-zu-Protein-Kopie entspricht in einer bevorzugten Ausführungsform einer
Kombinationskopie, bei der mehrere Reaktionsschritte hintereinandergeschaltet sind. Die DNA des Originals wird zunächst mittels einer RNA-Polymerase in RNA und diese RNA dann mittels Ribosome in ein entsprechendes Protein umgeschrieben. Das entstehende Protein bindet dann an die Oberfläche. In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform ist es aber auch möglich die Reaktion in zwei Teilschritte zu zerlegen. Zunächst wird anhand der DNA des Originals mittels einer RNA-Polymerase RNA hergestellt, welche dann an die
Kopieroberfläche angebunden wird. In diesem Zwischenzustand kann die Kopie verbleiben, bis ein Enzymgemisch hinzugegeben wird, welches die RNA als Template nutzt und daraus dann ein entsprechendes Protein erzeugt, welches sich in der direkten Umgebung der RNA niederschlägt. Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine RNA-zu-Protein-Kopie entsteht. Die RNA-zu-Protein-Kopie entspricht in einer bevorzugten Ausführungsform einer
Kombinationskopie, da mit der RNA mittels eines Enzymgemisches ein entsprechendes Protein hergestellt wird. Das erzeugte Protein wird auf die Kopie übertragen. Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine RNA-zu-DNA-Kopie entsteht. Die RNA-zu-DNA-Kopie entspricht in einer bevorzugten Ausführungsform einer
Kombinationskopie, aus der RNA mittels Reverse Transkriptase ein entsprechendes DNA erzeugt wird. Dann kann die DNA wahlweise direkt auf die Kopie übertragen werden oder zusätzlich mittels einer DNA-Polymerase amplifiziert und dann erst übertragen werden. Bei einer solche Ausführungsform kann vorteilhafterweise die RNA wie auch die entstandene DNA analysiert werden.
Es ist auch bevorzugt, dass der Transferspeicher durch eine RNA-zu-RNA-Kopie entsteht. Die RNA-zu-RNA-Kopie entspricht in einer bevorzugten Ausführungsform einer
Kombinationskopie, da die RNA mittels Reverse Transkriptase zu DNA derivatisiert wird. Danach kann dann die DNA wieder in RNA mittels einer RNA-Polymerase amplifiziert werden, oder zunächst mittels einer DNA-Polymerase in DNA amplifiziert werden, die dann von einer RNA-Polymerase in RNA amplifiziert wird. Die RNA wird dann auf die Kopie übertragen.
Anschließend werden Analysen durchgeführt. Dabei können sowohl die Analyse der Struktur der Moleküle, als auch deren Eigenschaften abdecken und zu unterschiedlichen Zeitpunkten stattfinden:
• Der erste Speicher kann bereits vor der Kopie analysiert werden.
• Der erste Speicher, der Transferspeicher und/oder das Medium zwischen
Transferspeicher und erstem Speicher können während des Kopierprozesses analysiert werden.
• Der erste Speicher, der Transferspeicher und/oder das Medium zwischen
Transferspeicher und erstem Speicher können nach dem Kopierprozess analysiert werden.
• Von dem ersten Speicher oder dem Transferspeicher werden einzelne oder mehrere Molekülsorten herausgelöst und analysiert. • Teilschritte des Kopiervorganges wie Amplifikation, Derivatisierung oder Selbsterzeugung werden analysiert.
Die Analyse ist sehr stark von der Zielsetzung der Anwendung abhängig. Es können gängige Analysemethoden aus dem Stand der Technik verwendet werden. Bevorzugt sind etablierte Methoden wie Fluoreszenz, Luminiszenz, labelfreie Detektion, Erzeugung von Farbstoffen welche optisch erfasst werden können, oder redoxreaktiven Spezies, welche elektronisch erfasst werden können. Aufgrund der räumlichen Zuordbarkeit der Kopien und des Originals lässt sich diese Zuordnung von allen Analysen untereinander ebenfalls erreichen, so dass jedem Molekül, seinen Derivaten und Amplifikaten, die jeweilige Struktur und Eigenschaften aus den Analysen der Kopien und des Originals zuordenbar sind.
Es lassen sich nun mit der Erfindung folgende Punkte kombinieren, um gezielt besondere Arrays herzustellen. Die hergestellten Transferspeicher können anschließend auch für bestimmte Zwecke des Screenings eingesetzt werden.
Prinzipiell benötigt jede Methode der Erfindung bevorzugt die folgenden 4 Bestandteile · Verschiedene gezielt ausgewählte Probemoleküle werden als Quelle zur Erzeugung des ersten Speichers, auch Original genannt, verwenden,
• die Herstellung der Originale kann wie beschrieben auf unterschiedliche Weise
erfolgen
• davon werden dann unterschiedliche Kopien in Form der Transferspeicher gefertigt, · im Anschluss oder bereits während der bisherigen Methode finden dann die
Analysereaktionen statt
Bevorzugt wird die Methode der Erfindung zur Random-Library oder Pool-Kopie verwendet. Hierbei handelt es sich um eine beliebige Ansammlung (einen Pool) von Molekülen, die entweder zur Gruppe der DNA oder RNA gehören oder RNA oder DNA tragen und wahlweise künstlichen oder natürlichen Ursprungs sind oder anhand eines Selektions- oder Mutationsprozesses erzeugt wurden. Diese Moleküle können sich auch aus chemischen Bibliotheken oder Display-Pools ableiten. Eine gezielte Auswahl dieser Probemoleküle kann in jeder beschriebenen Methode eingebracht und kopiert werden. Wahlweise kann daraus eine Kopie in Form von DNA, RNA oder Protein erzeugt werden. Danach kann jede der Kopien dazu verwendet werden um wahlweise eine Bindung, eine Interaktion, eine enzymatische Aktivität oder eine Änderung einer der genannten Eigenschaften zu untersuchen.
Außerdem ist die Verwendung für eine Display-Kopie bevorzugt. Anhand von etablierten Displaymethoden (Yeast2Hybrid, Ribosome-Display, Phage-Display, SELEX, etc.) wird bezüglich eines molekularen Targets (Bindungspartner, Substrat, Antikörper, Antigen, ect.) zunächst eine Anreicherung getroffen. Dieser Schritt entspricht dem Stand der Technik in der jeweiligen Display-Methode. Nach dem ersten Anreicherungsschritt kann allerdings bereits der erzeugte Pool komplett entsprechend der beschriebenen Methoden in ein Original überführt werden und dieses Original dann mehrfach in Form von DNA, RNA oder Protein kopiert werden und so die Moleküle, die im ersten Schritt des Displays angereichert wurden in ihrer vollen Anzahl als Mikroarray abbilden. Auf diesen kopierten Mikroarrays kann dann nochmals eine Messung gegen das Target stattfinden. Dies erlaubt dann, im Vergleich zu herkömmlichen Displays, einen deutlich höheren Durchsatz an untersuchten Molekülen und vor allen deckt es den gesamten Pool ab. Bei Bedarf kann nochmals eine Anreicherung durchgeführt werden.
Außerdem ist die Verwendung in der Ribosome-Kopie bevorzugt. Diese Anwendung (vgl. auch Fig. 13) leitet sich vom Ribosome-Display ab. Hierzu wird wie beim Ribosome-Display zunächst eine Bindung gegen das gewünschte Target erzeugt und die Binder angereichert. Die angereicherten Binder werden dann nach einer der beschriebenen Methoden in ein Original überführt. Die bevorzugte Ausführung ist hierbei der Molekülspeicher, so dass initial in jeder Speicherposition genau ein Ribosome mit dem anhängenden RNA-Strang oder nur der RNA- Strang oder der daraus abgeleitete DNA- oder cDNA-Strang angelagert wird. Vorzugsweise wird dann eine Amplifikation vorgenommen, so dass der Speicher vorzugswiese mit DNA belegt ist. Dies stellt sicher, dass das Original langzeitstabil ist und der Abbau einzelner Stränge keinen Verlust von molekularer Information mit sich bringt. Danach kann das
Original wahlweise in DNA, RNA oder Protein- Arrays kopiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Proteinkopie erzeugt, die dann nochmals gegen Bindung an das Target untersucht wird. Das Original oder eine DNA-Kopie wird sequenziert, so dass jeder Bindung auf der Protein-Kopie eindeutig eine DNA-Sequenz zugeordnet werden kann. Auch bevorzugt ist die Verwendung der Methode in der Phage-Kopie. Diese Anwendung (vergleiche auch Figur 14) leitet sich vom Phage-Display ab. Analog zur Ribosome-Kopie wird einmalig der Phagen-Pool gegen das gewünschte Target angereichert und die Phagen dann direkt in ein Original überführt. Danach erfolgen die Schritte wie bei der Ribosome- Kopie. Vorzugsweise wird dann eine Amplifikation vorgenommen, so dass der Speicher vorzugswiese mit DNA belegt ist. Dies stellt sicher, dass das Original langzeitstabil ist und der Abbau einzelner Stränge keinen Verlust von molekularer Information mit sich bringt. Danach kann das Original wahlweise in DNA, RNA oder Protein-Arrays kopiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Proteinkopie erzeugt, die dann nochmals gegen Bindung an das Target untersucht wird. Das Original oder eine DNA-Kopie wird sequenziert, so dass jeder Bindung auf der Protein-Kopie eindeutig eine DNA-Sequenz zugeordnet werden kann.
Außerdem ist die Verwendung der Methode in der Antikörper- oder ScFv-Kopie bevorzugt. In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform der Display-Kopie tragen die Phagen oder Ribosome nicht einfache Proteine, sondern Antikörper oder Teile von Antikörpern oder artifizielle Antikörper-artige Konstrukte wie z.B. ScFv (single chain antibodies). Mit diesen wird wie in Phage-Kopie verfahren. Die erzeugten Proteinarrays tragen dann Antikörper, Antikörperteile bzw. ScFv und stellen damit Binder gegen ein Target dar. Diese Methode kann zur Optimierung von Antikörperbindungen verwendet werden.
Außerdem ist eine Populations-Kopie bevorzugt. Bei dieser Anwendung wird eine Population an Organismen (Zelle, Virus, Bakterium) oder Makromolekülen (V ektor, Plasmid,
Chromosom etc.) oder molekulare Komplexe (z.B. Interaktionen eines Gemisches zweier Ribosome-Displays, bei denen beispielsweise eines Antikörper und das andere Antigene präsentiert und somit zwei DNA-Tags pro Protein-Komplex tragen) in das Original eingebracht. Ebenfalls wieder bevorzugt als Molekülspeicher. Dabei werden gezielt ein oder mehrere Moleküle pro Speicher amplifiziert und in Form von DNA oder RNA gespeichert. Somit enthält jede Speicherze le mindestens ein Molekül, das auf einen Ursprung
zurückzuführen ist. Es können nun wahlweise Kopien in Form von DNA, RNA oder Protein erzeugt werden und eine Sequenzierung des Originals oder einer DNA-Kopie durchgeführt werden.
Folgende Anwendungen sind ebenfalls bevorzugt:
• Der Anfangspool an Probemolekülen wird auf die Anzahl und Art der enthaltenen Mutationen eines oder mehrerer Gene untersucht • Der Anfangspool an Probemolekülen enthält B- oder T-Zellen und es werden die Variationen und Kombinationen der leichten und schweren Kette der B- bzw. T-Zell- Rezeptoren untersucht
• Der Anfangspool an Probemolekülen enthält polyploide Organismen und es wird die genetische Varianz eines oder mehrerer Genabschnitte untersucht
• Der Anfangspool an Probemolekülen enthält Interaktionspartner (jeweils mit einem DNA-Tag versehen) und aus der gemeinsamen Analyse von zwei DNA-Sequenzen kann auf die molekulare Struktur der Bindungspartner geschlossen werden (z.B. die zuvor beschriebene Mischung zweier Ribosome-Displays aus Antikörpern und Antigen-Displays)
• Der Anfangspool an Probemolekülen enthält eine Art von Organismus und die
Analyse gibt Aufschluss über die enzymatische oder Bindeaktivität von eines oder mehreren enthaltenen Proteinen.
Der Anfangspool an Probemolekülen enthält eine Art von Organismus und die Analyse gibt Aufschluss über die enzymatische Aktivität oder Bindungseigenschaften eines oder mehrerer RNA- oder DNA-Abschnitte.
Es ist auch bevorzugt die Methode zur Genom-Kopie zu verwenden. Aus einem oder mehreren Organismen wird genomische DNA gewonnen, fragmentiert und dann in das Original eingebracht. Dies geschieht ebenfalls vorzugsweise im Molekülspeicher. Im Falle einer vorgeschalteten Amplifikation, z.B. einer Emulsions-PCR, welche die DNA auf Partikel amplifiziert, wird ein Partikelspeicher verwendet. Die DNA im Original wird dann zur Erzeugung von DNA-Kopien verwendet. Das erhaltene Array stellt damit ein Genom- Array des eingefüllten Organismus dar. Solcherlei Arrays sind bisher nicht direkt aus dem
Organismus herstellbar.
Auch die Transkriptom-Kopie ist bevorzugt. Aus einem oder mehreren Organismen wird die RNA, vorzugsweise mRNA, gewonnen und dann in das Original eingebracht. Dies geschieht ebenfalls vorzugsweise im Molekülspeicher. Im Falle einer vorgeschalteten Amplifikation, z.B. einer Emulsions-PCR, welche die RNA zunächst in cDNA umwandelt und dann auf Partikel amplifiziert, wird ein Partikelspeicher verwendet. Die RNA wird bevorzugt zunächst in cDNA im Original gespeichert. Diese hat eine deutlich höhere Stabilität als die RNA. Danach werden Kopien in Form von RNA oder cDNA erzeugt. Die erhaltene Arrays stellen damit Transkriptom-Arrays des eingefüllten Organismus dar. Solcherlei Arrays sind bisher nicht direkt aus dem Ursprungsorganismus herzustellen. Weiterhin erlauben die erzeugten cDNA- Arrays eine Anwendung im Bereich der Expressionsanlyse, wohingegen die erzeugten RNA- Arrays für Bindungsanalysen von Promotern oder Transkriptionsfaktoren Auch die Proteom-Kopie ist bevorzugt. Aus einem oder mehreren Organismen wird hier die RNA, vorzugsweise mRNA, oder die DNA gewonnen und dann in das Original eingebracht. Die dort gespeicherten Moleküle bestehen dann vorzugsweise aus DNA oder von RNA abgeleiteter cDNA. Dabei ist die bevorzugte Ausführungsform ein Molekülspeicher. Im Falle einer vorgeschalteten Amplifikation, z.B. einer Emulsions-PCR, welche die RNA zunächst in cDNA umwandelt oder DNA als solche belässt, und dann auf Partikel amplifiziert, wird ein
Partikelspeicher verwendet. Danach werden Kopien in Form von Protein erzeugt, die dann auf Aktivität in Form von Bindung, Interaktion oder enzymatischer Reaktivität untersucht werden. Weiterhin stellt dieses Array das Proteom der eingebrachten Organismen dar, sofern mRNA verwendet wurde. Sofern DNA direkt verwendet wurde, bildet die Kopie mehr Proteine ab, als im Protoem enthalten sind. Ein komplettes Proteom- Array ist bis dato nicht ohne weiteres herstellbar ist. Das ProtoArray 5.0 von Invitrogen deckt beispielsweise nur 9.000 Proteine des Menschen ab, der über mehr als 100.000 Proteine verfügt.
Die Protein-Kopie ist ebenfalls bevorzugt. Aus einem Pool von Probemolekülen wird DNA, welche das Protein bzw. Mutationen des Proteins codiert, in das Original eingebracht. Die dort gespeicherten Moleküle bestehen dann vorzugsweise aus DNA. Die bevorzugte
Ausführungsform ist dabei der Molekülspeicher. Im Falle einer vorgeschalteten
Amplifikation, z.B. einer Emulsions-PCR, die dann die DNA auf Partikel amplifiziert, wird ein Partikelspeicher verwendet. Danach werden Kopien in Form von Protein erzeugt, die dann auf Aktivität in Form von Bindung, Interaktion oder enzymatischer Reaktivität untersucht werden. Somit stellt das erzeugte Array einen allgemeinen Aminosäure-„Scan" des originalen Proteins dar. Solcherlei Arrays sind bisher nicht herstellbar, da bereits für einen
Mutationsscan an nur 4 Aminosäurepositionen 160.000 Mutanten zu erzeugen sind. Dies ist mit bisherigen Techniken nicht umsetzbar.
Im Zusammenhang mit Moleküloptimierung wird unter Scan bevorzugt das systematische Variieren einzelner molekularer Bausteine verstanden. Beim Alanin-Scan, wie er bei
Proteinen und Peptiden Anwendung findet, wird gezielt jeweils eine Aminosäure gegen das meist inaktive Alanin ersetzt und das entstehende Produkt getestet. Sofern eine biochemisch wichtige Aminosäure ersetzt wurde, zeigt das Biomolekül eine deutlich reduzierte Aktivität. Mittels des Scans können so wichtige und unwichtige Positionen für die Aktivität bzw.
Eigenschaften eines Moleküls bestimmt werden bzw. abgeschätzt werden. Es kann z.B. keine Aussage darüber getroffen werden, ob anstelle des Alanins eine andere Aminosäure eine höhere Aktivität oder verbesserte Eigenschaft gegenüber dem originalen Molekül aufweist. Die bevorzugte Anwendung auf dem Gebiet der ombinatorische-Chemie-Kopie stellt eine sehr spezielle Kombination (siehe auch Figur 15) dar. Bereits während der Synthese der chemischen Bibliothek, die bevorzugt auf Partikeln stattfindet, wird mit jedem Syntheseschritt neben dem eigentlichen Molekül noch ein weiteres„Informationsmolekül" in Form von DNA oder RNA aufgebaut. Dabei korreliert die Sequenz der DNA bzw. RNA in eindeutiger Weise mit dem aufgebauten Molekül. Nach Fertigung dieser kombinatorischen Bibliothek werden die Partikel einer Anreicherung gegen ein Target unterzogen, d.h. es verbleibt ein Pool an Partikeln der mit dem Target interagiert. Diese ausgewählten Partikel werden dann bevorzugt in einen Partikelspeicher bzw. Partikel-Transferspeicher als Original eingebracht. Nun können optional wahlweise die DNA oder die Moleküle in den Partikel-Transferspeicher transferiert werden. In der Ausführungsform des Partikelspeichers wird zunächst kein Transfer vorgenommen. Es werden dann mehrere Kopien erzeugt, die wahlweise die DNA und/oder das Molekül tragen. Die DNA kann hierzu amplifiziert werden. Die Moleküle werden im üblichen Falle vom Partikel freigesetzt. Vorzugsweise trägt ein Partikel deutlich mehr Moleküle als zum Erzeugen einer Kopie notwendig sind, sodass mehrere Kopien der
Moleküle erzeugt werden können. Anhand der Molekül-Mikroarrays kann nochmals die
Bindung gegen das Target oder dem Target ähnliche Strukturen validiert werden, wohingegen die DNA-Kopie dazu verwendet wird, um die Sequenz zu decodieren. Aufgrund der
Korrelation zwischen Sequenz und Struktur kann für jeden Spot des Molekül-Arrays dann die molekulare Struktur angegeben werden. Dies ist bei bisherigen kombinatorischen Split-und- Mix Bibliotheken nicht möglich.
Weiterhin ist bevorzugt, dass unterschiedliche Sorten von Probemolekülen an einen Partikel gebunden sind.
Es ist bevorzugt, dass die Oberfläche des ersten Speichers und/oder der Transferspeicher strukturiert ist. Bevorzugt ist, dass die Probemoleküle und/oder Produktmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Proteine, Enzyme, Aptamere, Antikörper oder Teile davon, Rezeptoren oder Teile davon, Liganden oder Teile davon, Nukleinsäuren, nukleinsäureartige Derivate, Transkriptionsfaktoren und/oder Teile davon, Moleküle die mit kombinatorischer Chemie erzeugt wurden.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass der Reaktionsschritt mittels DNA- Polymerase, RNA - Polymerase und/oder eines zellfreien Reaktionsmixes durchgeführt wird. Es ist bevorzugt, dass die Strukturierung der Oberflächen ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Kavitäten, Erhebungen, Kavitäten die Partikel enthalten und/oder Erhebungen die Partikel umfassen.
Dabei ist bevorzugt, dass die Kavitäten in etwa die Größe einer biologischen Zelle aufweisen. Besonders bevorzugt sind Kavitäten mit einem Durchmesser von 5 bis 250 μηι, ganz besonders bevorzugt 10 bis 50 μπι. Es hat sich gezeigt, dass der Reaktionsschritt besonders gut in Kavitäten dieser Größenordnung abläuft. Überraschenderweise ist die Ausbeute umso besser, je kleiner die Kavitäten sind.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass der erste Speicher in unterschiedlichen Bereichen
unterschiedliche physikalische, chemische und/oder biochemische Eigenschaften umfasst, bevorzugt unterschiedliches Volumen der Kavitäten, pH-Unterschiede, Unterschiede im Salzgehalt, Temperaturunterscheide, unterschiedliche Oberflächen, unterschiedliche
Benetzbarkeit, Unterschiede in der elektrischen Ladung, Unterschiede in elektrischen, magnetischen und/oder dielektrischen Eigenschaften, Unterschiede bezüglich osmotischer Drücke, unterschiedliche Zusatzstoffe, unterschiedliche biochemische Inhaltsstoffe. Es ist bevorzugt, dass während des Reaktionsschrittes mindestens eine Sorte von
Probemolekülen von den Partikeln und/oder der Oberfläche gelöst werden
Es ist außerdem bevorzugt, dass der Analyseschritt e) ein labelfreies Verfahren umfasst, bevorzugt eine RIfS-Detektion, iRIfS-Detektion, Biacore-Detektion, Surface-Plasom- Resonanz-Detektion, Ellipsometire, Massenspektroskopie, Detektion des Massezuwachs, Detektion der Änderung des Brechungsindex, Detektion der Änderung von optischen, magnetischen, elektrischen und/oder elektromagnetischen Eigenschaften.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass der Analyseschritt e) ein Verfahren umfasst, das ein Label verwendet, bevorzugt Fluoreszenzmessung, Detektion über einen absorbierenden und/oder streuenden Farbstoff, Massenspektroskopie über die Detektion eines Isotopenlabels, Detektion über ein Molekül, welches den Brechungsindex und/oder die optischen Eigenschaften der Oberfläche und/oder der Lösung ändert.
Es ist außerdem bevorzugt, dass der Analyseschritt e) ein Verfahren umfasst, das die Lösung oberhalb der Oberfläche des ersten Speichers und/oder eines der Transferspeichers analysiert, bevorzugt Trübungsmessung, Fluoreszenzmessung, Detektion eines absorbierenden
Farbstoffs und/oder Luminiszenzmessung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verwendung eines der genannten Verfahren, in einem Screeningverfahren zur Identifikation von,
Transkriptionsfaktoren, TranskriptionsefFizienz, Transkriptionsoptimierung,
Promotoreffizienz, Splicosomen, Restriktions-Substraten, Ampflifikationssystem, Codon- Optimierung, Proteinfunktionalität, Enzymfunktionalität, Enzymoptimierung, Isoenzymen, Ribozymen, Reaktionsoptimierungen und/oder Bindungsoptimierung
Das bevorzugte„Gesamt Genom-Interaktions-Screening" erlaubt die Identifikation von Wechselwirkungen auf Ebene des Genoms. Es wird eine Genomkopie eines Organismus erzeugt. Da nun sämtliche DNA dieses Organismus abgebildet ist, können nun beliebige Interaktionspartner oder Moleküle als Probemoleküle auf diesen ersten Speicher gegeben werden. Folgende Anwendungen sind dabei bevorzugt:
• Es wird DNA eines nahe verwandten Organismus oder einer Mutante hinzugegeben.
Bereiche mit Bindung, weisen auf identische DNA hin, Bereiche ohne Bindung weisen aufklare Unterschiede zwischen diesen Spezies hin. Diese Unterschiede können dann als Marker für die Speziesunterscheidung verwendet werden.
Es wird RNA oder cDNA desselben Organismus hinzugegeben. Die Intensität der einzelnen Spots zeigt an, dass es sich um ein Gen handelt und wie stark es exprimiert ist. · Es wird cDNA einer Referenz in mit einer Fluoreszenzfarbe 1 und einer behandelten Probe mit einer Fluoreszenzfarbe 2 gemischt und dann auf das Array verbracht.
Anhand der Färbung kann ermittelt werden, welches Gen wie stark aktiviert wurde.
• Es werden Proteine auf das Array gegeben. Findet eine Wechselwirkung oder eine Bindung statt, so kann diese der DNA-Sequenz zugeordnet werden. Damit lassen sich Protein als DNA-Binder identifizieren. Auch die Verwendung zum Transkriptionsfaktor-Screening auf Genomebene ist bevorzugt. Diese Methode erlaubt die Identifikation von Transkriptonsfaktoren auf Ebene des kompletten Genoms. Auf ein Gesamt-Genom-Array wird ein Transkriptionsfaktor gegeben. Durch Bindung an einzelne Spots lässt sich die Sequenzabhängigkeit des Transkriptonsfaktors ermitteln. Zudem lassen sich z.B. durch Kinetikmessungen zusätzliche Parameter wie
Bindungsgeschwindigkeit und Bindungsstärke ermitteln. Somit kann für jeden
Transkriptionsfaktor ein genomweites Profil seiner Interaktionen ermitteln.
• Wird nur ein Transkriptionsfaktor hinzugegeben, so kann dessen Profil ermittelt
werden. Durch Variation der Bedingungen wie z.B. Temperatur, pH oder Salzgehalt können auch diese Abhängigkeiten genomweit ermittelt werden.
• Werden zwei Transkriptionsfaktoren mit unterschiedlichem Label z.B. Farbe im
gleichen Verhältnis gemischt und dann auf das Array kann man anhand der Intensität der einzelnen Spots und deren Färbung auf das Zusammenspiel der
Transkriptionsfaktoren geschlossen werden. Es können Sequenzen identifiziert werden, die nur von einem, keinem oder beiden Transkriptionsfaktoren angesprochen werden. Ebenfalls ist eine Variation von Temperatur, pH, Salzgehalt etc. möglich, so dass gezielt ein Transkriptionsfaktor verstärkt oder abgeschwächt werden kann.
• Eine Mutationsanalyse kann durchgeführt werden, wenn für einen
Transkriptionsfaktor eine Mutation bekannt ist. Dann werden ebenfalls der Wildtyp und die Mutation mit unterschiedlichen Labein auf dem Array eingesetzt. Aus
Farbunterschieden lässt sich unterschiedliches Bindungsverhalten und damit
Genaktivierung analysieren.
Außerdem ist die Verwendung zum Amplifikations-Screening auf Genomebene bevorzugt. Diese Methode erlaubt ein tieferes Verständnis von Amplifikationssystemen für DNA und RNA. Auf ein Gesamt-Genom-Array werden einzelne Moleküle oder Molekülkomplexe von Amplifikationssytemen (z.B. DNA- Amplifikation wie DNA-Polymerase, Gyrase, Helikase oder RNA-Amplifikation) gegeben. Diese Moleküle binden dann bevorzugt an die Positionen, welche bei der Amplifikation notwendig sind. Diese sind beispielsweise die TATAA-Box für die RNA-Polymerase oder Replikationsgabeln für die DNA-Polmerase ebenso wie
Bindungsbereiche für Helikasen, Gyrasen etc. • Durch die Zugabe der einzelnen Cofaktoren des Amplifikationssystemes kann Schritt für Schritt entschlüsselt werden, wo (an welcher Sequenz) und in Gegenwart welcher Moleküle sich der Amplifikationskomplex assembliert.
• Durch Zugabe eines Cofaktors mit einer Farbe und eines Iso-Cofaktors oder einer Mutation mit einer anderen Farbe lässt sich anhand von Farbunterschieden feststellen, welche Gene bevorzugt amplifiziert werden. Somit kann eine Aussage über die Expression von Genen getroffen werden.
Weiterhin ist die Verwendung zum Antibiotika-Screening auf Genomebene bevorzugt. Dies ist eine spezielle Form des Amplifikationsscreenings, die dazu dient neue Antibiotika zu identifizieren und bereits bekannte genauer zu charakterisieren. Die identifizierten Antibiotika dienen als DNA- oder RNA-Amplifikations-Inhibitoren und sind daher als Bakteriostatika einzuordnen. Hierzu wird ein humanes Genom oder ein bakterielles Genom in Form von DNA erzeugt. Die DNA ist vorzugsweise sehr lang, beziehungsweise an ihren Enden so verbunden sein, dass ein„Entrollen" der DNA nur erschwert möglich ist. Es werden etliche DNA-Kopien erzeugt. Jede DNA-Kopie wird nun mit einem anderen Antibiotikum versetzt, welches die Assemblierung des DNA- oder des RNA-Amplifikationskomplexes oder das Anbinden eines Cofaktors für die DNA- oder die RNA-Polymerase unterbindet oder einschränkt.
Zur Charakterisierung von bekannten Antibiotika wie z.B. den Gyraseinhibitoren Nalidixinsäure und Ciprofloxacin gegen Topoisomerase II wird die bakterielle
Topoisomerase mit einer Farbe markiert und das humane Gegenstück mit einer anderen. Diese Proteine werden gemischt, mit dem Antibiotikum versetzt und auf das Array gegeben. Aus Farbunterschieden erkennt man umgehend, wo die bakterielle und wo die humane Amplifikation eingeschränkt ist. Anhand der Sequenzen läßt sich auf die Störung der Amplifikation bzw. der späteren Expression der Proteine schliessen. So können diverse Antibiotika aufeinander abgestimmt werden, um möglichst minimal das humane System und möglichst maximal das bakterielle System zu hemmen.
Zur Untersuchung neuer oder unbekannter Wirkstoffe werden die humanen
Bestandteile des Amplifikationssystems mit einem Farbstoff und die das bakteriellen Systems mit einem anderen Farbstoff markiert. Diese Systeme werden gemischt.
Zunächst wird eine Mischung direkt auf ein Genom-Array gegeben. Dies stellt als Referenz das ungestörte System dar. Nun wird in jede Mischung ein Wirkstoff zugegeben und untersucht, wann das humane System ungestört und das bakterielle System gestört ist. In diesem Falle kann es sich um ein neues Antibiotikum handeln. Weiterhin kann aber auch jeder Bestandteil des Amplifikationssystems einzeln mit dem neuen Wirkstoff getestet werden. So ist es möglich bereits die Untereinheit zu identifiziert, an die der Wirkstoff angreift und es kann gezeigt werden, sodass diese
Untereinheit dann nicht mehr an die DNA bindet.
Außerdem ist die Verwendung der Methode zum Splicosome-Screening auf Genomebene bevorzugt. Diese Methode erlaubt die Identifikation von Splicevarianten. Ein Gesamt- Genom-Array wird als RNA abgebildet. Diese RNA entspricht damit der prä-mRNA. Nun werden einzelne Bestandteile oder komplette Splicosome-Komplexe auf die RNA-Kopie gegeben werden. Somit lassen sich einzelne Sequenzen identifizieren, die vom Splicosom erkannt werden. Zudem ist es möglich jedem Splicosom seine genomweite Wechselwirkung zuzuordnen. Sofern von der RNA-Kopie nach Behandlung mit den Splicosomen eine DNA- Kopie angefertigt wird, ist zudem eine weitere Sequenzierung möglich. Aus Kenntnis der ursprünglichen DNA und der DNA nach der Behandlung mit dem Splicosome lassen sich tiefere Kenntnisse über die Sequenzabhängigkeit und die Splicevarianten ermitteln. Weiterhin ist es möglich durch gezielte Mutationen bzw. Zugabe von Cofaktoren bestimmte
Splicevarianten zu bevorzugen. Diese Erkenntnis kann dann z.B. bei der Kultivierung von Organismen oder der Differenzierung von Stammzellen gezielt verwendet werden, um bevorzugte Splice-Varianten zu realisieren oder favorisieren. ι
Außerdem ist die Verwendung der Methode zum„Gesamt Transkriptom-Interaktions- Screening" bevorzugt. Diese Methode erlaubt die Identifikation von Wechselwirkungen auf Ebene des Transrkiptoms. Es wird eine Transkriptomkopie eines Organismus erzeugt. Es werden Kopien in Form von DNA, cDNA als auch RNA erzeugt. Da nun sämtliche cDNA als auch RNA dieses Organismus abgebildet ist, können nun beliebige Interaktionspartner oder Moleküle auf dieses Array gegeben werden. Folgende Anwendungen sind dabei bevorzugt:
• cDNA und DNA/RNA-Kopie: Es wird DNA eines nahe verwandten Organismus oder einer Mutante hinzugegeben. Bereiche mit Bindung, weisen auf identische DNA hin, Bereiche ohne Bindung weisen auf klare Unterschiede zwischen diesen Spezies hin. Diese Unterschiede können dann als Marker für die Speziesunterscheidung verwendet werden. Zudem weiß man hierdurch, dass diese Spezies identische Oder verwandte Gene besitzen. cDNA und DNA/RNA-Kopie: Es wird RNA bzw. cDNA desselben Organismus hinzugegeben. Die Intensität der einzelnen Spots zeigt an, dass es sich um ein Gen handelt und wie stark es exprimiert ist. cDNA und DNA/RNA-Kopie: Es wird RNA bzw. cDNA eines anderen Organismus
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hinzugegeben. Bindungen weisen auf verwandte Gene und damit Proteine hin, Spots ohne Bindungen bedeuten, dass der andere Organismus nicht über die entsprechenden Gene verfügt, oder diese aktuell inaktiviert sind.
DNA/RNA-Kopie: Es wird cDNA einer Referenz in mit einer Fluoreszenzfarbe 1 und einer behandelten Probe mit einer Fluoreszenzfarbe 2 gemischt und dann auf das Array verbracht. Anhand der Färbung kann ermittelt werden, welches Gen wie stark aktiviert wurde.
• DNA-Kopie: Es werden Proteine auf das Array gegeben. Findet eine Wechselwirkung oder eine Bindung statt, so kann diese der DNA-Sequenz zugeordnet werden. Damit lassen sich Protein als DNA-Binder identifizieren und ist potentiell als Interaktionspartner in einer Form des Signalings beteiligt, indem es mit diesem
Genabschnitt interagiert.
• RNA-Kopie: Es werden Proteine auf das Array gegeben. Sofern Interaktionen
stattfinden handelt es sich damit um RNA-interagierende Proteine. Diese Proteine können z.B. Speicher für RNA sein, die zunächst angelagert ist und bei Bedarf freigesetzt wird oder innerhalb des Signalings eine Regelfunktion einnehmen.
• RNA-Kopie: Es werden siRNA auf das Array gegeben. Interagierende Punkte weisen auf siRNA-basierte Regulationsmechanismen. Durch Zugabe einzelner siRNAs oder einer 2-Farb-markrten Probe aus siRNA von stimulierten Zellen (Farbe 1) und unstimulierten Zellen (Farbe 2) lassen sich anhand der Unterschiede
Regelmechanismen ableiten.
Außerdem ist die Verwendung zum„Gesamt Proteom-Interaktions-Screening" bevorzugt. Diese Methode erlaubt die Identifikation von Wechselwirkungen auf Ebene des Proteoms. Es wird eine Proteomkopie eines Organismus erzeugt. Sofern mRNA zur Erzeugung des Originals verwendet wurde, spiegelt die Protein-Kopie das Proteom des Organismus wider. Sofern DNA zur Erzeugung des Originals verwendet wurde, sind mehr Proteine abgebildet, als im Proteom vorhanden sind. Da nun sämtliche Proteine dieses Organismus abgebildet sind, können nun beliebige Interaktionspartner oder Moleküle auf dieses Array gegeben werden. Folgende Anwendungen sind dabei bevorzugt:
Es wird DNA des Organismus oder einer Mutante hinzugegeben. Bereiche mit Bindung, stellen Proteine dar, die mit DNA wechselwirken. Dies können
beispielsweise Histone, Transkriptionsfaktoren oder DNA-reparierende Proteine etc. sein.
• Es wird DNA, RNA oder das Protein des Organismus in einer Farbe und die DNA, RNA oder Protein eines anderen Organismus oder eines Mutanten dieses Organismus einer anderen Farbe hinzugegeben. Anhand des Farbmusters lassen sich
Gemeinsamkeiten und Unterschiede klar hervorheben. Es lassen sich
Verwandtschaften ableiten. Unterschiede erlauben die Entwicklung von Markern zur klaren Identifikation der jeweiligen Spezies als auch Entwicklung von Wirkstoffen, die dann Speziesspezifisch anwendbar sind.
Weiterhin ist die Verwendung der Methode zum Wirkstoff-Screening durch Zugabe des Wirkstoffes bevorzugt. Diese Methode erlaubt die Identifikation von Wirkstoffen anhand von Bindung. Für diese Anwendungen werden Genom-, Transkriptom- und Proteom-Kopien in Form von DNA, RNA und Protein-Mikroarrays erzeugt. Ein neuer oder bereits bekannter Wirkstoff wird nun auf diese Arrays gegeben. Spots an die dieser Wirkstoff anbindet, sind potentielle Interaktionspartner dieses Wirkstoffes. Somit kann über einen kompletten
Organismus hinweg das Wirk-Profil eines Wirkstoffes erstellt werden. In Kombination mit einer Meßmethode, die eine Kinetikmessung z.B. iRIfS oder Biacore ermöglich, kann zudem auf die Bindungsstärke geschlossen werden.
• Sofern nur ein Wirkstoff hinzugegeben wird, kann von diesem das Wirkprofil
bestimmt werden. · Sofern zwei Wirkstoffe mit unterschiedlichen Markierungen wie z.B. Farbe,
zugegeben werden, kann man durch die Farbtöne auf kooperative Effekte schliessen. Durch Kontrollexperimente mit jeweils nur einem Wirkstoff kann man auf
Kompetition schliessen. Dies erlaubt dann z.B. zwei Wirkstoffe als Kombipräparat zu entwickeln bzw. festzustellen, ob beide Wirkstoffe identische Targets und
Bindungstaschen adressieren und damit nicht in Kombination verabreicht werden sollten. • Durch Zugabe zweier Wirkstoffe mit unterschiedlichem Label lassen sich Nebenwirkungen anhand von Wechselwirkungen mit nicht vorgesehenen Partnern auf Ebene der DNA, RNA oder Proteinen identifizieren und so kombinieren, dass eine möglichst große Wirkung bei möglichst kleiner Interaktion mit anderen Partnern und damit Nebenwirkungen realisieren.
Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Methode zum
Promotor-Screening. Diese Anwendung ist einzigartig. Im Stand der Technik sind bisher nur Aussagen möglich, ob ein Promotor stark oder schwach wirkt. Eine echte Quantifizierung ist nun erstmals durch die Erfindung möglich. Diese Methode erlaubt eine Untersuchung der Auswirkung der Promotorsequenz auf die Menge an erzeugtem Protein. Es wird ein DNA- Pool erzeugt. Jede DNA enthält dabei eine Promotorsequenz und codiert zudem ein Protein. Im Falle des Promotor-Screening liegt eine Variabilität in der Promotorsequenz vor. Diese Variabilität kann den natürlichen Promotoren eines oder mehreren Organismen entsprechen, artifiziell oder randomisiert sein. Sämtliche DNA-Stränge tragen eine identische Sequenzen bezüglich des codierten Proteins, d.h. beim Erzeugen einer Protein-Kopie entsteht von jeder Sequenz das identische Protein. Da die proteincodierende Sequenz identisch ist, bedeutet dies, dass die Geschwindigkeit der Proteinerzeugung einzig von der Initiierungsgeschwindigkeit der RNA-Polymerase und nicht von den Ribosomen abhängt. Dies kann bevorzugt als Molekülspeicher erfolgen, das als Sequenzierchip oder als klassisches DNA-Mikroarray ausgelegt ist. Es wird nun eine Protein-Kopie initiiert und die Menge der entstehenden Proteine direkt in Echtzeit analysiert (z.B. durch iRIfS oder Biacore). Aus diesen
Echtzeitdaten lässt sich nun ableiten, wie schnell die einzelnen Promotoren einen Start der RNA-Polymerase erlauben.
Wird nur eine RNA-Polymerase verwendet, kann ein Profil der
Induktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Promotorsequenz ermittelt werden.
• Werden für weitere Kopien z.B. andere Polymerasen eingesetzt kann ein
Sequenzprofil für diese RNA-Polymerasen erstellt werden.
Weiterhin können Co-Faktoren zugegeben werden und Änderungen in den
Erzeugungsgeschwindigkeiten ermittelt werden. Ein Sequenzierchip ist bevorzugt eine Oberfläche mit der eine Sequenzierung durchgeführt wird. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des FLX 454 Chip von Roche, da er aufgrund seines Aufbaus bereits avitäten aufweist, die für die Kopiertechnik vorteilhaft sind.
Außerdem besonders bevorzugt ist die Verwendung der Methode zum Transkriptionsfaktor- Effizienz-Screening. Eine solche Anwendung ist mit den bekannten Methoden aus dem Stand der Technik nicht möglich. Diese Methode dient der systematischen Untersuchung der Auswirkung von Transkriptionsfaktoren auf die Erzeugung von RNA bzw. Proteinen.
Identisch zu Promotor-Screening wird ein DNA-Pool verwendet, der sich nicht im Bereich der Protein-codierenden DNA, jedoch im Bereich des Promotors und des Bereichs in dem Transkriptionsfaktoren anbinden können unterscheidet. D.h. es entsteht stets das identische Protein. Da die proteincodierende Sequenz identisch ist, bedeutet dies, dass die
Geschwindigkeit der Proteinerzeugung einzig von der Initiierungsgeschwindigkeit der RNA- Polymerase und nicht von den Ribomsomen abhängt. Zunächst wird ein Original in Form eines DNA-Arrays erzeugt. Dies kann bevorzugt als Molekülspeicher erfolgen, das als Sequenzierchip oder als klassisches DNA-Mikroarray ausgelegt ist. Es wird nun eine Protein- Kopie initiiert und die Menge der entstehenden Proteine direkt in Echtzeit analysiert (z.B. durch iRIfS oder Biacore). Aus diesen Echtzeitdaten lässt sich nun ableiten, wie schnell die einzelnen Promotoren einen Start der RNA-Polymerase erlauben.
Zunächst erhält man für die erste Kopie identische Daten wie in dem Promotor- Screening. Nun werden jedoch weitere Kopien erzeugt, die durch Zugabe von
Transkriptionsfaktoren (inhibierend, als auch aktivierend) das Enzymsystem verändern. Durch die Änderungen in den Erzeugungsgeschwindigkeiten der Proteine kann nun eine Zuordnung zwischen Promotorsequenz und Stärke des
Transkriptionsfaktors erfolgen. Es ist davon auszugehen, ^dass in diesem Aufbau sehr klar Sequenzabhängigkeiten zu erkennen und diese genau zu quantifizieren sind. Diese Messung ist bisher in keinem anderen System möglich.
• Es lassen sich auch Transkriptionsfaktoren anderer Spezies verwenden und so die Interspezies-Kompatibilität der einzelnen biochemischen Mechanismen in-vitro untersuchen. Dies ist insbesondere von Interesse für die Erzeugung von zellfreien Misch-Systemen, die wiederum zur zellfreien Erzeugung von Proteinen aus DNA eingesetzt werden (unter anderem auch für die Erzeugung der Proteinkopie). Außerdem ist es bevorzugt, die erfindungsgemäße Methode zur Codon-Optimierung zu verwenden. Im Stand der Technik ist dies bisher nur mit extrem hohem Aufwand möglich. Die erfindungsgemäße Verwendung dient der Optimierung einer DNA Sequenz zur verbesserten Biosynthese. Analog zum Promotor-Screening und Transkriptionsfaktor- Effizienz-Screening wird ein DNA-Pool aufgebaut, bei dem jeder DNA-Strang eine identische Promotorsequenz trägt. Die Unterschiede zwischen den DNA-Strängen bestehen in der Protein-codierenden Sequenz. Sie codieren zwar dieselbe Aminosäurensequenz, unterschieden sich allerdings in den Codons. D.h. es wird stets dasselbe Protein erzeugt, für die Erzeugung jedoch unterschiedliche tRNA-Pools herangezogen. Da für die Initiierung der RNA-Polymerase stets derselbe Promotor vorgelegt wird identisch und für alle DNA- Sequenzen gleich schnell. Allerdings bedeutet die Nutzung unterschiedlicher tRNA-Pools eine unterschiedliche Synthesegeschwindigkeit. Somit hängt der Unterschied der
Erzeugungsgeschwindigkeit nur von der Codon-Sequenz ab. Zunächst wird ein Original in Form eines DNA-Arrays erzeugt. Dies kann bevorzugt als Molekülspeicher erfolgen, das als Sequenzierchip oder als klassisches DNA-Mikroarray ausgelegt ist. Es wird nun eine Protein- Kopie initiiert und die Menge der entstehenden Proteine direkt in Echtzeit analysiert (z.B. durch iRIfS oder Biacore). Aus diesen Echtzeitdaten lässt sich nun ableiten, welche
Codonwahl für eine schnelle Synthese optimal sind. Diese Ergebnisse sind insbesondere von Interesse, wenn es um Optimierung von„Codon Usage" bei der Erzeugung rekombinanter Proteine in Zellen geht.
Außerdem ist es bevorzugt die Methode der Erfindung zum globalen Antibiotika-Screening durch direkte Inhibition einzusetzen. Diese Methode dient ebenfalls der Identifikation von Antibiotika. Anstatt wie bei dem beschriebenen Antibiotika-Screening auf Genomebene die Assemblierung der humanen und bakteriellen Amplifikationskomplexe in Gegenwart der Antibiotika untersuchen werden, wird ein Original verwendet, welches humane und bakterielle DNA enthält (inkl. Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und
Promotorsequenzen). Von diesem DNA-Original werden zunächst identische DNA-Kopien erzeugt. Dann werden zellfreie Expressionssysteme (humane und bakterielle) jeweils mit einem Wirkstoff versetzt und eine Protein-Kopie von der DNA-Kopie erzeugt. Es wird dabei quantitativ analysiert, wie viel von welchem Protein entsteht. Sofern einer der Wirkstoff in irgendeiner Weise die Erzeugung von Protein oder die vorgelagerte Amplifikation von RNA stört, wird sich dies durch Verringerung oder Ausbleiben des entsprechenden Protein-Spots bemerkbar machen. Wirkstoffe, die Sequenzabhängig und/oder Expressionssystemabhängig die Protein-Erzeugung hemmen oder unterbinden zeigen sich durch Ausbleiben oder Abschwächen einzelner Spots bzw. Ausbleiben oder Abschwächen der kompletten Protein- Kopie. Wirkstoffe, die das bakteriellen System hemmen und das humane nicht beeinflussen, sind somit potentielle Antibiotika, die in direkter Weise die Proteinerzeugung in Bakterien hemmen. Die so identifizierten Wirkstoffe können dann detailliert in einem
Wirkstoffscreening unterzogen werden.
Auch bevorzugt ist die Verwendung der Methode zum globalen Antibiotika-Screening durch Substrat-Inhibition. Diese Methode dient ebenfalls der Identifikation von Antibiotika. Anstatt wie beim Antibiotika-Screening auf Genomebene die Assemblierung der humanen und bakteriellen Amplifikationskomplexe in Gegenwart der Antibiotika zu untersuchen, wird ein Original verwendet, welches humane und bakterielle DNA enthält (inkl. Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und Promotorsequenzen). Nun werden wahlweise DNA, RNA und Protein-Kopien erzeugt. Für die Erzeugung der jeweiligen Kopie werden in die jeweiligen Enzymmixe substituierende Moleküle für die originalen Monomere„zugesetzt". Diese Substituenten werden dann potentiell anstelle originaler Monomere in die DNA, RNA oder Proteine eingebaut. Von den erzeugten Kopien auf Ebene der RNA bzw. DNA werden dann nochmals Proteinkopien erzeugt. Sofern einer der eingesetzten Substituenten eine
inhibierende Wirkung besitzt, wird sich dies dadurch zeigen, dass kein oder weniger Protein erzeugt wird, als im Vergleich zu den unsubstituierten Enzymgemischen. Sofern an einzelnen Positionen weniger Protein entsteht kann auf ein sequenzspezifisches Inhibieren geschlossen werden. Sofern generell weniger oder kein Protein entsteht, ist von einer systematischen Inhibierung der Protein-Synthese auszugehen. Die so identifizierten Substituenten können dann nochmals in-vitro und in- vivo auf ihre Wirkung untersucht werden. Sofern die
Inhibierung verstärkt beim bakteriellen System auftritt, handelt es sich um potentielle Antibiotika. Besonders bevorzugt ist weiterhin die Verwendung der Methode zum Substituenten-
Screening. Auch diese Anwendung ist im Vergleich zum Stand der Technik einzigartig, da man bisher jeden Substituent einzeln herstellen musste. Ein Kopierprozess wurde in diesem Zusammenhang noch nicht beschrieben. Diese Methode erlaubt es Aktivatoren, Inhibitoren und gleichwertige Ersatzstoffe aufzufinden. Hierzu werden für einen Rezeptor oder
Bindungspartner die entsprechenden molekularen Domänen auf Ebene der DNA codiert und die diese DNA-Sequenzen in Form eines DNA-Arrays als erster Speicher vorgelegt.
Vorzugsweise als Molekülspeicher. Dann werden von diesem Original Kopien in Form von DNA, RNA oder Protein erzeugt. Bei den entsprechenden Enzymsystemen werden Monomere vorzugsweise komplett subsituiert. Dies führt dazu, dass anstelle des ursprünglichen Monomers nur noch die Substitution eingebaut wird. Es werden mehrere Kopien mit jeweils anderen Substituenten erzeugt. Danach wird der Rezeptor auf die einzelnen Kopien gegeben und sowohl die Bindung, als auch dessen Aktivierung vermessen. Spots, die keinerlei Bindung mehr aufweisen haben keinerlei Wirkung. Spots mit Bindung, aber ohne Änderung der Aktivität beinhalten ein Molekül, welches als Ersatzstoff verwendet werden kann. Spots mit erhöhter bzw. erniedrigter Aktivität beinhalten Moleküle, die als Aktivatoren bzw. Inhibitoren verwendet werden können. Folgende Anwendungen der Substitution sind dabei bevorzugt:
• Durch Einbau von unnatürlichen DNA, RNA oder Aminosäure-Bausteinen kann die Aktivität des Moleküls verbessert/gemindert werden oder ein Ersatzstoff für das bisherige Molekül gefunden werden.
Durch den Einbau der Substituenten können molekulare Eigenschaften verändert werden. Dies bezieht sich vor allem auf Löslichkeit, Toxizität, pH- und
Temperaturstabilität, Ladung, Stabilität gegen Proteasen, DNasen oder RNasen.
• Bei gleicher Aktivität, aber verlangsamtem Abbau oder Metabolismus kann der
gefundene Wirkstoff in geringerer Dosis verabreicht werden.
• Nebenwirkungen lassen sich dadurch reduzieren, dass zusätzliche Interaktionen, welche für die Nebenwirkungen ursächlich sind ebenfalls mit getestet werden und die Substituenten so gewählt werden, dass diese Interaktionen bei gleichbleibender Aktivität geringer werden.
Außerdem bevorzugt ist die Verwendung in einem Wachstumsfaktor-Substituenten- Screening. Diese Methode stellt einen Spezialfall des Substituenten-Screenings dar.
Wachstumsfaktoren insbesondere EGF und VEFG sind im Falle von Tumorzellen meist hochaktivierend. Dahingehend ist es von besonderem Interesse, Moleküle zu finden, welche an den EFG- bzw. den VEGF-Rezeptor binden. In diesem besonderen Falle darf der Rezeptor sogar anfänglich aktiviert werden, da ein weiteres Enzymsystem einen längere Zeit aktiven Rezeptor deaktiviert. Sofern durch das Verbleiben des Binders im oder am Rezeptor keine erneute Aktivierung stattfindet, bleibt dieser permanent deaktiviert. Dies bedeutet, dass sich das Wachstum des Tumors verlangsamt und in Kombination mit einer Therapie die
Heilungsaussicht deutlich verbessert. Hierzu werden auf DNA-Ebene bekannte und vermutete Interaktionspartnern des EGF-, des VEGF- und sonstiger Wachstumfaktor-Rezeptoren codiert. Diese Interaktionspartner sind hauptsächlich Proteine. Daher wird zunächst ein DNA-Array als Original, vorzugsweise in Form eines Molekülspeichers, hergestellt. Dann werden Enzymgemische zur Erzeugung einer Proteinkopie hergestellt, bei denen mindestens eine Aminosäure abgereichert und durch eine artiflzielle andere Aminosäure ersetzt wurde oder bei denen ein Codon mit einer anderen artifiziellen Aminosäure ersetzt wird. Dies bedeutet, dass die Proteinkopie anstelle der ursprünglichen Aminosäure nun überall die artifizielle Aminosäure trägt. Diese Moleküle haben prinzipiell die gleiche oder eine ähnliche 3 D-Struktur und sind somit potentiell Interaktionspartner der Rezeptoren. Nun wird auf die Proteinkopie der Rezeptor gegeben und geprüft ob eine Bindung stattfindet. Dies kann direkt durch eine Echtzeitmessung wie iRIfS oder Biacore erfolgen. Nach der Bindung wird die Aktivität des gebundenen Rezeptors vermessen. Im Falle des EGF- bzw. des VEGF-Rezeptors kann dies durch eine
Phosphorylierungsreaktion nachgewiesen werden. Hierzu wird auf die Kopie, an die der Rezeptor bereits gebunden ist radioaktives ATP gegeben. Aktive Rezeptoren setzen dieses um und binden die Radioaktivität an sich. Mittels Autoradiografie (Auflegen eines Fotofilmes, nachfolgende Entwicklung und Analyse der Schwärzung des Filmes) kann quantifiziert werden, wie viel ATP angebunden wurde und wie aktiv der Rezeptor ist. Somit kann beurteilt werden, ob eine Bindung stattfand und wie sich dies auf die Aktivität des Rezeptors auswirkte. Anhand des DNA-Originals kann die zugehörige Protein-Sequenz und anhand des Zusatzes in der Proteinkopie kann die zugehörige artifizielle Aminosäure ermittelt werden. Somit ist bekannt welcher Substituent eine aktivierende oder inhibierende Wirkung hat und kann potentiell als Tumormedikament oder Wachstumsmittel eingesetzt werden.
Auch die Verwendung zum Enzym-Screening zeigte besondere Vorteile und ist daher bevorzugt. Diese Anwendung erlaubt aus einer Vielzahl von Enzymen, jene auszuwählen, welche die vorteilhaftesten Eigenschaften besitzen. Hierzu werden sämtliche in Frage kommenden Enzyme auf Ebene der DNA codiert und ein DNA-Array, bevorzugt als
Molekül-Speicher, als Original erzeugt. Dies entspricht einer Pool-Kopie, wie zuvor beschrieben. Es können aber auch Zellkulturen oder Mikroorganismen gezielt mit einem Substrat angezogen werden, welches umgesetzt werden muss, damit diese überleben. Hierzu kennt man meist das originäre Enzym und erlegt den Organismen einen kombinierten Mutations-Selektionsdruck auf. Die DNA-Sequenz des fraglichen Enzyms wird so durch Mutationen verändert. Diese Mutationen sind jedoch meist nur geringfügig und die DNA bleibt einer gezielten PCR zugänglich, so dass ein DNA-Original entsprechend der Populations-Kopie einer Population an Organismen erzeugt werden kann, welche Mutationen im fraglichen Protein/Enzym aufweisen. Mittels einer Proteinkopie werden nun die Enzyme als Array erzeugt. Durch Zugabe des gewünschten Substrates des Enzyms und unter
Verwendung einer Nachweisreaktion, welche mit der Enzymaktivität bzw. dem Umsatz des Substrates korreliert kann die Aktivität jedes Enzyms festgestellt werden. Folgende
Anwendungen sind dabei besonders bevorzugt:
• Es werden unterschiedliche Substrate zu den einzelnen Kopien gegeben und der
Stoffumsatz des Substrates an den jeweiligen Spots erfasst. Hierdurch erhält man für jedes der erzeugten Enzyme ein Profil über die Substratspezifität sowie die Aktivität. · Es wird innerhalb eines Eigenschaftsspeicher überall dasselbe Enzym eingesetzt.
Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften an den unterschiedlichen Positionen z.B. unterschiedlicher pH- Wert, Salzgehalt oder Temperatur kann erfasst werden, bei welchen Bedingungen das Enzym optimal arbeitet.
Auch die Verwendung zur Enzym-Optimierung ist bevorzugt. Sofern ein Enzym bereits bekannt ist, kann dieses nun optimiert werden. Hierzu wird die codierende DNA des Enzymes an einzelnen Positionen systematisch oder zufällig verändert, so dass einzelne oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht werden. Dieser erzeugte DNA-Pool wird dann entsprechend der Pool-Kopie als DNA-Original erzeugt und dann mittels der Proteinkopie entsprechende Protein-Mikroarrays erzeugt, die dann sämtliche gewünschten Mutationen des Enzymes beinhalten. Dann wird die Kopie mit dem Substrat des Enzymes inkubiert. Enzym-Varianten mit hoher Aktivität setzen dieses Substrat dann um und erzeugen so schneller ein Signal als weniger aktive Enzyme. Anhand der Sequenzierung des Originals oder einer DNA-Kopie kann dann das aktivste Enzym ausgewählt werden. Des Weiteren ist es möglich diverse Kopien unter unterschiedlichen Bedingungen zu testen, so dass auch hier wiederum ein Profil jedes Enzyms erstellt werden kann.
Außerdem ist es bevorzugt die Methode der Erfindung zum Stabilitäts-Screening zu verwenden. Diese Methode dient zu verbesserten„Haltbarkeit" von Molekülen bzw. höherer Beständigkeit gegen äußere Einflüsse sowie zersetzenden Umgebungsbedingungen wie auch enzymatischer Aktivität. Hierzu können vier Strategien verfolgt werden: · Das ursprüngliche Molekül wird systematisch oder zufällig an einzelnen oder
mehreren Positionen mutiert, so dass ein monomer ausgetauscht wird. • Einzelne der natürlichen Monomere werden gezielt durch artifizielle Monomere ersetzt.
• Ein chemischer Bestandteil der Monomere wird so verändert, dass er das gesamte Molekül stabilisiert. · Das ursprüngliche Molekül wird verkürzt bzw. mit flankierenden Sequenzen
verlängert, um dadurch eine höhere Stabilität zu erreichen.
Unabhängig ob es sich bei dem Molekül um DNA, RNA oder Protein handelt lassen sich alle drei Strategien getrennt oder gemeinsam anwenden. Sofern sich die Stabilität durch eine Bindung nachweisen läßt, kann ein Pool von bis zu 10A15 oder mehr diversen Molekülen dazu verwendet werden, um noch bindende Moleküle anzureichern. Es ist davon auszugehen, dass stabilere Moleküle ihre Bindungsfähigkeit länger aufrecht erhalten können. Der verbleibende Pool sollte so viele Moleküle enthalten, dass eine Pool-Kopie erzeugt werden kann. Diese wird zunächst auf Ebene der DNA realisiert. Je nach gewünschtem Molekül werden dann DNA, RNA oder Protein^Kopien erzeugt. Diese Kopien können dann unterschiedlichen zersetzenden Einflüssen wie hoher/tiefer pH, aggressiven Chemikalien, hohen Temperaturen, enzymatischen Aktivitäten etc. ausgesetzt werden. Dabei wird jeder Spot des kopierten Mikroarrays analysiert und dessen Zersetzung in Echtzeit vermessen. Stabile Moleküle zeichnen sich durch eine deutlich langsamere Zersetzung aus.
Auch die Verwendung zur DNase/RNase-Stabilisierung ist bevorzugt. Diese Methode dient zur Erhöhung der Haltbarkeit von DNA und RNA. Hierzu können folgenden Strategien angewandt werden:
Das ursprüngliche Molekül wird mit flankierenden Sequenzen verlängert, um dadurch eine höhere Stabilität zu erreichen. Durch die flankierenden Sequenzen bilden sich Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die von RNasen und DNasen nicht mehr angreifbar sind.
Einzelne der natürlichen Monomere werden gezielt durch artifizielle Monomere ersetzt. Hierbei kann eines der vier Bausteine durch eine artifizielle DNA- oder RNA- Base ersetzt werden.
• Ein chemischer Bestandteil der Monomere wird so verändert, dass er das gesamte Molekül stabilisiert. Im Falle von RNA- und DNA- sind sogenannte PNAs sehr bekannt. Hierbei kann das Phosphat gegen eine Aminosäure ausgetauscht. Dieser Austausch schützt vor Zersetzung durch R asen und DNasen, erlaubt aber noch volle Funktionalität. Aber auch andere Modifikationen der Zucker, der Phosphate oder der Basen sind anwendbar. Hierzu wird die originale DNA-Sequenz bzw. RNA-Sequenz mit flankierenden Sequenzen versehen. Diese werden systematisch oder einem zufallsbedingten Prozess generiert. Die entstandenen Varianten werden als Pool-Kopie in Form eines DNA-Arrays als Original erzeugt. Dann werden mehrere Kopien in Form von DNA- oder RNA-Mikroarrays erzeugt. Bereits bei der Erzeugung der Kopien kann jeweils andere artifizielle Monomere zugesetzt, oder nach Erzeugung der Kopie chemische Modifikationen vorgenommen werden. Optional kann bereits während der Erzeugung noch ein Label eingebracht werden, welches die Intaktheit des kompletten DNA- bzw. RNA-Stranges nachweist (z.B. Fluorophore oder ein Fluorophor-Quencher-Paar). Die erzeugten Kopien werden nun dem zersetzenden Einfluss ausgesetzt. Im Falle von RNasen bzw. DNasen werden diese direkt auf die Mikroarrays gegeben. DNA- bzw. RNA-Stränge von geringer Stabilität zersetzen sich, was sich im Falle von eingebauten Fluorphoren durch eine Fluoreszenzabnahme bemerkbar macht (im Falle eines Fluorophor-Quencher-Paares durch Fluoreszenz-Zunahme). Innerhalb eines Arrays kann so sequenzspezifisch die Stabilität der einzelnen flankierenden Sequenzen ermittelt werden. Werden Spots mit gleicher Sequenz auf verschiedenen Arrays miteinander verglichen, so kann über die stabilisierende Wirkung der einzelnen Monomere oder chemischen Modifikationen eine Aussage getroffen werden. Aus der Kombination von Sequenzabhängigkeit, Substitution einzelner Monomere und chemischer Modifikation kann ein möglichst stabiler DNA- bzw. RNA-Strang abgeleitet werden.
Auch die Protein-Stabilisierung ist ein bevorzugtes Anwendungsgebiet. Diese Methode dient zur Erhöhung der Haltbarkeit von Proteinen. Hierzu können folgenden Strategien bevorzugt angewandt werden:
• Das ursprüngliche Protein wird mit flankierenden Sequenzen verlängert, um dadurch eine höhere Stabilität zu erreichen. Durch die flankierenden Sequenzen bilden sich Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die von Proteasen nicht mehr angreifbar sind oder Bereiche des Proteins abdecken, die sonst angreifbar sind.
• Einzelne der natürlichen Aminosäuren werden gezielt durch artifizielle Aminosäuren ersetzt, die dann von Proteasen nicht mehr abbaubar sind. • Ein chemischer Bestandteil der Aminosäuren wird so verändert, dass er das gesamte Molekül stabilisiert. Beispielsweise ist hier eine chemische Modifikation der
Peptidbindung denkbar.
Hierzu wird die originale Protein-Sequenz in Form von codierender DNA angefertigt und bei Bedarf mit flankierenden Sequenzen versehen, bzw. einzelne oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht. Diese Variationen werden systematisch oder einem zufallsbedingten Prozess generiert. Die entstandenen Varianten werden als Pool-Kopie in Form eines DNA-Arrays als Original erzeugt. Dann werden mehrere Kopien in Form von Protein-Mikroarrays erzeugt. Bereits bei der Erzeugung der Kopien kann jeweils artifizielle Aminosäuren zugesetzt, oder nach Erzeugung der Kopie chemische Modifikationen vorgenommen werden. Optional kann bereits während der Erzeugung noch ein Label eingebracht werden, welches die Intaktheit des Proteins nachweist (z.B. Fluorophore oder ein Fluorophor-Quencher-Paar). Innerhalb eines Arrays kann so sequenzspezifisch die Stabilität der einzelnen flankierenden Sequenzen oder Aminosäure- Austausch-Positionen ermittelt werden. Werden Spots mit gleicher Sequenz auf verschiedenen Arrays miteinander verglichen, so kann über die stabilisierende Wirkung der einzelnen Monomere oder chemischen Modifikationen eine Aussage getroffen werden. Aus der Kombination von Sequenzabhängigkeit, Substitution einzelner Aminosäuren und chemischer Modifikation kann ein möglichst stabiles Protein abgeleitet werden.
Außerdem ist die Verwendung zur Antikörper-Stabilisierung bevorzugt. Diese Methode erlaubt die Stabilisierung von Antikörpern. Antikörper werden zunehmen im therapeutischen und diagnostischen Bereich eingesetzt. Hierzu ist eine Langzeitlagerbarkeit von Vorteil. Daher wird die originale DNA-Sequenz, die den Antikörper codiert in den Positionen variiert, die nicht für die Bindungsfähigkeit des Antikörpers gegen das Antigen ausschlaggebend sind. Die Variationen können gezielt oder zufallsbedingt eingefügt werden. Danach wird der so erzeugte DNA-Pool als DNA-Original erzeugt. Davon werden dann Protein-Kopien angefertigt. Diese Protein-Mikroarrays stellen eine Mutations-Bibliothek des originalen Antikörpers dar. Eine der Kopien wird zur Bindungsanalyse eingesetzt, um nachzuweisen, dass die verwendeten Mutationen keinen Einfluss auf die Bindefähigkeit des Antikörpers haben. Dann werden die Kopien eingelagert und in regelmäßigen Zeitabständen je ein Satz Kopien auf Bindung getestet. Somit kann ermittelt werden, welche Variante des Antikörpers auch nach langer Lagerzeit noch hohe Aktivität aufweist. Parallel hierzu kann auch das Antikörper- Array verschiedenen Proteasen ausgesetzt werden, um festzustellen wie stabil welche Variante gegen Zersetzung durch Proteasen ist. Aus den Ergebnissen kann eine optimierte langzeitstabile Antikörpersequenz abgeleitet werden.
Auch die Verwendung der Methode zum Substrat-Screening ist besonders bevorzugt. Mittels dieser Anwendung kann für ein vorgegebenes Enzym festgestellt werden, welche Art von Substrat es auf Ebene von DNA, RNA oder Protein umsetzen kann. Hierzu werden zunächst sämtliche bekannten Substrate auf Ebene der DNA codiert und zusätzlich noch Mutationen in diese Substrate eingebracht. Der entstehende DNA-Pool als DNA-Original gefertigt. Dann werden je nach benötigtem Substrat Kopien in Form von DNA, RNA oder Protein- Arrays gefertigt. Bereits hier kann bei der Herstellung eine Signalerzeugung integriert werden. Beispielsweise können zufällig, oder endständig, Fluorophore eingebaut werden oder ein Fluorophor-Quencherpaar erzeugt werden Dies kann beispielsweise durch ganzflächiges Anbringen eines Flurophors an der Oberfläche realisiert werden. Die erzeugten Moleküle tragen dann den Quencher endständig, mit möglichst großer Distanz zur Oberfläche. Auf die erzeugte Kopie kann dann das Enzym gegeben werden. Je nach Klasse des Enzyms kann ein entsprechendes Signal generiert werden, welches die Enzymaktivität dadurch nachweist, dass der jeweilige Spot des Mikroarrays verändert wurde. Bei einer Aufspaltung des Substrates kann beispielsweise ein Fluorophor oder ein Quencher abgespalten werden, bei einer Redoxreaktion kann ein Farbstoff verändert werden oder bei einer Ligation kann ein
Fluorophor oder ein Quencher eingefügt und damit die Fluoreszenz verändert werden. Spots, die sich verändern sind somit ein Substrat des jeweiligen Enzyms. Da anhand des Originals oder einer DNA-Kopie die Sequenz festgestellt werden kann, kann man auf die jeweilige DNA, RNA oder Protein-Sequenz zurück schließen. Somit kann die Bandbreite der Substrate für ein Enzym ermittelt werden.
Auch die Verwendung der Methode zum Protease-Screening ist bevorzugt. Mit dieser Methode lassen sich für unterschiedliche Proteasen die entsprechenden Proteine finden, die von diesen zerschnitten werden. Insbesondere die Sequenzabhängigkeit von flankierenden Sequenzen kann ermittelt werden. Hierzu kann wahlweise ein DNA-Pool an
Substratcodierender DNA erzeugt werden, oder es kann ein Gesamt-Genom, ein Gesamt- Transkriptom oder ein Gesamt-Proteom-Array hierzu verwendet werden. In jedem Falle liegt zunächst auf DNA-Ebene ein Original vor. Von diesem werden dann mittels Proteinkopie entsprechende Kopien in Form von Protein erzeugt. Die Kopie wird dann mit der Protease inkubiert. Sofern ein Spot ein Protein enthält, welches von der Protease zersetz wird, wird dort ein Signal generiert. Dies kann beispielsweise durch Zunahme der Fluoreszenz erfolgen, wenn ein Quencher abgespalten wird oder durch Abnahme von Fluoreszenz, wenn eingebaute oder endständige Fluorophore abgespalten werden, da die Proteinkette abgebaut wird. Anhand der Vergleiche der DNA-Sequenz und die daraus abgeleitete Protein-Sequenz läßt sich dann ermitteln, welche Proteine von der Protease zersetzt werden. Sofern eine Detektion der Kinetik möglich ist lassen sich zudem Aussagen treffen, wie stark flankierende Sequenzen oder eine Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere die katalytische Aktivität der Protease beeinflußt. Sofern eine Gesamt Proteom-Kopie verwendet wurde, kann man eine Aussage treffen welche Proteine des Proteoms von dieser Protease zersetzt werden.
Außerdem ist die Verwendung der Methode zum Kinase-Substrat-Screening bevorzugt. Mit dieser Methode lässt sich ein Substratprofil für Kinasen anfertigen. Insbesondere die
Sequenzabhängigkeit kann ermittelt werden. Hierzu kann wahlweise ein DNA-Pool an Protein-codierender DNA erzeugt werden, oder es kann ein Gesamt-Genom, ein Gesamt- Transkriptom oder ein Gesamt-Proteom-Array hierzu verwendet werden. In jedem Falle liegt zunächst auf DNA-Ebene ein Original vor. Von diesem werden dann mittels Proteinkopie entsprechende Kopien in Form von Protein erzeugt. Die Kopie wird dann mit Kinase und in einer bevorzugten Ausführungsform mit radioaktiv markiertem ATP versetzt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind andere Signalgenierungen denkbar (beispielsweise durch Fluoreszenzmarkierung, oder elektrische Detektion der pH-Veränderung während einer Phosphorylierung). Sofern ein Spot als Substrat der eingesetzten Kinase dient, wird das radioaktive Phosphat direkt an das Protein gebunden. Mittels Autoradiografie kann dann die Radioaktivität in jedem Spot quantifiziert werden. Besonders gut akzeptierte Substrate der Kinase weisen eine besonders hohe Radioaktivität auf. Somit kann für den Pool an ausgewählten Proteinen oder Proteom-weit sämtliche Substrate der Kinase erfasst werden. Sofern bei der Erzeugung der Protein-Kopien zusätzlich artifizielle Aminosäuren eingesetzt wurden kann auch hier über die Akzeptanz der Kinase für solche Substrate eine Aussage getroffen werden. Somit kann für die Kinase eine Zuordnung von Protein-Sequenz und Kinase-Aktivität getroffen werden.
Auch die Verwendung zum Phosphatase-Substrat-Screening ist besonders bevorzugt. Mit dieser Methode lässt sich ein Substratprofil für Phosphatasen anfertigen. Insbesondere die Sequenzabhängigkeit kann ermittelt werden. Prinzipiell stellt diese Methode eine Umkehrung des Kinase-Substrat-Screenings dar. Hierzu wird wahlweise ein DNA-Pool an Proteincodierender DNA erzeugt, oder es kann ein Gesamt-Genom, ein Gesamt-Transkriptom oder ein Gesamt-Proteom-Array hierzu verwendet werden. In jedem Falle liegt zunächst auf DNA- Ebene ein Original vor. Von diesem werden dann mittels Proteinkopie entsprechende Kopien in Form von Protein erzeugt. Die Kopie wird in einer bevorzugten Ausführungsform mit radioaktivem Phosphat markiert. In anderen Ausführungsform sind andere Signalgenierungen denkbar (beispielsweise durch Fluoreszenzmarkierung, oder elektrische Detektion der pH- Veränderung während einer De-Phosphorylierung). Somit trägt jeder Spot eine anfänglich hohe Radioaktivität. Sofern ein Spot als Substrat der eingesetzten Phosphatase dient, wird das radioaktive Phosphat vom Protein abgespalten. Mittels Autoradiografie kann dann die Radioaktivität in jedem Spot quantifiziert werden. Besonders gut akzeptierte Substrate der Phosphatase weisen eine besonders niedrige Radioaktivität auf. Somit kann für den Pool an ausgewählten Proteinen oder Proteom-weit sämtliche Substrate der Phosphatase erfasst werden. Sofern bei der Erzeugung der Protein-Kopien zusätzlich artifizielle Aminosäuren eingesetzt wurden kann auch hier über die Akzeptanz der Phosphatase für solche Substrate eine Aussage getroffen werden. Somit kann für die Phosphatase eine Zuordnung von Protein- Sequenz und Phasphatase- Aktivität getroffen werden. Auch dass Restriktions-Substrat-Screening stellt eine bevorzugte Anwendung dar. Mit dieser Methode kann über ein Genom hinweg geprüft werden, wo ein Restriktionsenzym
entsprechende zersetzende Aktivität entfaltet. Hierzu wird eine Gesamt-Genom-Kopie als DNA-Original erzeugt. Dieses Original wird in Form von DNA-Mikroarrays kopiert. Somit liegen sämtliche DNA-Sequenzen des Genoms vor. Spots, die vom Restriktionsenzym zersetzt werden, können mittels Zunahme von Fluoreszenz (bei Abspalten eines endständigen Quenchers) oder durch Abnahme von Fluoreszenz (durch Abspalten eines endständigen Fluorophors) erfasst werden. So kann über das gesamte Genom hinweg erfasst werden, welche Sequenzen durch das Restriktionsenzym zersetzt werden.
Außerdem bevorzugt ist die Verwendung zur Isoenzym-Differenzierung. Sofern von einem Enzym mehrere Isoenzyme vorliegen kann eine Differenzierung der Substratabhängigkeit dahingehend erfolgen, dass mittels der für das Substrat-Screening, Protease-Screening, Kinase-Substrat-Screening, Phosphatase-Substrat-Screening und/oder Restriktions-Substrat- Screening beschriebenen Methoden identische Mikroarraykopien mit jeweils einem der Isoenzyme inkubiert werden und ein Substratprofil erstellt wird. Ein Vergleich dieser Profile miteinander erlaubt es so gezielt jene Spots aufzufinden, die von einem der Isoenzyme besonders gut und von einem anderen besonders schlecht umgesetzt wird. Diese DNA- Sequenz wird dann nochmals gezielt oder zufällig an einzelnen Positionen verändert. Der entstehende DNA-Pool wird dann wiederum als DNA-Original hinterlegt und entsprechende Mikroarray-Kopien gefertigt. Diese werden nochmals je einzeln den Isoenzymen ausgesetzt. Aufgrund der erneuten Mutationen des Substrates, welches bereits die beste Unterscheidung zwischen den Isoenzymen geliefert hat, besteht rein statistisch eine gute Chance ein noch besseres Substrat zu finden, welches von einem der Isoenzymen gut und vom anderen schlecht akzeptiert wird. Somit kann man ein Substrat speziell nur für ein Isoenzym generieren.
Durch den Einbau von artifiziellen Monomeren während der Erzeugung der Kopie ist es zudem möglich nicht umsetzbare Substrate zu generieren, die nur von einem der Isoenzyme akzeptiert werden. Bei entsprechend hoher Affinität stellt dieses nicht umsetzbare Substrat einen Inhibitor für dieses Enzym dar. Dieses Auffinden von Isoenzyminhibitoren ist insbesondere bei der Medikamentenentwicklung von hohem Interesse.
Außerdem kann die Methode Ribozym-Kopie verwendet werden. Diese Methode erlaubt die Erfassung von katalytischen Aktivitäten von RNA. Ribozyme weisen katalytische Aktivität auf und besitzen Eigenschaften wie Enzyme, bestehen jedoch aus RNA. Es wird zunächst ein DNA-Pool erzeugt, der potentielle Ribozyme codiert. Dieser DNA-Pool wird in ein DNA- Original umgewandelt und dann RNA-Kopien gefertigt. Nun können auf jedes dieser Arrays je ein Substrat gegeben werden. Spots, die eine katalytische Aktivität gegenüber dem Substrat zeigen generieren ein Signal, welches in der Umsetzung des Substrates begründet ist. Dies kann z.B. die Abspaltung einer chemischen Gruppe sein, welche die Farbe des Moleküls ändert. Anhand der Sequenzierung des DNA-Originals oder einer DNA-Kopie lässt sich die Sequenz der RNA ableiten und daraus auch, welche Sequenz welche katalytische Aktivität besitzt.
Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Methode zum
Display-Screening. Ein besonderer Vorteil ist, dass dieses Screening sozusagen als „Endstufe" für alle gängigen Displays verwendet werden kann. Diese Methode stellt eine Erweiterung des Durchsatzes an analysierten Molekülen für jegliche Display-, Selektionsoder Anreicherungsmethodik für DNA, RNA oder Proteine dar. Mittels der jeweiligen Methodik, welche zumeist mit einem Pool an Molekülen startet die 10Λ9 und mehr diverse Moleküle enthält, kann ein angereicherter Pool von 10A6 oder weniger Moleküle erzeugt werden, welche die gewünschten Eigenschaften enthalten. Dieser Pool an Molekülen mit angereicherten Eigenschaften wird zu einem DNA-Pool umgeformt (RNA mittels Reverser Transkriptase zu DNA, Proteine eines Displays hängen stets mit der genierenden DNA zusammen, diese kann mittels PCR zu einem DNA-Pool arrangiert werden). Dieser DNA- Pool wird dann als Pool-Kopie gemäß bzw. Display-Kopie und/oder deren Untervarianten als DNA-Original erzeugt. Von diesem DNA-Original werden dann entsprechende Kopien in Form der benötigten Moleküle erzeugt. Diese können DNA, RNA oder Protein sein. Jede Kopie kann dann bezüglich einer anderen molekularen Eigenschaft untersucht werden. Aus der Zuordnung jedes Punktes jeder Kopie zur originären DNA-Sequenz lässt sich für jedes Individuum des DNA-Pools bzw. des ursprünglich angereicherten Pools das jeweilige Set an Eigenschaften zuordnen. Aus dieser Menge kann dann das Molekül ermittelt werden, welches die beste Kombination an gewünschten Eigenschaften aufweist. Da mittels der Kopien viele diverse Eigenschaften erfasst werden können und da eine Kopie viele einzelne individuelle Moleküle trägt, wird mit dieser Methode ein deutlich höherer Umsatz an untersuchten Molekülen generieren, als es bei bisherigen Methoden möglich ist.
Es ist auch bevorzugt, die Methode der Erfindung zum Antikörper-Screening aus artifiziellen Quellen zu verwenden. Diese Methode erleichtert das Display-Screening von Antikörper- Bibliotheken, insbesondere das Phage-Display mit Antikörpern. Aus einer Phage-Display- Bibliothek mit artifiziellen randomisierten Antikörpern oder Antikörperfragmenten wird zunächst eine Anreicherung der Phagen gegen das Antigen vorgenommen, so dass von den anfänglich oft bis zu 10A15 verschiedenen Antikörpern nur noch weniger als 10A6
unterschiedliche Antikörper und zugehörige DNA-Stränge verbleiben. Aus diesem
angereicherten DNA-Pool wird ein DNA-Original erzeugt. Das DNA-Original wird dann in Form von DNA, RNA bzw. Protein-Kopien abgebildet. Mittels Transfektionsmethoden ist es nun möglich, die DNA oder die RNA in Zellen zu transfizieren und damit diese zur
Produktion von Antikörpern anzuregen. Parallel dazu kann die Protein-Kopie, welche die Antikörper enthält auf Bindung gegen das Antigen untersucht werden. Spots, die ein besonders starkes Signal zeigen, weisen eine besonders starke Bindung gegen das Antigen auf. Aufgrund der Sequenzierung des DNA-Originals oder einer DNA-Kopie, kann auf die Aminosäurensequenz des Antikörpers geschlossen werden. Sofern DNA oder RNA wiedergewonnen wurde, kann diese direkt zur Transfektion eingesetzt werden. Somit ist es dann möglich die identifizierten, gut bindenden Antikörper direkt wieder in Zellen zu erzeugen. Diese Methode erlaubt es, wie bei allen Displaymethoden, eine Verbesserung des Durchsatzes der analysierten Moleküle zu erreichen. In diesem Falle handelt es sich um Antikörper. Vorteilhafter Weise muss nur eine einzige Anreicherung gegen das Antigen vorgenommen werden, anstelle der sonst üblichen 3 bis 4 Runden eine Phage-Displays.
Zudem erhält man zum Ende der Analyse Daten von bis zu 10Λ6 Antikörpern anstelle der üblichen 10A2 bis 10A3. Somit stellt diese Ausführungsform eine Verbesserung des bisherigen Phage-Displays mit Antikörpern dar.
Es ist auch bevorzugt, die Methode zum Antikörper-Sampling aus organischen Proben zu verwenden. Mit dieser Methode lassen sich aus Organismen gezielt Antikörper gegen Antigene identifizieren. Aus einem Organismus, der einem Antigen ausgesetzt war, werden B-Zellen gewonnen. Jede B-Zelle trägt dabei einen anderen Antikörper in sich codiert. Hierzu ist es notwendig, den variablen Sequenzteil der mRNA der leichte und die schwere Kette jeder Zelle miteinander zu verbinden. Die B-Zell-Population kann direkt als Populations- Kopie als DNA-Original erzeugt werden. Die DNA ist dann die cDNA, die sich von der mRNA des Antikörpers ableitet. Es ist aber auch denkbar, dass die Zellen zunächst physikalisch vereinzelt und aufgearbeitet werden z.B. in einer Tropfen-Emulsion und in jedem dieser Kompartimente die mRNA in cDNA umgeschrieben und dann jeweils die cDNA der leichten und der schweren Kette miteinander zu einem DNA-Strang verknüpft wird. Der so erzeugte DNA-Pool kann dann in ein DNA-Original überführt werden. In den bevorzugten Ausführungsformen sind entweder die leichte und die schwere Kette in voller Länge vorhanden (Auslegung 1) oder das erzeugte Konstrukt entspricht einem ScFv (Auslegung 2), in dem die variablen Bereiche der leichten und der schweren Kette über einen kurzen Spacer miteinander verbunden sind. In beiden Fällen wird das DNA-Original oder eine DNA-Kopie sequenziert und Protein-Kopien gefertigt. Die erzeugten Protein- Arrays enthalten die
Antikörper (in Auslegung 1) oder die ScFv- Antikörper (Auslegung 2). Diese Antikörper- Arrays werden dann mit dem Antigen inkubiert, dem der Organismus ausgesetzt war.
Antikörper gegen dieses Antigen weisen dann eine Bindung zum Antigen auf. Hierdurch kann für dieses Antigen die jeweilige Sequenz der bindenden Antikörper identifiziert und sogar eine ScFv-Bibliothek gewonnen werden. · Des Weiteren können die erzeugten Antikörper-Arrays mit unterschiedlichen
Antigenen inkubiert und geprüft werden, ob weitere Bindungsaktivitäten vorliegen.
• Ebenso kann vom infizierenden Antigen oder Organismus ein Lysat auf die
Antikörper-Arrays gebracht werden und damit sämtliche Antikörper gegen das Antigen bestimmt werden. Diese Methode besonders vorteilhaft, da sie erlaubt systematisch eine Vielzahl an
Antikörpern zu gewinnen, zu charakterisieren und für eine spätere Verwendung die DNA- Sequenz aufzuklären. Außerdem ist die Verwendung zur Antikörper-Optimierung bevorzugt. Sofern ein Antikörper gegen ein Antigen bekannt ist, kann nun dieser Antikörper in Hinblick auf seine
Eigenschaften und Bindungsfähigkeiten nochmals optimiert werden. Hierzu wird basierend auf der codierenden DNA, ein DNA-Pool erzeugt, der an bestimmten oder an zufälligen Positionen Mutationen oder Austausche enthält. Dieser DNA-Pool kann dann entsprechend einer Display-Methode bezüglich der gewünschten Eigenschaften des Antikörpers (höhere Löslichkeit, bessere Stabilität bei geändertem pH oder Salzgehalt etc.) angereichert werden und wird dann zu einem DNA-Original verarbeitet, welches dann wiederum mittels der Protein-Kopie in Antikörper- Arrays abgebildet wird. Die so erzeugten Antikörper- Arrays werden dann mit dem Antigen unter den gewünschten Bedingungen (konzentrierte Lösung, geäderter pH oder Salzgehalt etc.) inkubiert und detektiert. Der Spot mit der stärksten
Bindung stellt den Antikörper mit der besten gewünschten Eigenschaft dar. Anhand der Sequenzierung lassen sich die DNA-Sequenz und damit die Aminosäuresequenz des
Antikörpers entschlüsseln. Mit dieser Methode ist es dann möglich eine große Anzahl an Antikörpern direkt miteinander zu vergleichen und somit aus einer großen Auswahl den besten zu selektieren. Bisherige Display-Methoden sind insbesondere in der Anzahl der charakterisierten Antikörper stark limitiert, wodurch es oft dazu kommt, dass der beste Antikörper nicht erfasst wird. Durch einen höheren Durchsatz ist die Chance den besten Antikörper zu erfassen deutlich verbessert. Diese Methode erlaubt die Optimierung von Antikörpern, Antikörper-Bestandteilen oder artifiziellen Antikörpern.
Auch bevorzugt ist die Verwendung der Methode zur Antikörper-Optimierung von ScFv. Mit dieser Methode kann ein bereits existierender ScFv (single chain antibody) bezüglich seiner Verbindungskette optimiert werden. Bei ScFv liegen nur die beiden variablen bindenden Bereiche eines Antikörpers vor, welche über eine sehr kurze Verbindungskette miteinander verbunden sind. Ohne diese Verbindungskette ist die Affinität der kurzen variablen Ketten zu gering, wodurch der Komplex einfach zerfällt. Die Verbindungskette dient somit zu
Stabilisierung. Dahingehend ist es von hohem Interesse, diese Verbindungskette so zu optimieren, dass eine möglichst hohe Affinität zum Antigen erzielt wird. Daher wird ein DNA-Pool erzeugt, welcher das ScFv codiert. Die DNA ist im Bereich der variablen
Regionen stets identisch, einzig im Bereich der Verbindungskette werden in einzelnen oder mehreren Positionen gezielt oder zufällig Mutationen eingefügt. Der DNA-Pool kann wahlweise mittels einer Display-Methode angereichert werden, so dass möglichst affine ScFv codiert werden, oder direkt verwendet werden. Es wird ein DNA-Original erstellt und daraus Protein-Kopien erzeugt. Die so erhaltenen ScFv-Arrays enthalten dann sämtliche Mutationen. Auf diese Arrays wird dann das Antigen gegeben und die Bindung vermessen. Spots mit einer besonders hohen Bindung sind besonders affin gegen das Antigen. Aufgrund der
Sequenzierung des DNA-Originals oder einer DNA-Kopie kann die Aminosäuresequenz der Verbindungskette mit der höchsten Affinität ermittelt werden. Ebenso lässt sich eine
Rangliste der Affinität erstellen und diese den Sequenzen zuordnen. Aus
Ähnlichkeitsvergleichen lässt sich eine Systematik ableiten, die der jeweiligen Sequenz eine Affinität zuordnet. Diese Systematik kann für Vorhersagen von Bindungsaffinitäten von ScFv gegen andere Antigene verwendet werden. Insgesamt erlaubt die Methode eine Optimierung der Verbindungskette, indem eine Vielzahl an Varianten untersucht und eine Systematik abgeleitet wird.
Es ist außerdem besonders bevorzugt, die Methode der Erfindung zum Epitop-Screening zur Impfstoffentwicklung einzusetzen. Bevorzugt kann das Verfahren zur Gewinnung aller Peptid-Impfstoffe angewendet werden. Hierdurch ist es erstmals möglich die
Impfstoffproduktion innerhalb weniger Tage durchzuführen. Mit dieser Methode lassen sich Epitope auf Eben der DNA, RNA oder Proteine ableiten, welche als Immunogene dienten und somit zum Einsatz als Impfstoffe tauglich sind. Hierzu wird ein Organismus benötigt, welcher über ein Immunsystem verfügt. Dieser Organismus wird einem Parasiten, Bakterium, Virus (Immunogen) ausgesetzt. Im Falle, dass der Organismus überlebt, befinden sich
entsprechende Antikörper in dessen Blutbahn, die mittels einer Immunabwehr generiert wurden und den Organismus nun immun gegen das Immunogen machen. Von diesem
Organismus wird nun eine Gewebeprobe und eine Blutprobe gewonnen. Aus der Blutprobe werden die Antikörper und die B-Zellen aufgereinigt. Die Gewebeprobe wird in eine
Zellkultur überführt und nochmals mit dem Immunogen infiziert. Diese infizierte
Gewebeprobe wird dann geerntet und daraus dann ein Gesamt-Genom, Gesamt-Transkriptom und Gesamt-Proteom hergestellt. Somit enthalten die Arrays neben den für den Organismus üblichen Molekülen auch die durch Infektion entstandenen Moleküle. Auf diese Infektions- Arrays werden dann die aufgereinigten Antikörper gegeben. Sofern, auf Ebene von DNA, RNA oder Protein, Immunogene vorhanden sind, werden sich die Antikörper an diese binden. Somit stellt jeder Spot, an den die Antikörper binden ein potentielles Epitop eines
Immunogens dar. Durch Sequenzierung des DNA-Originals kann die DNA, RNA oder Proteinsequenz des Immunogens aufgeklärt werden. Zudem ist es möglich vom DNA- Original oder einer der Kopien gezielt die identifizierten Immunogene oder deren DNA freizusetzen. Daraus können dann die Immunogene aufgereinigt oder erzeugt werden. Diese Immunogene können dann auf die erhaltenen B-Zellen gegeben werden. B-Zellen, die das Immunogen binden, werden aktiviert und beginnen sich zu teilen. So kann eine Zellkultur angelegt werden, welche speziell die Antikörper produziert, welche das Immunogen abwehrt. Somit stehen für eine Impfstoffentwicklung sowohl das Immunogen selbst zur aktiven Immunisierung, als auch passende Antikörper zur passiven Immunisierung, zur Verfügung. Diese Kombination ist einmalig und erlaubt eine Impfstoffentwicklung innerhalb einer Woche.
Auch bevorzugt ist das Epitop-Screening zur Autoimmunaufklärung. Mit dieser Methode lässt sich abklären, ob es auf Ebene der DNA, RNA oder Proteine Epitope gibt, welche eine Autoimmunantwort auslösen. Das Verfahren entspricht weitgehend dem Epitop-Screening für Impfstoffe. Der Organismus, welcher über ein Immunsystem verfügt, ist der zu untersuchende Organismus selbst, der an einer Autoimmunreaktion leidet. Im jedem Falle besitzt der Organismus entsprechende Antikörper in seiner Blutbahn, die mittels einer Immunabwehr generiert wurden und den Organismus zu einer Autoimmunität induzieren. Von diesem Organismus werden nun eine Gewebeprobe und eine Blutprobe gewonnen. Aus der Blutprobe werden die Antikörper und die B-Zellen aufgereinigt. Die Gewebeprobe wird in eine
Zellkultur überführt und daraus dann ein Gesamt-Genom, Gesamt-Transkriptom und Gesamt- Proteom hergestellt. Diese Arrays enthalten sämtliche DNA, RNA und Proteine, gegen die der Organismus eine Reaktivität entwickeln kann. Auf diese Arrays werden dann die aufgereinigten Antikörper gegeben. Sofern, auf Ebene von DNA, RNA oder Protein,
Immunogene vorhanden sind, werden sich die Antikörper an diese binden. Somit stellt jeder Spot, an den die Antikörper binden ein Auto-Immunogen dar. Durch Gewinnung der
Immuno gene von den Kopien kann geprüft werden, ob sich die B-Zellen damit aktivieren lassen und damit eine Autoimmunität gegen diese Auto-Immunogene vorliegt. Sofern diese Auto-Immunogene identifiziert sind, kann eine entsprechende Therapie erarbeitet werden, so dass die Autoimmunität abgeschwächt, verlangsamt, oder gar aufgehoben wird. Diese Methode dient jedoch nur dazu die Auto-Immunogene zu identifizieren und nicht zur
Etablierung einer Therapie.
Es ist außerdem bevorzugt, die Methode der Erfindung zum Epitop-Screening zur
Allergieaufklärung zu verwenden. Mit dieser Methode lässt sich abklären, ob es auf Ebene der DNA, RNA oder Proteine bereits bekannte Epitope gibt, welche eine Allergie auslösen.
Das Verfahren entspricht weitgehend dem Epitop-Screening für Impfstoffe. Der Organismus, welcher über ein Immunsystem verfügt, ist der zu untersuchende Organismus selbst, der an einer Allergie leidet. Im jedem Falle besitzt der Organismus entsprechende Antikörper in seiner Blutbahn, die mittels einer Immunabwehr generiert wurden und den Organismus nun reaktiv gegen das Allergen machen. Von diesem Organismus wird eine Blutprobe gewonnen. Aus der Blutprobe werden die Antikörper und die B-Zellen aufgereinigt. Weiterhin wird ein DNA-Pool erzeugt, der bekannte Epitope auf Ebene von DNA, RNA oder Protein codiert. Dieser Pool wird zur Erzeugung eines DNA-Originals genutzt und davon Kopien in Form von DNA, RNA und Protein erzeugt. Da der Pool bekannte Allergene in codierter Form enthält, bestehen die Arrays aus bekannten Allergenen. Auf diese Allergen- Arrays werden dann die aufgereinigten Antikörper gegeben. Sofern, auf Ebene von DNA, RNA oder Protein,
Allergene vorhanden sind, werden sich die Antikörper an diese binden. Aufgrund der Position, an welche die Antikörper binden kann dann eine Sequenz und damit die auslösende Spezies der Allergie zugeordnet werden. Dann kann zu den B-Zellen sowohl die Allergene als auch die Spezies selbst hinzugegeben und geprüft werden, ob die B-Zellen auf die Gegenwart der Spezies reagieren. Somit kann mit diesem Verfahren mit einer sehr hohen Anzahl an molekularen Antigenen getestet werden, ob eine Allergie vorliegt und dann nochmals mittels der B-Zellen eine Gegenprüfung gemacht wird. Allerdings entgehen dieser Methode
Allergene, die bisher nicht beschrieben oder charakterisiert wurden.
Es ist außerdem bevorzugt die Methode zum Epitop-Screening zur Allergenaufklärung zu verwenden. Mit dieser Methode lässt sich abklären, ob es auf Ebene der DNA, RNA oder Proteine Epitope gibt, welche eine Allergie auslösen. Das Verfahren entspricht weitgehend dem Epitop-Screening für Impfstoffe. Hierzu wird ein Organismus benötigt, der über ein Immunsystem verfugt und von dem bekannt ist, dass dieser eine Allergie gegenüber einer bestimmten Spezies entwickelt hat. Vom Organismus wird eine Blutprobe entnommen und daraus Antikörper und B-Zellen gewonnen. Von der Spezies gegen welche die Allergie vorliegt werden Proben entnommen und daraus Gesamt-Genom-, Gesamt-Transkriptom- und Gesamt-Proteom- Arrays erzeugt. Sofern auf DNA, RNA oder Protein-Ebene Allergene existieren, sind diese in den erzeugten Arrays enthalten. Die aufgereinigten Antikörper werden nun auf die Arrays gegeben. Befindet sich darauf ein Allergen, binden die Antikörper darauf. Aufgrund der Position und der Sequenzierung lässt sich die Sequenz des Allergens ableiten. Wiedergewonnene Allergene werden dann zu den B-Zellen gegeben. Sofern die B- Zellen eine Reaktion zeigen und damit das Allergen bestätigen, kann anhand dieser Methode noch unbekannte Allergene auf Ebene von DNA, RNA oder Proteinen identifiziert werden.
Außerdem ist es bevorzugt die Methode zur Bindungs-Optimierung mittels Displays zu verwenden. Diese Methode erlaubt die Optimierung und die Ableitung einer Systematik zur Optimierung einer Interaktion zwischen einem Molekül und dessen Binder. Sofern zu einem Molekül ein DNA, RNA oder Protein-Binder bekannt ist, kann dieser in Form einer kombinatorischen DNA-Bibliothek variiert werden. Dieser DNA-Pool kann bis zu 10Λ15 unterschiedliche Moleküle enthalten und wird daher mittels einer Display-Methode auf weniger als 10A6 Binder mit hoher Affinität eingeschränkt. Dieser DNA-Pool kann dann zur Erzeugung eines DNA-Originals herangezogen werden. Entsprechende Kopien in Form von DNA, RNA oder Protein werden dann erzeugt und das Molekül auf diese Arrays gegeben. Spot, die einen besonders starken Binder tragen, werden besonders viel Molekül binden und damit ein sehr hohes Signal erzeugen. Da sich alle Spots des Arrays Binder-Mutanten enthalten ist zu erwarten, dass eine sehr hohe Anzahl an Bindern detektiert wird. Anhand der Sequenzierung des DNA-Originals oder einer DNA-Kopie lassen sich dann die
Sequenzinformationen mit den Affinitäten der Bindung korrelieren und Sequenzmuster ableiten, die eine Vorhersage von Affinitäten bei Veränderungen der Sequenzen zulassen. Somit ist es dann möglich einzelne Binder gezielt so zu entwerfen, dass sie exakt definierte Affinitäten oder Eigenschaften besitzen. Diese Methode erlaubt somit ein Optimierung der Bindungseigenschaften als auch eine Ableitung einer Systematik zur Vorhersage von Affinitäten für diesen Binder.
Außerdem ist es bevorzugt, die Methode zur Bindungs-Optimierung mittels Scan zu verwenden. Diese Methode erlaubt die Optimierung und die Ableitung einer Systematik zur Optimierung einer Interaktion zwischen einem Molekül und dessen Binder. Sofern zu einem Molekül ein DNA, RNA oder Protein-Binder bekannt ist, kann dieser in DNA in codierender Form systematisch oder zufällig in einer oder mehreren Positionen auf Ebene der DNA variiert werden. Die Anzahl der unterschiedlicher Bindermutanten wird dabei unter 10A6 gehalten, so dass sämtliche erzeugten Mutanten des DNA-Pools direkt in ein DNA-Original gemäß 2.2.1 übertragen werden können. Das DNA-Original wird dann je nach Binder in
DNA, RNA oder Protein kopiert und die erhaltenen Binder-Mutations- Arrays werden dann mit dem Molekül inkubiert. Es ist davon auszugehen, dass sehr viele Bindungen stattfinden werden. Die Sequenzen der jeweiligen Spots werden den Affinitäten zugeordnet und daraus eine Systematik abgeleitet. Dieses Vorgehen entspricht dem Alanin-Scan bei Proteinen, der jedoch in diesem Falle mit jedem möglichen Austausch durchgeführt werden kann. Somit ist eine deutlich größere Anzahl an Mutationen abgedeckt und die abgeleitete Systematik besitzt damit eine deutlich höhere Aussagekraft. Es ist außerdem bevorzugt, die Methode zum Proteinfunktions-Screening zu verwenden. Mit dieser Methode lässt sich auf molekularer Ebene, durch Austausch einzelner Aminosäuren abklären, welche Aminosäureposition für die Funktionalität des Proteins von Wichtigkeit ist. Sofern von einem Protein eine Funktion in Form einer Bindung oder einer Aktivität bekannt ist wird dieses in Form von codierender DNA variiert. Dabei werden systematisch oder zufällig in einer oder mehreren Positionen auf Ebene der DNA Variationen eingefügt. Die Anzahl der unterschiedlicher Mutationen wird dabei unter 10A6 gehalten, so dass sämtliche erzeugten Mutanten des DNA-Pools direkt in ein DNA-Original übertragen werden können. Das DNA-Original wird dann zu Protein kopiert. Die erhaltenen Protein-Mutationen werden dann auf Bindung oder Aktivität getestet und charakterisiert. Es ist davon auszugehen, dass sämtliche Mutanten eine Bindung oder Aktivität zeigen, die jedoch sehr stark variieren kann. Die Sequenzen der jeweiligen Spots werden der jeweiligen Aktivität der Mutante zugeordnet und daraus eine Systematik abgeleitet. Dieses Vorgehen entspricht dem Alanin-Scan bei Proteinen, der jedoch in diesem Falle mit jedem möglichen Austausch durchgeführt werden kann. Somit ist eine deutlich größere Anzahl an Mutationen abgedeckt und die abgeleitete Systematik besitzt damit eine deutlich höhere Aussagekraft. Somit lässt sich nicht nur die Aussage treffen, welche Aminosäure eine hohe Wichtigkeit besitzt und nicht durch Alanin ausgetauscht werden darf, sondern auch welche Substituenten für die bisherige Aminosäure möglich sind um die Funktionalität des Proteins zu erhalten. Auch bevorzugt ist die Verwendung zur Reaktions-Optimierung von Enzymen. Diese Methode zielt darauf ab Enzyme bezüglich ihres Umsatzes zu optimieren, indem die
Reaktionsbedingungen und Cofaktoren angepasst werden. Hierzu wird die Oberfläche eines Eigenschaftsspeichers komplett mit einem einzigen Enzym beschichtet und dann Substrat hinzugefügt. Über den kompletten Speicher hinweg wird, für jede Position die Menge des erzeugten Substrates analysiert. Anhand der Position im Speicher kann dann die optimale
Reaktionsbedingung ermittelt werden. Somit ist es möglich in nur einem einzigen Versuch bis zu 10A6 unterschiedliche Reaktionsbedingungen zu untersuchen. Dieses System wird bevorzugt dazu eingesetzt für Optimierungen von Konzentrationen an Substrat sowie bekannten Cofaktoren wie Salze, Substrat, pH und Temperatur. Sobald die optimale Reaktionsbedingung gefunden ist kann nun ein Screening mit unbekannten Cofaktoren bzw. Mutationen der Cofaktoren stattfinden. Hierzu wird ein Partikeltransferspeicher mit Partikeln befüllt, welche jeweils eine Mutante eines Co-Faktors enthalten ist. Diese Co-Faktoren sind als kombinatorisch chemische Bibliothek erzeugt worden. Es nun eine DNA-Kopie erzeugt, welche anhand ihrer Sequenzinformation eine Entschlüsselung der molekularen Struktur des Co-Faktors zulässt. Dann wird der Speicher mit dem Enzym und Substrat unter optimierten Bedingungen befüllt. Es wird nun vermessen welcher Cofaktor nun zu einem verbesserten Umsatz führt. Anhand der Sequenzierung kann dann dieser Cofaktor bestimmt werden. Dieses System erlaubt also zunächst eine
Optimierung der enzymatischen Reaktion und dann noch das Screenen von bisher Mutationen eines oder mehrerer Cofaktoren. Dahingehend kann die Reaktion nochmals optimiert werden.
Auch bevorzugt ist die Verwendung zum Wirkstoff-Screening durch Zugabe des
Wechselwirkungspartners. Diese Methode erlaubt das Auffinden eines Wirkstoffes zu einem gegebenen Molekül, mit dem der Wirkstoff wechselwirken soll. Hierzu werden Partikel einer chemischen Bibliothek bereits bei der Synthese mit einem molekularen Tag versehen, welches es erlaubt jedem Partikel nach einer Sequenzierung die molekulare Struktur des darauf synthetisierten Wirkstoffes zuzuordnen. Die Partikel werden nun in einen Partikel- Transfer-Speicher überführt und es werden einige Kopien hergestellt. Die erzeugten
Mikroarrays tragen dabei entweder die Wirkstoffe oder die codierende DNA bzw. RNA.
Mittels Sequenzierung wird nun für jeden Spot des Arrays die DNA Sequenz bestimmt und damit die molekulare Struktur der Wirkstoffe berechnet. Folgende Ausführungen sind nun bevorzugt:
• Auf einzelne Wirkstoff- Arrays werden nun verschiedene Wechselwirkungspartner beispielsweise ein Binder gegeben und die Interaktion vermessen. Spots mit besonders starkem Signal interagieren besonders stark und stellen damit potentiell stark wirkende Wirkstoffe dar. Nach einer Identifikation solch einer starken Interaktion wird der Wirkstoff widergewonnen oder erneut synthetisiert und dann nochmals die Interaktion mit klassischen Methoden validiert. · Der Wechselwirkungspartner kann jedoch auch zuvor mit seinem natürlichen
Interaktionsmolekül oder dem bisherigen Wirkstoff versetzt werden. Wird nun dieses Gemisch auf das Wirkstoff-Array gebracht, so findet eine Kompetition statt. Nur Wirkstoffe, die eine stärkere Bindung als der Wirkstoff oder der natürliche
Interaktionspartner besitzen, können nun noch ein Signal generieren. Somit können besonders potente Wirkstoffe identifiziert werden.
Die Verwendung eines DNA- bzw. eines RNA-Tags ermöglicht aufgrund der Sequenzierung eine einfache Identifikation der molekularen Struktur. Diese ist oft von den Partikeln nur unter großem Aufwand möglich. Somit stellt diese Methode eine deutliche Vereinfach dar. Alternative Markierungsmethoden wie Massenspektrometrie- oder NMR-Tags sind ebenfalls denkbar. Hierbei wird dann eine Kopie in Form eines Massenspektrometrie- oder NMR- tauglichen Mikroarrays erzeugt. Ebenfalls ist eine Ausfuhrungsform bevorzugt, bei der die Partikel in Form von enthaltenen Chips oder Fluorophoren markiert und damit zuordenbar sind. Somit ist es mit dieser Methode möglich eine große Anzahl an Wirkstoff-Varianten zu untersuchen und aufgrund der DNA-Kopie in einfacher Weise die molekulare Struktur zuzuordnen.
Es ist außerdem bevorzugt, die Methode zur Optimierung von Wirkstoffen zu verwenden. Diese Methode entspricht prinzipiell dem bereits beschriebenen Auffinden von Wirkstoffen entsprechend dem Wirkstoff-Screening durch Zugabe des Wechselwirkungspartners.
Allerdings ist hier bereits der Wirkstoff bekannt und es wird eine kombinatorische chemische Bibliothek erzeugt, welche in sehr hohem Maße Ähnlichkeiten zum bisherig identifizierten Wirkstoff besitzt. Die Partikel der chemischen Bibliothek sind entsprechend 2.2.8 mit einem molekularen Tag versehen, welches es erlaubt jedem Partikel nach einer Sequenzierung die molekulare Struktur des darauf synthetisierten Wirkstoffes zuzuordnen. Die Partikel werden nun in einen Partikel-Transfer-Speicher überführt und es werden einige Kopien hergestellt. Die erzeugten Mikroarrays tragen dabei entweder die Wirkstoffe oder die codierende DNA bzw. RNA. Mittels Sequenzierung wird nun für jeden Spot des Arrays die DNA Sequenz bestimmt und damit die molekulare Struktur der Wirkstoffe berechnet. Folgende
Ausführungen sind nun bevorzugt:
Auf das Wirkstoff-Array wird nun der Wechselwirkungspartner beispielsweise ein Binder gegeben und die Interaktion vermessen. Spots mit besonders starkem Signal interagieren besonders stark und stellen damit stark wirkende Wirkstoffe dar. · Der Wechselwirkungspartner kann jedoch auch zuvor mit seinem natürlichen
Interaktionsmolekül oder dem bisherigen Wirkstoff versetzt werden. Wird nun dieses Gemisch auf das Wirkstoff-Array gebracht, so findet eine Kompetition statt. Nur Wirkstoffe, die eine stärkere Bindung als der Wirkstoff oder der natürliche
Interaktionspartner besitzen, können nun noch ein Signal generieren. Somit können besonders potente Wirkstoffe identifiziert werden.
Die Verwendung eines DNA- bzw. eines RNA-Tags ermöglicht aufgrund der Sequenzierung eine einfache Identifikation der molekularen Struktur. Diese ist oft von den Partikeln nur unter großem Aufwand möglich. Somit stellt diese Methode eine deutliche Vereinfach dar. Alternative Markierungsmethoden wie Massenspektrometrie- oder NMR-Tags sind ebenfalls denkbar. Hierbei wird dann eine Kopie in Form eines Massenspektrometrie- oder NMR- tauglichen Mikroarrays erzeugt. Ebenfalls ist eine Ausführungsform bevorzugt, bei der die Partikel in Form von enthaltenen Chips oder Fluorophoren markiert und damit zuordenbar sind. Somit ist es mit dieser Methode möglich eine große Anzahl an Wirkstoff-Varianten zu untersuchen und aufgrund der DNA-Kopie in einfacher Weise die molekulare Struktur zuzuordnen.
Außerdem ist bevorzugt, dass die Methode zum Virus- Angriffspunkt-Screening verwendet wird. Von einer Spezies, dem Wirt, wird die DNA und die mRNA gewonnen und daraus ein Gesamt-Genom, Gesamt-Transkriptom und ein Gesamt-Proteom erzeugt. Dann werden aus einer Gewebeprobe des Wirtes und von einem Parasiten des Wirtes die DNA, die RNA und das Protein gewonnen bzw. aufgereinigt. Die jeweiligen Proben werden mit verschiedenen Farben markiert, gemischt und jeweils auf die einzelnen Arrays gegeben. Da ein Parasit über den Wirt in irgendeiner Form molekular dominieren muss, muss es Spots geben an denen die DNA, die RNA oder das Protein besser (hoch affiner) bindet, als es beim Wirt selbst der Fall ist. Dies sind sozusagen die molekularen Angriffspunkte des Parasiten. Dies gilt insbesondere, wenn es sich dabei um einen Virus handelt. Entsprechende Spots auf Ebene der DNA, RNA oder Protein-Arrays weisen dann eine verstärkte Färbung des Parasiten auf. Diese
Wechselwirkungen zwischen Parasit und Wirt stellen die initialen Interaktionen dar, mit denen vor allem Viren eine Zelle übernehmen können, indem sie in diese eindringen oder molekulare Funktionen übernehmen bzw. ersetzen. Sofern diese Angriffspunkte genau bekannt sind, kann man exakt für diese Interaktionen nach Wirkstoffen suchen, welche die Interaktion zwischen parasitärer DNA, RNA oder Protein mit der DNA, RNA oder den Proteinen des Wirtes unterbinden oder zumindest stören. Solcherlei Wirkstoffe können dann als„Anti-Parasitikum" eingesetzt werden. Insbesondere für antivirale Wirkstoffe kann damit die Wirksamkeit einer molekularen Wechselwirkung zugeordnet werden, indem mit diesem System die Wechselwirkungspaare erstmals Genom-, Proteom- und Transkriptom-weit in einem Ansatz identifiziert werden können. Es ist bevorzugt, dass die Verwendung in einem Screeningverfahren zur Identifikation von Antibiotika, Inhibitoren von Antibiotika, Antikörperoptimierung, Antikörperstabilisierung, Antikörperisolierungen, Epitopen für Autoimmunerkrankungen, Epitopen für Allergien, Epitopen für Allergene, Epitopen für Impfungen, Wirkstoffe, Wechselwirkungspartner für Wirkstoffe, Optimierungen für Wirkstoffe, Wachstumsfaktoren, Substituenten für Wachstumsfaktoren, Optimierung von Wachstumsfaktoren und/oder Virusangriffspunkten erfolgt.
Es ist außerdem bevorzugt, dass die Verwendung in einem Screeningverfahren zur
Identifikation von Molekülstabilität, bevorzugt von DNAsen, RNAsen, Proteinen, Kinasen und/oder Phosphatasen erfolgt.
Die Vorteile der Erfindung zeigen sich vor allem in der Kombination aus erhöhtem Durchsatz aufgrund der Verwendung der Reaktionsschritte, anwendungsorientierter Erzeugung des ersten Speichers und Erzeugung von einer oder mehrerer gleichartiger oder unterschiedlicher Kopien und Zuordnung der Analysen einzelner Kopien und/oder des Originals erlauben eine Strukturaufklärung der originalen Moleküle als auch deren Derivate und Amplifikate, sowie die Zuordnung der Eigenschaften derselben. Da der Reaktionsschritt, bevorzugt der
Kopierprozess ebenfalls zur Analyse herangezogen werden kann, verbreitert sich das
Spektrum der Analysemöglichkeiten. Mit der Erfindung ist es möglich gezielt viele Moleküle zu untersuchen (von 10A2 bis 10A6 und mehr), deren Struktur zu ermitteln und Ähnlichkeiten wie Unterschiede in Struktur als auch Eigenschaft miteinander zu vergleichen. Der erhöhte Durchsatz verbessert bisher bestehende Screening- und Display-Methoden, erlaubt aber auch gänzlich neue Anwendungen.
Besondere Vorteile sind die getrennte Erfassung einzelner oder mehrerer Eigenschaften und der Struktur von Molekülen auf getrennten Mikroarrays, die voneinander durch Kopieren abgeleitet sind und damit eine„Verwandtschaft" zueinander haben. Außerdem ist die
Korrelation dieser Eigenschaften anhand der Ortsinformationen auf den Mikroarray-Kopien, so dass jedem originalen Molekül, seinen Amplifikaten und Derivaten auf den Kopien die jeweiligen Eigenschaften zugeordnet und miteinander verglichen werden können, besonders vorteilhaft. Die optionale Nutzung des Reaktions- und Transfersschrittes als Analysemethode, - um zusätzliche Eigenschaften von Molekülen oder biochemischen Prozessen zu erfassen, bringt weitere besondere Vorteile mit sich.
Durch die Erfindung konnte überraschenderweise ein Verfahren bereitgestellt werden, welches zur Analyse von molekularen Eigenschaften und/oder Reaktionsbedingungen
eingesetzt werden kann, wobei das Verfahren besonders schnell abläuft und kleinere
Volumina an Reaktionslösungen eingesetzt werden müssen. Somit können Zeit und Kosten gespart werden. Außerdem ist es durch das Verfahren möglich, einen automatisierten Prozess durchzuführen, was zusätzlich eine otenersparnis und eine Erhöhung der Effizienz mit sich bringt.
BEISPIELE Im Folgenden wird die Erfindung an einem Beispiel illustriert, ohne auf diese beschränkt zu sein.
In Figur 1 wird eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung gezeigt. Zunächst liegt ein Ausgangs-Pool 5 an Probemolekülen 11 vor. Ist die Anzahl der Moleküle in diesem Pool deutlich größer als die Menge an„Pixel", die in einem Transferspeicher bewältigt werden kann, so ist die Anzahl der Moleküle zu reduzieren. Dies kann durch eine geeignete Selektion 6 erfolgen, wie sie z.B. bei den Display-Methoden verwendet wird. Aus diesem Kopier-Pool 7, wird dann der erste Speicher 8 erzeugt (Schritt 1). Das Original ist eine räumlich feste Anordnung der Moleküle des Kopierpools. Jeder Position auf dem Original ist dabei in eindeutiger Weise mit einem oder mehreren Molekülen verknüpft. Dieses Original wird in geeigneter Form„kopiert" (Schritt 2). Dabei sind verschiedene Kopien 9a, 9b, 9c,... möglich. Anschließend können sowohl Original als auch Kopie beziehungsweise der Kopierprozess selbst analysiert werden (Schritt 3).
In Figur 2 ist ein Partikelspeicher 10 a - d als erster Speicher 8 gezeigt. Partikel 4 mit Molekülen 11 werden an die Oberfläche angelagert und verbleiben dort. Dabei können die Partikel auf einer planaren Oberfläche 10a, in einer Struktur 10b, zwischen Strukturen 10c oder auf Strukturen lOd angelagert werden.
Figur 3 zeigt die schematische Zeichnung eines Partikel-Transferspeichers. Es wird gezeigt, wie Partikel 9 mit Molekülen 11 an die Oberfläche angelagert werden und dort verbleiben. Dabei können die Partikel auf einer planaren Oberfläche 12a, in einer Struktur 12b, zwischen Strukturen 12c oder auf Strukturen 12d angelagert werden. Dann wird mindestens eine Sorte Moleküle mittels einer Abspaltung, einer Amplifikation oder einer Derivatisierung auf die Oberfläche des Speichers übertragen.
Figur 4 zeigt die schematische Zeichnung eines bevorzugten Molekülspeichers. Moleküle 11 werden auf den Speicher verbracht. Dies kann durch einen Dispensiervorgang erfolgen und so zu einer räumlichen Anordnung der Moleküle führen 13a-c. Weiterhin können durch einen Flüssigkeitskontakt oder eine Befüllung die Moleküle auf die Oberfläche 14a, in Strukturen 14b oder auf Strukturen 14c verbracht werden, insbesondere wenn Bindungsbereiche 17 der Oberflächen bevorzugte Bindungsstellen für die Moleküle darstellen. In der gezeigten bevorzugten Ausführungsform befindet sich ein Molekül auf solch einem Bindungsbereich 17. Mittels einer anschließenden Amplifikation 15a-c und einer optional nachfolgenden
Derivatisierung 16a-c, kann das ursprüngliche Molekül 11 ortsaufgelöst vervielfacht werden, insbesondere dann, wenn die Bereiche 17 der Oberfläche für die Amplifikation oder
Derivatisierung förderlich oder essentiell sind. Je nach Ausführungsform sind dann identische Moleküle 11 bei 13a-c, 14a-c sowie 15a-c) oder Derivate 18 bei 16a-c auf der Oberfläche verankert. Jede dieser Ausführungsformen 13 bis 16 kann dabei als Molekülspeicher dienen und in einer späteren Amplifikations- und/oder Derivatisierungsreaktion Moleküle für die Erzeugung einer Kopie freisetzen oder erzeugen.
Figur 5 zeigt eine schematische Zeichnung des Eigenschaftsspeichers. Jede Ortsposition des Eigenschaftsspeichers verfügt über unterschiedliche Eigenschaften. Diese Unterschiede können durch Geometrie 19a & 19b, Materialwahl 20, Oberflächenbeschichtung 21, integrierte Mikrofluidik 22 oder Mikroelektronik 23, durch Unterschiede in der Flüssigkeit, die durch den Befüllvorgang 24 selbst entstehen können oder durch zusätzlich eingefüllte Partikel/Moleküle 25/26 erzeugt werden, welche die chemische oder physikalische
Umgebung verändern. Figur 6 zeigt eine schematische Zeichnung der Übertragungskopie. Vom Original 8 werden Moleküle 11 freigesetzt und auf die Kopieroberfläche 9 übertragen. Dadurch nimmt die Anzahl der Moleküle im Original ab.
Figur 7 zeigt eine schematische Zeichnung der Amplifikationskopie. Von den Molekülen 11 des Originals werden Amplifikate 20a erzeugt und diese dann auf die Kopie übertragen. Figur 8 zeigt eine schematische Zeichnung der Derivatisierungskopie. Die Moleküle 11 des Originals werden derivatisiert 18 und dann auf die Kopieroberfläche 9 übertragen.
Figur 9 zeigt eine schematische Zeichnung der Eigenerzeugungskopie. Die Moleküle 11 des Originals weisen unter geeigneten Bedingungen eine Reaktivität auf, die dazu genutzt werden kann, um Amplifikate 22b oder Derivate 22c von zugegebenen Molekülen 22a zu erzeugen. Die erzeugten Moleküle können dann übertragen werden. Figur 10a zeigt eine schematische Zeichnung der Kombinationskopie (unter Erhalt des originalen ersten Speichers). In den bevorzugten Prozessführungen werden zuerst Amplifikate 20a erzeugt, die dann wahlweise direkt übertragen oder derivatisiert 18 und dann übertragen werden. Figur 10b zeigt eine schematische Zeichnung der Kombinationskopie (unter Aufbrauchen der originalen Probemoleküle). Es können aber auch zunächst Derivate 18 erzeugt werden, die dann ampliflziert 21b und übertragen werden.
Figur 11 zeigt eine schematische Zeichnung der Mehr-Molekül-Kopie. Durch eine geeignete Wahl der Prozessführung, werden von zwei Sorten Molekülen 11 des Originals 40 eine Kopie mit mind. zwei Sorten davon abgeleiteter Moleküle z.B. direkte Amplifikate 20a, Derivate 18, derivatisierte Amplifikate 18 oder amplifizierte Derivate 21b erzeugt.
Figur 12 zeigt den schematischen Ablauf der Flüssigkeitskopie. Durch Zugabe von umsetzbaren Molekülen 22a direkt auf das Original, entstehen Derivate 22c oder Amplifikate 22b dieser zugegebenen Moleküle. Im Gegensatz zu vorherigen Ausführungsformen verbleiben die erzeugten Derivate bzw. Amplifikate in der Lösung und werden nicht auf eine Kopie übertragen. Diese Ausführungsform weist dann die erzeugten Amplifikate bzw.
Derivate in Lösung nach (hier dargestellt als Grauton).
Figur 13 zeigt den schematischen Ablauf der Ribsome-Kopie. Zunächst wird das Ribosome- Display nach dem Stand der Technik durchgeführt. Die RNA (30) wird mit Ribosomen 31 zusammengebracht, diese erzeugen die entsprechenden Proteine 32. Dann wird das gewünschte Target 33 hinzugegeben und die Ribosomen selektiert, deren angehängtes Protein, das Target gebunden hat. Diese Selektion erlaubt eine Anreicherung von Ribosomen bzw. RNA, welche mit einem interagierenden Protein gekoppelt sind. Diese RNA 30a, die ein bindendes Protein codiert, kann dann als in ein Original, entsprechend 2.1.1 , eingebracht werden, so dass ein RNA-Original 34 bzw. ein DNA-Original 35 erzeugt wird. Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein DNA-Original, in welchem die DNA amplifiziert ist 36. Es erfolgen Mikroarray-Kopien mit denen DNA; RNA und Protein erzeugt wird. Die DNA- Kopie 37 oder das Original selbst kann sequenziert werden, wodurch man die
Sequenzinformation erhält, die RNA-Kopie 38 nochmals mit Ribosomen verwendet werden und die Protein-Kopie 39 nochmals auf Bindung gegen das Target getestet werden. Dies alles bestätigt nochmals die Bindung gegen das Target und dient zur Aufklärung der Sequenz. Figur 14 zeigt den schematischen Ablauf der Phagen-Kopie. Zunächst wird das Pagen- Display nach dem Stand der Technik durchgeführt. Die Phagen 40 tragen Proteine 41, die mit der DNA 42 in ihrem Inneren korreliert. Durch Anbinden an ein Target 33, kann über gezielte Selektion jene Phagen 40a angereichert werden, die ein Protein tragen welches an das Target bindet. Die DNA 42a welche ein bindendes Protein codiert, kann dann in ein Original eingebracht werden und wird vorzugsweise aus DNA 34 oder amplifizierter DNA 35 besteht. Es ist aber auch ein RNA-Original denkbar 36. Es erfolgen Mikroarray-Kopien in Form von DNA, RNA und Protein. Die DNA-Kopie 37 oder das Original selbst kann sequenziert werden, wodurch man die Sequenzinformation erhält. Die RNA-Kopie 38 kann für ein Ribosome-Display eingesetzt werden und die Protein-Kopie 39 kann nochmals auf Bindung gegen das Target getestet werden, um somit die Interaktion mit dem Target zu validieren.
Figur 15 zeigt die Synthese und Anwendung der Kombinatorischen-Chemie-Kopie. Bereits während der Synthese (entsprechend Figur 1) wird in jedem Schritt in dem ein chemischer Baustein eingebaut wird parallel eine DNA (oder wahlweise eine RNA) hinzugefügt. Jeder Partikel 4 trägt neben den Molekülen 11 somit auch DNA 52. Aufgrund der Synthesestrategie kann aus der Sequenz der DNA in eindeutiger Weise zurückgeschlossen werden, in welchem der„Splits" sich der Partikel jeweils befunden hat. Nun werden die Partikel der Bibliothek auf Bindung gegen ein Target 33 untersucht und Partikel mit bindenden Molekülen 51a
angereichert. Die erhaltenen bindenden Partikel 50a werden in ein Original eingefugt. In einer bevorzugten Ausf hrungsform handelt es sich dabei um einen Partikelspeicher 10a. Mittels des Partikelspeichers lassen sich nun sowohl DNA-Kopien 37, als auch Molekül-Kopien durch Derivatisierung 56 oder Amplifikation 57 erzeugen. Anhand der DNA-Kopie werden die Sequenz und damit die chemische Struktur der Moleküle auf der Molekülkopie ermittelt. Mit den Molekül-Kopien kann nochmals eine Bindungsmessung gegen das Target
durchgeführt werden.
Bezugszeichenliste
4 Partikel
5 Ausgangspool von Probemolekülen
6 Selektion
7 Ausgewählte Probemoleküle
8 erster Speicher
9a Transferspeicher I
9b Transferspeicher II
9c Transferspeicher III
10a Partikelspeicher mit planarer Oberfläche
10b Partikelspeicher mit strukturierter Oberfläche, wobei Partikel sich in der Struktur befinden
10c Partikelspeicher mit strukturierter Oberfläche, wobei Partikel sich zwischen den Strukturen befinden lOd) Partikelspeicher mit strukturierter Oberfläche, wobei Partikel sich auf der Struktur befinden
11 einzelne Probemoleküle
12a Partikel-Transferspeicher mit planarer Oberfläche
12b Partikel-Transferspeicher mit strukturierter Oberfläche, wobei Partikel sich in der Struktur befinden
12c Partikel-Transferspeicher mit strukturierter Oberfläche, wobei Partikel sich zwischen den Strukturen befinden
12d Partikel-Transferspeicher drei mit strukturierter Oberfläche, wobei Partikel sich auf der Struktur befinden a Molekülspeicher mit planarer Oberfläche b Molekülspeicher mit strukturierter Oberfläche, wobei Probemoleküle sich in der Struktur befinden c Molekülspeicher mit strukturierter Oberfläche, wobei Probemoleküle sich auf der Struktur befinden a Molekülspeicher mit planarer Oberfläche und Flüssigkeit b Molekülspeicher mit strukturierter Oberfläche und Flüssigkeit, wobei Probemoleküle sich in der Struktur befinden c Molekülspeicher mit strukturierter Oberfläche und Flüssigkeit, wobei Probemoleküle sich auf der Struktur befinden a Molekülspeicher mit planarer Oberfläche nach Amplifikation b Molekülspeicher mit strukturierter Oberfläche und Flüssigkeit, wobei Probemoleküle sich in der Struktur befinden, nach Amplifikation c Molekülspeicher mit strukturierter Oberfläche und Flüssigkeit, wobei Probemoleküle sich auf der Struktur befinden, nach Amplifikation a Molekülspeicher mit planarer Oberfläche nach Derivatisierung b Molekülspeicher mit strukturierter Oberfläche und Flüssigkeit, wobei Probemoleküle sich in der Struktur befinden, nach Derivatisierung c Molekülspeicher mit strukturierter Oberfläche und Flüssigkeit, wobei Probemoleküle sich auf der Struktur befinden, nach Derivatisierung Bindungsbereich auf der Oberfläche Derivate a Eigenschaftsspeicher I mit Kavitäten b Eigenschaftsspeicher II mit Kavitäten Eigenschaftsspeicher mit unterschiedlichen Materialien a Amplifikate
Eigenschaftsspeicher mit unterschiedlichen Oberflächenbeschichtungenb Amplifikat eines Derivats
Eigenschaftsspeicher mit integrierter Mikrofluidik
a zusätzlich zugegebene Moleküle
b Amplifikate von zusätzlich zugegebenen Molekülen
c Derivate von zusätzlich zugegebenen Molekülen
Eigenschaftsspeicher mit integrierter Mikroelektronik
Befüllungsvorgang
Partikel, die die chemische oder physische Umgebung verändern Moleküle, die die chemische oder physische Umgebung verändern RNA
a RNA, die ein bindendes Protein codiert
Ribosom
erzeugtes Protein
Target
erster Speicher mit RNA
erster Speicher mit DNA
erster Speicher mit bereits amplifizierter DNA
Transferspeicher mit DNA-Kopie
Transferspeicher mit RNA-Kopie
Transferspeicher mit Protein-Kopie Phagen
a Phagen die 41 tragen
Protein das mit DNA im Inneren der Phagen korrelieren DNA im Inneren der Phagen
a DNA die 41 codiert
a Partikel mit 51a
a Target-bindendes Molekül
zusätzliche DNA auf Partikeln
Transferspeicher mit Derivaten
Transferspeicher mit Amplifikaten

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Analyse von molekularen Eigenschaften und/oder
Reaktionsbedingungen, umfassend die folgenden Schritte a) Bereitstellung eines ersten Speichers, umfassend eine erste Oberfläche, wobei eine Auswahl von Probemolekülen an die Oberfläche in einer definierten Anordnung direkt oder indirekt gebunden wird, b) Herstellung von mindestens zwei Transferspeichern, wobei mindestens zwei weitere Oberflächen bereitgestellt werden, und ein Reaktionsschritt erfolgt, ausgewählt aus der Gruppe Übertragungsreaktion, Amplifikationsreaktion und/oder Derivatisierungsreaktion, wodurch
Produktmoleküle entstehen können und diese Produktmoleküle und/oder die Probemoleküle an die Oberflächen binden, wobei eine ein-eindeutige räumliche Zuordnung zwischen den Probemolekülen des ersten Speichers und den Produktmolekülen und/oder Probemolekülen der Transferspeicher besteht, c) Analyseschritt, umfassend das Analysieren des ersten Speichers, der
Transferspeicher, der Probemoleküle, der Produktmoleküle, der Übertragungsreaktion, Amplifikationsreaktion und/oder
Derivatisierungsreaktion.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei
die Auswahl von Probemolekülen aus einem Pool von Probemolekülen selektiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Auswahl von Probemolekülen durch Mutationen und/oder Permutationen von einem Ausgangsmolekül hergestellt wird. Verfahren nach mindesten einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
die Probemoleküle an Partikel gebunden sind.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
unterschiedliche Sorten von Probemolekülen an einen Partikel gebunden sind.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Oberfläche des ersten Speichers und/oder der Transferspeicher strukturiert ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Probemoleküle und/oder Produktmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Proteine, Enzyme, Aptamere, Antikörper oder Teile davon, Rezeptoren oder Teile davon, Liganden oder Teile davon, Nukleinsäuren, nukleinsäureartige Derivate, Transkriptionsfaktoren und/oder Teile davon, Moleküle die mit
kombinatorischer Chemie erzeugt wurden.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der Reaktionsschritt mittels DNA- Polymerase, RNA - Polymerase und/oder eines zellfreien Reaktionsmixes durchgeführt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Strukturierung der Oberflächen ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend
Kavitäten, Erhebungen, Kavitäten die Partikel enthalten und/oder Erhebungen die Partikel umfassen.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der erste Speicher in unterschiedlichen Bereichen unterschiedliche physikalische, chemische und/oder biochemische Eigenschaften umfasst, bevorzugt unterschiedliches Volumen der Kavitäten, pH-Unterschiede, Unterschiede im Salzgehalt,
Temperaturunterscheide, unterschiedliche Oberflächen, unterschiedliche
Benetzbarkeit, Unterschiede in der elektrischen Ladung, Unterschiede in elektrischen, magnetischen und/oder dielektrischen Eigenschaften, Unterschiede bezüglich osmotischer Drücke, unterschiedliche Zusatzstoffe, unterschiedliche biochemische Inhaltsstoffe.
1. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei während des Reaktionsschrittes mindestens eine Sorte von Probemolekülen von den Partikeln und/oder der Oberfläche gelöst werden
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der Analyseschritt ein labelfreies Verfahren umfasst, bevorzugt eine RlfS-Detektion, iRIfS -Detektion, Biacore-Detektion, Surface-Plasom-Resonanz -Detektion,
Ellipsometire, Massenspektroskopie, Detektion des Massezuwachs, Detektion der Änderung des Brechungsindex, Detektion der Änderung von optischen, magnetischen, elektrischen und/oder elektromagnetischen Eigenschaften.
13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der Analyseschritt ein Verfahren umfasst, das ein Label verwendet, bevorzugt Fluoreszenzmessung, Detektion über einen absorbierenden und/oder streuenden Farbstoff, Massenspektroskopie über die Detektion eines Isotopenlabels, Detektion über ein Molekül, welches den Brechungsindex und/oder die optischen Eigenschaften der Oberfläche und/oder der Lösung ändert.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der Analyseschritt ein Verfahren umfasst, das die Lösung oberhalb der Oberfläche des ersten Speichers und/oder eines der Transferspeichers analysiert, bevorzugt
Trübungsmessung, Fluoreszenzmessung, Detektion eines absorbierenden Farbstoffs und/oder Luminiszenzmessung.
Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, in einem Screeningverfahren zur Identifikation von, Transkriptionsfaktoren,
Transkriptionseffizienz, Transkriptionsoptimierung, Promotoreffizienz, Splicosomen, Restriktions-Substraten, Ampflifikationssystem, Codon-Optimierung,
Proteinfunktionalität, Enzymfunktionalität, Enzymoptimierung, Isoenzymen,
Ribozymen, Reaktionsoptimierungen und/oder Bindungsoptimierung
Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14 in einem Screeningverfahren zur Identifikation von Antibiotika, Inhibitoren von Antibiotika, Antikörperoptimierung, Antikörperstabilisierung, Antikörperisolierungen, Epitopen für Autoimmunerkrankungen, Epitopen für Allergien, Epitopen für Allergene, Epitopen für Impfungen, Wirkstoffe, Wechselwirkungspartner für Wirkstoffe, Optimierungen für Wirkstoffe, Wachstumsfaktoren, Substituenten für Wachstumsfaktoren, Optimierung von Wachstumsfaktoren und/oder
Virusangriffspunkten.
Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14 in einem Screeningverfahren zur Identifikation von Molekülstabilität, bevorzugt von DNAsen, RNAsen, Proteinen, Kinasen und/oder Phosphatasen.
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